存活蛋白表达的调节的制作方法

专利名称：存活蛋白表达的调节的制作方法
技术领域：
本发明提供了调节存活蛋白表达的组合物和方法。特别地，本发明涉及与编码人存活蛋白的核酸特异杂交的反义化合物，特别是双链寡核苷酸。已证实这些寡核苷酸可调节存活蛋白的表达。
背景技术：
癌性细胞的特征性特点是失控性增殖。已经发现的肿瘤和正常细胞间的差异之一是对程序性细胞死亡，也称作凋亡的过程的抗性(Ambrosini等人，Nat.Med.，1997，3，917-921)。凋亡是多细胞生物已经演化了的用以阻止失控性细胞增殖和消灭那些呈病态、有害的或不再需要的细胞的过程。凋亡过程涉及多步骤级联，在该级联中通过蛋白水解酶和DNA内切核酸酶的协调性作用从内部降解细胞，导致随后由清除细胞去除的凋亡小体形成。迄今研究已经证明大部分细胞内降解通过胱天蛋白酶的作用进行，胱天蛋白酶是切割邻近天冬氨酸残基的蛋白水解酶家族(Cohen，Biochemistry Journal，1997，326，1-16)。
发现大多数肿瘤细胞对凋亡过程表现抗性导致这样的观点，即以降低肿瘤细胞对凋亡的抗性为目标的治疗策略代表阻止瘤细胞扩散的新型手段(Ambrosini等人，Nat.Med.，1997，3，917-921)。据认为肿瘤细胞获得对凋亡抗性的机制之一是过量表达存活蛋白，其是IAP(凋亡抑制物)胱天蛋白酶抑制物家族的一个新近描述的成员。迄今，在肺肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、胃肿瘤、非霍奇金淋巴瘤和成神经细胞瘤中已经检测到存活蛋白的过量表达(Adida等人，Lancet，1998，351，882-883；Ambrosini等人，Nat.Med.，1997，3，917-921；Lu等人，Cancer Res.1998，58，1808-1812)。已经在成神经细胞瘤中进行了更为详细的分析，其中发现存活蛋白的过量表达同已知与不良预后相关的肿瘤组织学是相互分开的(Adida等人，Lancet，1998，351，882-883)。最后，Ambrosini等人描述了用包含编码效应细胞蛋白酶受体1(EPR-1)的人cDNA 708核苷酸片段的表达载体转染HeLa细胞，所述受体的编码序列与存活蛋白的编码链互补(Ambrosini等人，J.Bio.Chem.，1998，273，11177-11182)。该构建体引起细胞活力的下降。
最近发现存活蛋白在细胞周期调节中发挥作用。已发现该蛋白在细胞周期的G2/M期中以受周期调节的方式表达，并与有丝分裂纺锤体的微管结合。在有丝分裂期间，破坏这种相互作用导致存活蛋白抗凋亡功能的丧失并且增强了有丝分裂期间胱天蛋白酶3的活性。胱天蛋白酶3与凋亡性细胞死亡相关。因此认为存活蛋白可抵消G2/M期中对凋亡的默认诱导。因此认为在癌中过量表达存活蛋白可能克服这个凋亡检查点，听任不受欢迎的癌细胞幸存和分裂。发现上述Ambrosini所描述的存活蛋白反义构建体可下调Hela细胞中内源性存活蛋白同时提高G2/M期细胞的胱天蛋白酶3依赖性凋亡，Li等人，Nature，1998，396，580-584。
在许多物种中，导入双链RNA(dsRNA)诱导强烈而特异性的基因沉默。这种现象在植物和动物中均存在，并且在病毒防御和转座子沉默机制中发挥作用(Jorgensen等人，Plant Mol.Biol.，1996，31，957-973；Napoli等人，Plant Cell，1990，2，279-289)。
dsRNA能导致动物中基因沉默的第一份证据来自在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的工作成果，其中已经证明饲喂、浸浴或注射dsRNA(有义链和反义链的混合物)得到了比单独注射有义链或反义链时效率高得多的沉默(Guo和Kemphues，Cell，1995，81，611-620；Fire等人，Nature 391806-811(1998)；Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9515502-15507(1998)；PCT国际公开WO99/32619；(Fire等人，Nature，1998，391，806-810；Timmons等人，Gene，2001，263，103-112；Timmons和Fire，Nature，1998，395，854)。从那以后，已在多种生物中证实了这种现象，所述生物包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(Kennerdell等人，Cell 951017-1026(1998))；和胚胎小鼠(Wianny等人，Nat.Cell Biol.270-75(2000))。
已将这种转录后基因沉默现象称为“RNA干扰(RNAi)”，并且该现象已开始泛指涉及dsRNA的基因沉默过程，该过程通过降解靶mRNA导致基因表达的序列特异性降低(Tuschl等人，Genes Dev.，1999，13，3191-3197)。
已证实具有3’突出端的21个和22个核苷酸的dsRNA片段是RNAi的经典序列特异性中介体。这些叫做短干扰性RNA(siRNA)的片段由较长dsRNA通过类RNA酶III加工反应生成。经化学合成的siRNA也能在位于接近siRNA引导链覆盖区域的中心的切割位点介导高效靶RNA切割(Elbashir等人，Nature，2001，411，494-498)。已经在包括人胚胎肾(293)和HeLa细胞的几个哺乳动物细胞系中研究了由21-23个核苷酸的siRNA引起内源性和异源性基因表达抑制的表征(Elbashir等人，Genesand Development，2001，15，188-200)。
近来，已证实反义极性的单链RNA寡聚体(ssRNAi或asRNA)是基因沉默的强烈诱导物，并且单链寡聚体是RNAi现象的最终原因(Tiisterman等人，Science，2002，295，694-697)。
此处每一个引用作为参考的美国专利5,898,031和6,107,094描述了某些具有类RNA性质的寡核苷酸。当与RNA杂交时，这些寡核苷酸作为dsRNA酶底物并因此导致酶对RNA的切割(Crooke，2000；Crooke，1999)。
作为对调亡以及认为存活蛋白表达对种类繁多的肿瘤细胞类型提供生长优势中所发挥作用的理解的发展结果，迫切需要提供可调节存活蛋白表达的组合物。迫切需要提供在动物中诊断和检测编码存活蛋白的核酸的方法。也需要提供诊断和治疗源于存活蛋白表达的疾病的方法。而且，需要检测和研究编码存活蛋白的核酸的改进了的研究试剂盒和试剂。因此，本发明提供一类新型存活蛋白抑制物、包含这些化合物的组合物和使用这些化合物的方法。
发明简述本发明涉及寡聚化合物，特别是单链和双链反义化合物，这些化合物靶向编码存活蛋白的核酸并且调节存活蛋白的表达。在某些实施方案中，反义化合物为寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸是RNAi寡核苷酸(其主要为RNA或类RNA)。在其它实施方案中，寡核苷酸为RNA酶H寡核苷酸(其主要为DNA或类DNA)。在另外的实施方案中，寡核苷酸可经化学修饰。也提供包含本发明的反义化合物的药物组合物和其它组合物。进一步提供调节细胞或组织中存活蛋白表达的方法，该方法包括将所述细胞或组织与一种或多种本发明的反义化合物或组合物接触。进一步通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的寡核苷酸或组合物，对患有或者倾向于患有与存活蛋白表达相关的疾病或病症的动物，特别是人提供治疗的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的化合物在制造用于治疗此处所公开的任何和全部疾病的药物的用途。
疾病或病症可能为增殖过度性疾病。在一个实施方案中，增殖过度性疾病为癌。
本发明的寡聚化合物是存活蛋白表达或过量表达的抑制物。因为这些化合物抑制了存活蛋白表达或过量表达的效果，所以这些化合物对与存活蛋白活性相关的紊乱的治疗有用。因此，本发明的化合物是抗肿瘤剂。
认为本化合物对治疗癌有用，所述癌为例如中枢神经系统肿瘤多形性成胶质细胞瘤、星细胞瘤、少突胶质细胞肿瘤、室管膜和脉络丛肿瘤、松果体肿瘤、神经元肿瘤、成神经管细胞瘤、施旺细胞瘤、脑膜瘤、脑膜性肉瘤；眼肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、横纹肌肉瘤、成视网膜细胞瘤；内分泌腺肿瘤垂体肿瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺皮质肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠胰内分泌系统肿瘤、生殖腺肿瘤；头和颈肿瘤头颈癌、口腔、咽、喉、生牙性肿瘤；胸部肿瘤大细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胸腔肿瘤、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸原发生殖细胞肿瘤；消化道肿瘤食道肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、外分泌胰腺肿瘤、小肠肿瘤、不同型阑尾和腹膜肿瘤、结肠和直肠腺瘤、肛门肿瘤；泌尿生殖道肿瘤肾细胞癌、肾盂和输尿管肿瘤、膀胱肿瘤、尿道肿瘤、前列腺肿瘤、阴茎肿瘤、睾丸肿瘤；女性生殖器官肿瘤外阴和阴道肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫本体腺癌、卵巢癌、妇科学肉瘤、乳腺肿瘤；皮肤肿瘤基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞肿瘤、恶性黑素瘤；骨和软组织肿瘤成骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层瘤、血管肉瘤；造血系统肿瘤骨髓增生异常综合征、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、HTLV-1和T细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、肥大细胞白血病；和儿童肿瘤急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、成神经细胞瘤、骨肿瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤、肾肿瘤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗敏感肿瘤的方法，该方法包括对动物，尤其人施用针对存活蛋白的有效量的单链(ssRNA或ssRNAi或asRNA)或双链(dsRNA或siRNA)寡核苷酸。ssRNA或dsRNA寡核苷酸可经修饰或未经修饰。也即，本发明提供靶向存活蛋白的双链RNA寡核苷酸，或其药物组合物，用于治疗敏感肿瘤。
另一方面，本发明提供经分离的双链RNA寡核苷酸的化合物在制造抑制存活蛋白表达或过量表达的药物中的用途。因此，本发明提靶向存活蛋白的经分离的双链RNA寡核苷酸在制造由上述方法治疗敏感肿瘤的药物中的用途。
本发明的化合物尤其对胰癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、卵巢癌、肾癌、成胶质细胞瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗有用。
本发明的另一个实施方案是治疗患有以凋亡减少为特征的疾病或病症的动物，尤其是人的方法，该方法包括对患者施用靶向编码人存活蛋白核酸分子、长度为8-80个核碱基的反义化合物的治疗有效量，从而抑制存活蛋白的表达。
本发明还提供调节细胞中凋亡的方法，该方法包括以靶向编码人存活蛋白的核酸分子、长度为8-80个核碱基的反义化合物接触细胞从而调节凋亡。
本发明的另一个实施方案是调节细胞中胞质分裂的方法，该方法包括以靶向编码人存活蛋白核酸分子、长度为8-80个核碱基的反义化合物接触细胞从而调节胞质分裂。
本发明还提供调节细胞中细胞周期的方法，该方法包括将靶向编码人存活蛋白核酸分子、长度为8-80个核碱基的反义化合物接触细胞从而调节细胞周期。
在发明的再一个实施方案中，提供抑制细胞增殖的方法，该方法包括将靶向编码人存活蛋白核酸分子、长度为8-80个核碱基的反义化合物的有效量接触细胞，从而抑制细胞增殖。在一个实施方案中，细胞为癌细胞。该方法进一步包括向患者施用化学治疗剂。
在发明的另一个实施方案中，提供调节过多增殖的细胞凋亡的方法，该方法包括以有效量的靶向编码人存活蛋白核酸分子、长度为8-80个核碱基的反义化合物接触细胞，从而调节细胞的凋亡。在一个实施方案中，细胞为过多增殖的细胞并且用反义化合物增强凋亡。在另一个实施方案中，凋亡的调节对凋亡性刺激敏感。在一个实施方案中，调亡性刺激是细胞毒性化学治疗剂。该方法可进一步包括以化学治疗剂接触细胞。
发明详述本发明运用双链和单链寡聚反义化合物，特别是为RNA或类RNA的单链或双链寡核苷酸和为DNA或类DNA的单链寡核苷酸，用于调节编码存活蛋白的核酸分子的功能，最终调节所产生的存活蛋白的量。这通过提供与一种或多种编码存活蛋白的核酸特异杂交的反义化合物而实现。如此处所用，术语“靶核酸”和“编码存活蛋白的核酸”包括编码存活蛋白的DNA、转录自该DNA的RNA(包括前mRNA和mRNA或其部分)，并且也包括源于该RNA的cDNA。寡聚化合物与互补的有义方向的靶核酸的特异杂交干扰了靶核酸的正常功能。这种与靶核酸特异杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常称为“反义”，同时这种化合物可描述为处于相对于靶标的“反义方向”。
欲干扰的DNA的功能包括复制和转录。欲干扰的RNA功能包括，例如RNA至蛋白翻译位点的转运、由RNA至蛋白质的翻译、产生一种或多种mRNA的RNA剪接，以及RNA参与或协助的催化活性。这种干扰靶核酸功能的总体效果是在RNA和/或蛋白质水平调节存活蛋白的表达。在本发明的上下文中，“调节”意为表达的提高(刺激)或降低(抑制)。在本发明上下文中，抑制是基因表达调节的所希望的形式，并且RNA以及在某些实施方案中mRNA是合适的靶标。
反义靶向特定核酸是合适的。在本发明的上下文中，将反义化合物“靶向”特定核酸是多步骤过程。该过程通常始于鉴定将调节其功能的核酸序列。这个核酸可能是，例如细胞的基因(或自该基因转录的mRNA)，其表达与特定的紊乱或疾病状态相关，或为源于感染物的核酸分子。在本发明中，靶标是编码存活蛋白的核酸分子。靶向过程也包括在这个基因中确定一个位点或多个位点以便发生反义相互作用，这样将导致所希望的效应，例如，mRNA和/或蛋白质表达的检测或调节。在本发明的上下文中，一个基因内位点是包含基因可读框(ORF)翻译起始或终止密码子的区域。如本领域公知，翻译起始密码子一般为5′AUG(在已转录的mRNA分子中；相应DNA分子中的5’ATG)，因此翻译起始密码子也称作“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有带有RNA序列的5’GUG、5’UUG和5’CUG的翻译起始密码子，而已证实翻译起始密码子5’AUA、5’ACG和5’CUG可在体内发挥作用。因此，即便在每种情况中起始氨基酸一般地为甲硫氨酸(真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(原核生物中)，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可包含众多密码子序列。本领域还公知真核和原核基因可具有两种或两种以上的备选起始密码子，其中任何一种可在特定细胞类型或组织，或在一组特定条件下优先地用于翻译起始。在本发明的上下文中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指用于体内(in vivo)启动编码存活蛋白的基因所转录mRNA分子的翻译的一种或多种密码子，而不考虑这种密码子的序列。
同样为本领域公知，基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有三种序列之一，即，5′-UAA、5′-UAG或5′-UGA(对应的DNA序列分别为5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)。术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”指mRNA或基因一部分，该部分包含在翻译起始密码子的任一方向(即5’或3’)上约25至约50个连续核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指mRNA或基因的一部分，该部分包含从翻译终止密码子的任一方向(即5’或3’)上约25至约50个连续的核苷酸。
可读框(ORF)或“编码区”在本领域公知指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可有效地靶向的区域。其他的靶区域包括5′非翻译区(5′UTR)，该区域在本领域公知指从翻译起始密码子5’方向上mRNA的一部分，并且因此包括mRNA的5’帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因中的对应核苷酸，和3′非翻译区(3′UTR)，该区域在本领域公知指从翻译终止密码子3’方向上mRNA的一部分，并且因此包括mRNA的翻译终止密码子和3’端之间的核苷酸或基因中的对应核苷酸。mRNA的5’帽包含通过5’-5’三磷酸酯键与mRNA的5’最末端残基结合的N7甲基化鸟苷残基。认为mRNA的5’帽区域包括5’帽结构本身以及相邻该帽的前50个核苷酸。5’帽区域也可是有效的靶区域。
虽然可将某些真核mRNA转录物直接翻译，但是许多真核转录物包含一个或多个称作“内含子”的区域，这些区域在转录物翻译之前从转录物切除。将剩余(并且因此为翻译的)区域称作“外显子”并且外显子经剪接在一起形成连续mRNA序列。mRNA剪接位点，即内含子-外显子接点也可以是靶区域，并且在异常剪接与疾病有关，或特定mRNA剪接产物的过量产生与疾病有关的情况中特别有用。
一旦鉴定了一个或多个靶位点，即可选择反义寡聚化合物，通常为反义寡核苷酸，所述反义寡聚化合物与靶标足够互补，即足够好的杂交并具有足够的特异性，以产生所希望的效果。
在本发明的上下文中，“杂交”意为氢键，其可为在互补的核苷或核苷酸碱基之间Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键形成配对的互补核碱基。如此处所用，“互补”指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在寡核苷酸某个位置的核苷酸能与DNA或RNA分子的相同位置的核苷酸形成氢键，那么认为所述寡核苷酸和该DNA或RNA在那个位置彼此互补。当每个分子中足够数目的对应位置为彼此成氢键的核苷酸占据时，该核苷酸与该DNA或RNA彼此互补。因此，“可特异杂交的”和“互补的”是用来表示互补或精确配对至足够的程度以至于寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定和特异结合的术语。本领域理解，反义化合物的序列无需与可特异杂交的靶核酸序列100％互补。当反义化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰了靶DNA或RNA的正常功能，导致完全或部分功能丧失，并且在希望特异结合的条件下，即在治疗性处理中的生理条件，或实施体外或体内测定的条件下，具有足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶序列结合时，反义化合物为可特异杂交的。而且，寡核苷酸可与一个或多个片段杂交，从而检查片段之间或邻近片段(例如，环结构、错配或发夹结构)不参与杂交事件。本发明的化合物包含与这些化合物靶向的靶核酸序列的靶区域的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或至少100％的序列互补性。例如，如果反义化合物的20个核碱基中的18个与靶区域互补并且因此将特异杂交，那么该反义化合物代表90％的互补性。在这个实例中，其余非互补的核碱基将聚集或散布在互补的核碱基内，并且彼此间或与互补的核碱基间无需连续。同样地，如果一种反义化合物长度为18个核碱基，具有4(四)个非互补核碱基，该非互补核碱基的两侧有与靶核酸完全互补的两个区域，那么该反义化合物将与靶核酸具有77.8％的总体互补性，并且将因此落入本发明的范围。
反义化合物与靶核酸区域的互补百分率可常规地用本领域公知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和Power BALST程序确定(Altschul等人，J Mol.Biol.，1990，215，403-410；Zhang和Madden，Gnome Res.，1997，7，649-656)。可通过例如，Gap程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Unix版本8，Genetics Computer Group，University ResearchPark，Madison WI)使用默认设置确定同源百分率、序列同一性或互补性，该程序采用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。在一些实施方案中，反义化合物和靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为约50％至60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60％至约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％至约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约80％至约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
通常将反义化合物用作研究试剂和诊断试剂。例如，本领域技术人员经常使用能够以极强特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸阐明特定基因的功能。也使用反义化合物，例如，区分生物学途径的多种成员之间的功能。因此反义调节已经用于研究用途。
存在多种机制，通过这些机制可以用合成的短寡核苷酸调节哺乳动物细胞中基因表达。通常使用的反义机制是靶定RNA的依赖RNA酶H的降解。RNA酶H是广泛表达的内切核酸酶，其识别反义DNA-RNA异源双链体，水解RNA链。另一反义机制涉及使用催化切割RNA-RNA双链体的酶。这些反应由一类RNA酶催化，所述RNA酶包括但是不限于RNA酶III和RNA酶L。已知为RNA干扰(RNAi)的反义机制作用于RNA-RNA杂合体等等。
基于RNA酶H的反义(通常使用单链化合物)和RNA干扰(通常使用称作siRNA的双链化合物)均为反义机制，一般导致靶RNA功能的丧失。
就效力、最大效果、特异性和作用的持续时间而言，经优化的siRNA和依赖RNA酶H的寡聚化合物表现相似。而且，已经证实通常dsRNA构建体的活性与靶向同一个位点的依赖RNA酶H的单链反义化合物的活性相关。一个主要例外是依赖RNA酶H的反义化合物通常对前mRNA中的靶位点有活性，而siRNA对这些位点无活性。
这些数据表明，通常，在靶RNA上对依赖RNA酶H的寡核苷酸无活性的位点类似地对siRNA也非好的位点。反之，发现了活性RNA酶H寡核苷酸和siRNA之间显著程度的相关性，提示若位点可用于与RNA酶H的寡核苷酸杂交，则该位点同样可用于siRNA复合体的杂交和切割可获得。因此，一旦已经通过两种反义方法之一确定合适的靶位点，即可使用这些位点设计备选反义机制发挥作用的构建体(Vickers等人，2003，J.Biol.Chem.278，7108)。而且，一旦证实某位点对RNAi或RNA酶H寡核苷酸为活性，即可设计单链RNAi寡核苷酸(ssRNA或asRNA)。
在本发明的一些实施方案中，双链反义寡核苷酸是合适的。这些双链反义寡核苷酸可能是RNA或类RNA，并且可经修饰或未经修饰，因为所述寡核苷酸，若以经修饰，则保留形成RNARNA杂合体并且募集和(激活)dsRNA酶的性质。在其他实施方案中，单链寡核苷酸(ssRNAi或asRNA)可为类RNA。
在本发明的其他实施方案中，单链反义寡核苷酸是合适的。在一些实施方案中，单链寡核苷酸可为“类DNA”，因为寡核苷酸具有充分表征的结构特征，例如，许多未经修饰的2’Hs或稳定化的主链，例如硫代磷酸酯，该主链在结构上适合与靶寡核苷酸相互作用和募集和(激活)RNA酶H。
寡核苷酸是反义化合物的一种形式，而本发明涵盖其它寡聚反义化合物，包括但不限于如下描述的寡核苷酸模拟物。根据本发明的化合物可包含约8至约80个核碱基。在另一个实施方案中，寡核苷酸长度为约10至50个核苷酸。在再一个实施方案中，寡核苷酸长度为12至30个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸长度为12至24个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸长度为19至23个核苷酸。一些实施方案包含抑制存活蛋白表达的寡聚化合物序列的至少8个核碱基部分。针对存活蛋白的dsRNA或siRNA分子，及它们在抑制存活蛋白mRNA表达中的用途也是本发明范围内的实施方案。
本发明的寡核苷酸也包括变体，该变体中在寡核苷酸的一个或多个核苷酸位置存在不同碱基例如，假设第一个碱基是腺苷，可以产生在此位置上含有胸腺嘧啶核苷(或若是RNA，则为尿苷)、尿苷或胞苷的变体。这可以在寡核苷酸的任意位置进行。因此，一个20聚体可包含60种变体(20个位置×每个位置3种选择)，在变体中所选择的三种备选核苷酸的任何一种均可替代原始核苷酸。然后用此处所述方法测试了这些寡核苷酸以测定它们抑制存活蛋白mRNA表达的能力。
寡聚化合物在本发明的上下文中，术语“寡聚化合物”指能与核酸分子的区域杂交的聚合结构。该术语包括寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物和这些物质的嵌合组合。寡聚化合物通常可线性地制备但是可连接或亦可制备呈环状，并且也可包含分支。寡聚化合物可包含诸如双链构建体，例如，经杂交以形成双链化合物的两条链，或具有足够自身互补性以容许杂交并且形成部分或完全双链化合物的单链。在本发明一个实施方案中，双链反义化合物包括短干扰RNA(siRNA)。如此处所用，将术语“siRNA”定义为一种双链化合物，该化合物具有第一和第二链，并且包含所述第一链和第二链之间的中央互补部分和所述第一链和第二链之间或靶mRNA任选互补的末端部分。每条链长度可为约8至约80个核碱基，长度可为10至50个核碱基，长度可为12至30个核碱基，长度可为12至24个核碱基或长度可为19至23个核碱基。中央互补部分长度可为约8至约80个核碱基，长度可为10至50个核碱基，长度可为12至30个核碱基，长度可为12至24个核碱基或长度可为19至23个核碱基。末端部分长度可为1至6个核碱基。siRNA也可无末端部分。siRNA的两条链可内部连接，留下自由3’或5’末端或两条链连接形成连续的发夹结构或环。该发夹结构可在5’或3’末端包含突出端，产生延伸单链的特征。
在本发明的一个实施方案中，双链反义化合物是规范siRNA，如此处所用，将术语“规范siRNA”定义为一种双链寡聚化合物，该寡聚化合物具有第一和第二链，每条链长度为21个核碱基，以及两条链在19个核碱基上互补，并且在每条链每个3’末端上具有在双链化合物中充当3’突出端的脱氧胸腺嘧啶核苷二聚体(dTdT)。
在另一个实施方案中，双链反义化合物为平端siRNA。如此处所用，将术语“平端siRNA”定义为无末尾突出端的siRNA。即，双链化合物的至少一个末端是平端。无论是规范的或平端siRNA均引发dsRNA酶，并且启动RNAi反义机制的募集和激活。在进一步实施方案中，设想通过RNAi反义机制作用的单链RNAi(ssRNA)化合物。
对双链化合物进行了进一步修饰，并且所述修饰可包括附着在一个末端、所选的核碱基位置、糖位置或核苷间键的缀合基团。或者，通过非核酸的部分或连接体基团将两条链连接起来。当由仅一条链形成时，dsRNA可采用自身对折以形成双链体的自身互补的发夹型分子形式。因此，dsRNA可为完全或部分的双链。当由两条链或一条采取自身对折以形成双链体的自身互补的发夹型分子形式形成时，这两条链(或单链的双链体形成区域)为按Watson-Crick方式碱基配对的互补RNA链。
通常寡聚化合物包含与连接基连接的单体亚单位主链，主链中每个连接的单体亚单位直接或间接地附着于杂环碱基部分。寡聚化合物也可包含未与杂环碱基部分连接的单体亚单位，从而提供了脱碱基位点。可以修饰组成寡聚化合物重复单位的任一个以产生多种基序，包括半体(hemimer)、缺口(gapmer)聚体和嵌合体。
本领域公知，核苷包含附着于杂环碱基部分的糖部分。两类最常见杂环碱基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是还包括共价连接于核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对那些包含了呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸酯基可连接在糖的2’、3’、5’羟基部分，产生更为常见的3’-5’核苷间键或不太常见的2’-5’核苷间键。在形成寡核苷酸时，磷酸酯基共价连接于相邻核苷的糖部分。通过杂交或通过形成共价键，各自末端可连接形成环状结构。此外，线性化合物可具有核碱基间互补性，并且因此以如此方式折叠以产生完全或部分双链的化合物。在寡核苷酸中，磷酸酯基通常指为形成核苷间键或与糖环连接共同形成寡核苷酸的主链。构成RNA和DNA主链的正常核苷间键是3’-5’磷酸二酯键。然而，通常希望开放线性结构。
在本发明上下文中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间键组成的寡核苷酸，以及具有以类似方式行使功能的一个或多个非天然存在部分的寡核苷酸类似物或经化学修饰的寡核苷酸。经如此修饰或经如此取代的寡核苷酸因其所希望的性质，例如，增强的细胞摄入、对核酸靶标的增强的亲和性和增强的核酸酶稳定性而较其天然存在形式更为适合。
在本发明上下文中，术语“寡核苷”指通过不具有磷原子的核苷间键连接的核苷序列。该类型的核苷间键包括短链烷基、环烷基、混合的杂原子烷基、混合的杂原子环烷基、一种或多种短链杂原子连接体和一种或多种短链杂环连接体。这些核苷间键包括但不限于硅氧烷、硫醚、亚砜、砜、乙酰基、甲酰基、硫代甲酰基、亚甲基甲酰基、硫代甲酰基、烯、氨基磺酸酯、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸酯、氨磺酰、酰胺及其它具有混合了N、O、S和CH2组成部分的核苷间键。
教导制备以上寡核苷的代表性美国专利包括，但不限于，U.S.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，此处每个专利引用作为参考。
进一步包含于本发明的是反义寡聚化合物，其包括反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、备选剪接子(splicer)和与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。同样地，这些反义寡聚化合物可以单链的、双链的、环状或发夹状的寡聚化合物形式导入，并且可含有结构元件，例如内部的或末端的凸起、错配或环。一般，可将核酸(包括寡核苷酸)描述为“类DNA”(即具有2’脱氧糖并且一般含有T而不是U)或“类RNA”(即具有2’羟基或2’修饰糖，一般为U而不是T)。一旦导入系统，本发明的寡聚化合物能引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现对靶核酸的修饰。
根据本发明的寡聚化合物可包含约8至约80个核碱基(即约8至约80个连接的核碱基和/或单体亚单位)。本领域普通技术人员将理解本发明体现了长度为8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79或80个核碱基的寡聚化合物。
在一个实施方案中，发明的寡聚化合物长度为10至50个核碱基。本领域普通技术人员将理解这体现了长度为12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或50个核碱基的寡聚化合物。
在另一个实施方案中，本发明的寡聚化合物长度为12至30个核碱基。本领域普通技术人员将理解这体现了长度为12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个核碱基的寡聚化合物。
在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物长度为12至24个核碱基。本领域普通技术人员将理解这体现了长度为12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24个核碱基的寡聚化合物。
在另一个实施方案中，本发明的寡聚化合物长度为19至23个核碱基。本领域普通技术人员将理解这体现了长度为19，20，21，22或23个核碱基的寡聚化合物。
寡聚化合物的一个具体长度为约12至约30个核碱基。另一个具体的长度为约12至约24个核碱基。一个特别适合的长度是约19至约23个核碱基。
嵌合寡聚化合物不必统一修饰寡聚化合物中的所有位置，并且实际上可在单个寡聚化合物中或甚至在单个单体亚单位，比如寡聚化合物的核苷中掺入不止一种前面提到的修饰。本发明还包括作为嵌合寡聚化合物的寡聚化合物。在本发明上下文中，“嵌合”寡聚化合物或“嵌合体”是寡聚化合物，该化合物包含两个或多个化学上不同的区域，每一个区域由至少一个单体单位构成，即对于基于核酸的寡聚体为核苷酸。
嵌合寡聚化合物一般包含至少一个经修饰的区域，从而赋予增强的核酸酶降解抗性、增强的细胞摄入、电荷的改变和/或对靶核酸增加的结合亲合力。寡聚化合物额外的区域可作为能切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。例如，RNA酶H是细胞的内切核酸酶，其切割RNA:DNA双链体中的RNA链。因此，激活RNA酶H导致切割RNA靶，从而大大增强抑止基因表达的效率。因此，与例如与相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸比较，当使用嵌合体时，用较短的寡聚化合物经常可获得相当的结果。可用凝胶电泳以及根据需要，本领域公知的相关核酸杂交技术常规地检测RNA靶的切割。对形成RNA:RNA杂合体并且作为dsRNA酶底物的嵌合体做了类似的观察。
本发明的嵌合寡聚化合物可形成如上所述两种或两种以上的寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。常规使用的嵌合化合物包括但不限于杂合体、半体、缺口体、倒置的缺口体和阻滞体(blockmer)，其中多种点修饰和/或区域选自天然的或经修饰的DNA和RNA型单位和/或模拟类型亚单位例如，锁定核酸(LNA)(包括如下描述的ENATM)、肽核酸、吗啉代等。在下文描述这些化合物。教导制备以上杂交结构的代表性美国专利包括，但不限于，U.S.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，每份专利此处全文引用作为参考。
寡聚体模拟物服从于本发明的另一组寡聚化合物包括寡核苷酸模拟物。应用于寡核苷酸的术语模拟物意在包括寡聚化合物，其中用新的基团替代呋喃糖环或呋喃糖环与核苷酸间键，在本领域内将仅仅呋喃糖环的替代称作为糖替代。保持杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分以便与合适的靶核酸杂交。
将这样一种寡聚化合物——已证实具有优良杂交性质的寡核苷酸模拟物称为肽核酸(PNA)。PNA具有良好的杂交性质，高生物学稳定性，并且为静电中性分子。在最近一项研究中，用PNA校正了转基因小鼠模型中的异常剪接(Sazani等人，Nat.Biotechnol.，2002，20，1228-1233)。在PNA寡聚化合物中，寡核苷酸的糖主链由含有酰胺的主链，特别是含有氨基乙基甘氨酸的主链替代。核碱基直接或间接地(如下显示的-C(＝O)-CH2-)与主链酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导制备PNA寡聚化合物的代表性美国专利包括，但不限于，U.S.5,539,082；5,714,331和5,719,262，每份专利此处引用作为参考。PNA可从Applied Biosystems(Foster City，CA，USA)商业获得。
自从在1991年由Nielsen和同事(Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500)制备PNA以来，已经对基本PNA主链进行了多种修饰。所述基本结构如下示 其中Bx是杂环碱基部分；T4为氢、氨基保护基、-C(O)R5、经取代的或未经取代的C1-C10烷基、经取代的或未经取代的C2-C10链烯基、经取代的或未经取代的C2-C10炔基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、化学官能团、报告分子基团、缀合物基、通过α羧基或任选地当氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸时，通过ω羧基连接的D-或L-α氨基酸或者源于通过羧基连接的D、L或混合的D和L氨基酸的肽，其中取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫羟、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基和炔基；T5为-OH、-N(Z1)Z2、R5、或通过α氨基或任选地当氨基酸是赖氨酸或鸟氨酸时，通过ω氨基连接的D-或L-α氨基酸或者源于通过氨基连接的D、L或混合的D和L氨基酸的肽、化学官能团、报告分子基团或缀合物基；Z1为氢、C1-C6烷基、或氨基保护基；Z2为氢、C1-C6烷基、氨基保护基、-C(＝O)-(CH2)n-J-Z3、通过α羧基或任选地当氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸时，通过ω羧基连接的D-或L-α氨基酸或者源于通过羧基连接的D、L或混合的D和L氨基酸的肽；Z3为氢、氨基保护基、-C1-C6烷基、-C(＝O)-CH3、苄基、苯甲酰基或-(CH2)n-N(H)Z1；每个J为O、S或NH；R5为羰基保护基；和n为7至约79。
另一类已经研究的寡核苷酸模拟物以具有附着于吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单位(吗啉代核酸)为基础。已经报道了众多在吗啉代核酸中连接吗啉代单体单位的连接基。已经选择了一类连接基以产生非离子寡聚化合物。以非离子吗啉代为基础的寡聚化合物不太可能与细胞蛋白发生不希望的相互作用。以吗啉代为基础的寡聚化合物是寡核苷酸的非离子性模拟物，其不太可能与细胞蛋白质发生不希望的相互作用(Dwaine A.Braasch和David R.Corey，Biochemistry，2002，41(14)，4503-4510)。在斑马鱼胚胎中已经研究了以吗啉代为基础的寡聚化合物(见Genesis，第30卷，第3期，2001和Heasman，J.，Dev.Biol.，2002，243，209-214)。已报道了以吗啉代为基础的寡聚化合物的深入研究(见Nasevicius等人，Nat.Genet.，2000，26，216-220；和Lacerra等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，9591-9596)。在1991年7月23日出版的美国专利5,034,506中公开了以吗啉代为基础的寡聚化合物。已经制备了具有连接单体亚单位的众多不同连接基的吗啉代类的寡聚化合物。
已经制备了具有连接单体亚单位的众多不同的连接基(L2)的吗啉代核酸。基本式如下示 其中T1为氢、羟基、经保护的羟基、连接的核苷或连接的寡聚化合物；T5为氢、磷酸、磷酸衍生物、连接的核苷或连接的寡聚化合物；和L2为连接基，其可以从手性至非手性和带电荷至中性之间改变(美国专利5,166,315公开了包括-O-P(＝O)(N(CH3)2)-O-的键；美国专利5,034,506公开了非手性吗啉代间键例如-S(＝O)-X-其中X是NH、NCH3、O、S或CH2；-C(＝Y)-O-其中Y是O或S；-S(＝O)(OH)-CH2-；-S(＝O)(OH)-N(R)-CH2-其中R是H或CH3；美国专利5,185,444公开了含磷的手性吗啉代间键例如-P(＝O)(-X)-O-其中X是F、CH2R、S-CH2R或NR1R2，并且每个R、R1、R2是H、CH3或者某些其它不干扰碱基特异性氢键的部分；并且n为7至约79。
另一类寡核苷酸模拟物称作环己烯基核酸(CeNA)。用环己烯基环替代了通常存在于DNA/RNA分子中的呋喃糖环。已经制备了经CeNADMT保护的亚磷酰胺单体并按照常规亚磷酰胺化学用于合成寡聚化合物。已经制备和研究了经充分修饰的CeNA寡聚化合物和在特定位置上经CeNA修饰的寡核苷酸(见Wang等人，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602)。通常在DNA链中掺入CeNA单体增强DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸与RNA和DNA互补体形成复合体并具有与天然复合体相似的稳定性。通过NMR和圆二色性研究CeNA结构向天然核酸结构的掺入以进行容易的构象适应。而且，CeNA掺入靶向RNA的序列对血清稳定，并且能激活大肠杆菌(E.Coli.)RNA酶，导致靶RNA链的切割。
CeNA的通式入如下所示 其中每个Bx为杂环碱基部分；L3为环己烯基间键，例如磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；T1为氢、羟基、经保护的羟基、连接的核苷或连接的寡聚化合物；和T2为氢或磷酸、磷酸衍生物、连接的核苷或连接的寡聚化合物。
可由一种或多种失水己糖醇核苷制备另一类寡核苷酸模拟物(失水己糖醇核酸)(见Wouters和Herdewijn，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，9，1563-1566)并且所述模拟物具有通式 每个Bx为杂环碱基部分；L为失水己糖醇间键，例如磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；T1为氢、羟基、经保护的羟基、连接的核苷或连接的寡聚化合物；和T2为氢或磷酸、磷酸衍生物、连接的核苷或连接的寡聚化合物。
进一步的修饰包括二环糖部分例如“锁定核酸”(LNA)，在其中核糖基糖环的2’羟基与该糖环的4’碳原子连接，因此形成2’-C，4’-C-氧基亚甲基键以产生二环糖部分(见Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs，2001，2，558-561；Braasch等人，Chem.Bio1.，2001，8 1-7；和Orum等人综述，Curr.Opinion Mol.Ther.，2001，3，239-243；也见美国专利6,268,490和6,670,461)。该键可为桥接2′氧原子和4′碳原子的(-CH2-)x基，其中若x＝1，使用术语LNA，若x＝2，使用术语ENATM(Singh等人，Chem.Commun.，1998，4，455-456；ENATMMorita等人，BioorganicMedicinal Chemistry，2003，11，2211-2226)。因此，“ENATM”是LNA的一个非限制性实例。LNA和其它的二环糖类似物表现出与互补的DNA和RNA相当高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、3’核酸外切降解稳定性和良好的溶解性质。可由ProLigo(Paris，France和Boulder，CO，USA)商业获得LNA。在二环的环系统中具有单个CH2键的LNA的基本结构如下所示。这仅仅是LNA一种类型的阐明。
其中每个T1和T2独立地为氢、羟基保护基、连接的核苷或连接的寡聚化合物，并且每个Z1为核苷间连接基团，比如磷酸二酯或硫代磷酸酯。
还已经研究的LNA异构体为α-L-LNA，已经证实该异构体对3’-外切核酸酶具有高度稳定性(Frieden等人，Nucleic Acids Research，2003，21，6365-6372)。将α-L-LNA掺入反义缺口体和嵌合体，它们表现强烈反义活性。α-L-LNA的结构如下所示
另一种已经制备和研究了的类似的二环糖部分具有从3’羟基通过单个亚甲基至糖环的4’碳原子的桥，因此形成3’-C，4’-C-氧基亚甲基键(见美国专利6,043,060)。
由2D NMR光谱测定的LNA构象已显示在单链LNA和双链体中，LNA核苷酸已锁定的方向以这样方式限制了磷酸酯主链以便导入更高级的N-型构象群(Wengel等人，Nucleosides Nucleotides，1999，18，1365-1370)。
已经证实LNA可形成极度稳定的LNALNA双链体(Koshkin等人，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，13252-13253)。已证实LNALNA杂交是热稳定性最高的核酸类型双链体系统，并且在双链体水平确定了LNA的RNA模拟特征。向DNA互补体导入三(3)种LNA单体(T.或A)显著提高了解链温度(Tm＝+15/+11)。通过形成极度稳定的LNA:LNA双链体已经强调了LNA介导的杂交的通用性。LNA的RNA模拟在单体的N-型构象限制和LNA:RNA双链体的二级结构方面得以反映。
LNA也可与互补的DNA、RNA或LNA形成具有高的热亲合力的双链体。圆二色性(CD)表明包含经充分修饰的LNA的双链体(特别是LNA:RNA)在结构上与A-型RNA:RNA双链体相似。对LNA:DNA双链体的核磁共振(NMR)检查证实了LNA单体的3’内构象。也已阐明双链DNA的识别，提示LNA的链侵入。对错配的序列研究表明LNA服从Watson-Crick碱基配对法则，与对应未经修饰的对照链比较具有提高了的选择性。已经证实当DN/LNA嵌合体靶向萤光素酶mRNA内的多个区域时(5’非翻译区、起始密码子区或编码区)，可有效地抑止基因表达(Braasch等人，Nucleic Acids Research，2002，30，5160-5167)。
新型LNA寡聚化合物以及LNA可用于多种诊断和治疗应用中。这些应用中包括反义应用、PCR应用、链替换寡聚体、作为核酸聚合酶的底物以及通常作为基于核苷酸的药物。
已经描述了含有LNA强效并且无毒的反义寡核苷酸(Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638)。作者已经证实LNA赋予反义化合物几种所希望的性质。LNA/DNA共聚物在血清和细胞提取物中不容易降解。LNA/DNA共聚物在不同检测系统中表现出强烈的反义活性，所示检测系统为例如活的大鼠脑中G蛋白偶联受体信号转导和在大肠杆菌中检测报告基因。也已成功完成LNA经Lipofectin介导的有效递送到活的人乳腺癌细胞内。与LNA有关的其他成功的体内研究已经证实了可无毒性地敲除大鼠δ阿片样受体(Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，5633-5638)，并且在另一个研究中证实了RNA聚合酶II大亚基翻译的阻断(Fluiter等人，Nucleic Acids Res.，2003，31，953-962)。
已经描述了LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备、以及它们的寡聚、和核酸识别性质(Koshkin等人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。在WO98/39352和WO99/14226中也描述了LNA及其制备。
已经制备了LNA的第一种类似物硫代磷酸-LNA和2’-硫代-LNA(Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222)。已经描述了包含作为核酸聚合酶底物的寡脱氧核糖核苷酸双链体的锁定核苷类似物的制备(Wengel等，PCT国际中请WO03/020739；和WO99/14226)。而且，在本领域中已经描述了2′-氨基-LNA——一种新型带柄的构象限制性高亲合力寡核苷酸类似物的合成(Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039)。此外，已经制备了2′-氨基和2′-甲基氨基-LNA，并且先前已经报道了它们带有互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
已经制备和研究了的符合本发明的另一种寡核苷酸模拟物是苏糖核酸。该寡核苷酸模拟物以替代核糖核苷的苏糖核苷为基础，并且具有如下所示的一般结构
对(3′，2′)-α-L-苏糖核酸(TNA)的最初兴趣涉及是否存在拷贝TNA的DNA聚合酶。发现某些DNA聚合酶能够拷贝TNA模板的有限片段(见C&EN的报道/2003年1月13日)。
在另一项研究中确定TNA能与DNA、RNA和TNA寡核苷酸反平行Watson-Crick碱基配对(Chaput等人，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，856-857)。
在一项研究中，制备了(3′，2′)-α-L-苏糖核酸并与2′和3′酰胺化物类似物比较(Wu等人，Organic Letters，2002，4(8)，1279-1282)。证实酰胺化物类似物与RNA和RNA结合，具有与RNA/DNA强度相似的强度。
已经进一步制备了寡核苷酸模拟物，包括具有下式(所显示的酰胺化物单体)的双环和三环核苷类似物 (见Steffens等人，Helv.Chim.Acta，1997，80，2426-2439；Steffens等人，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，3249-3255；Renneberg等人，J Am.Chem.Soc.，2002，124，5993-6002；和Renneberg等人；Nucleic acids res.，2002，30，2751-2757)。用亚磷酰胺方法已将这些经修饰的核苷类似物寡聚化，并且当与DNA、RNA和其自身杂交时，得到的含三环核苷类似物的寡聚化合物已显示出提高的热稳定性(Tm)。含二环核苷类似物的寡聚化合物已显示出接近DNA双链体的热稳定性。
另一类寡核苷酸模拟物称作磷酸单酯核酸，该模拟物在主链中掺入磷基团。据报道这类寡核苷酸模拟物在抑止基因表达方面(反义寡核苷酸、核酶、有义寡核苷酸和形成三链体的寡核苷酸)具备有用的物理学和生物学以及药理学特点，可作为核酸检测探针以及在分子生物学中辅助应用。
通式(Markush变量的定义见美国专利5,874,553和6,127,346，此处全文引用作为参考)显示如下 已经制备了服从本发明的其他寡核苷酸模拟物，其中环丁基环替代了天然存在的呋喃糖基环。
经修饰的核苷间键在本发明中有用的反义寡聚化合物的特定实例包括含有经修饰的例如非天然存在的核苷间键的寡核苷酸。如本说明书中所定义，具有经修饰的核苷间键的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键和无磷原子的核苷间键。对于本说明书，以及为本领域中某些时候所提到，将在核苷间键中无磷原子的经修饰的寡核苷酸也视为寡核苷。
含有磷原子的经修饰的寡核苷酸主链包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯，包括3’-链烯基膦酸酯、5’-链烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯；氨基磷酸酯，包括3’-氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫烷基磷酸三酯、膦酰基乙酸酯和硫代膦酰基乙酸酯(见Sheehan等人，Nucleic Acids Research，2003，31(14)，4109-4118和Dellinger等人J.Am.Chem.Soc.，2003，125，940-950)、具有正常3’-5’键的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、它们的2’-5’连接的类似物、和那些具有反极性(inverted polarity)的寡核苷酸主链，其中一个或多个的核苷间键为3’至3’、5’至5’或2’至2’键。一种含有磷的经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，该键通过3’-5’键连接。具有反极性的寡核苷酸在3’最末的核苷间键中包含单个3’至3’键，即可为无碱基的单个倒置核苷残基(在此位置核碱基丢失或用羟基代替)。也包括了多种盐、混合盐和游离酸形式。
已经报道N3’-P5’-氨基磷酸酯既对互补的RNA链表现了高亲合力又表现了核酸酶抗性(Gryaznov等人，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3134-3144)。已经研究N3’-P5’-氨基磷酸酯并取得了一定成功，发现N3’-PS’-氨基磷酸酯在体内特异下调c-myc基因表达(skorski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94，3966-3971；和Faira等人，Nat.Biotechnol.，2001，19，40-44)。
教导制备以上含磷键的代表性美国专利包括，但不限于，U.S.3,687,808；4,469,803；4,476,301,5,023,234；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，每个专利此处引用作为参考。
在本发明的一些实施方案中，寡聚化合物具有一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键，特别具有-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-代表天然的磷酸二酯核苷间键)。在以上参考的美国专利5,489,677中公开了MMI型核苷间键。在以上参考的美国专利5,602,240中公开了酰胺核苷间键。
不包括磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子的或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包括那些具有吗啉代键(部分形成自核苷的糖部分)的主链；硅氧烷主链；硫醚、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯的主链；氨基磺酸酯主链、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和氨磺酰主链；酰胺主链和其它具有混合N、O、S和CH2组成部分的主链。
教导制备以上寡核苷酸的代表性美国专利包括，但不限于，U.S.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，每份专利此处引用作为参考。
经修饰的糖本发明的寡聚化合物也可包含一个或多个经取代的或经修饰的糖部分。常规地修饰核糖基和相关的糖部分的不参与连接的任何反应位置。因此对糖取代基适合的位置是不常用于3’至5’核苷间键中的2’位。其它合适的位置是3’和5’末端。当两个相邻糖单位之间的键是2’，5’键时，可以修饰糖的3’位。糖取代基包括OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、链烯基和炔基可为经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10链烯基和炔基。特别适宜的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n和m为从1到约10。其它适合的寡核苷酸包含糖取代基，该糖取代基选自C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、链烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2，杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基、报告分子基、嵌入剂、供改善寡核苷酸药物代谢动力学特点的基团或供改善寡核苷酸药物动力学特点的基团，和其它具有相似特点的取代基。
一种修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即，烷氧基烷氧基。其他修饰包括2′-二甲基氨基氧乙氧基即，O(CH2)2ON(CH3)2基，也称作2′-DMAOE，如本文实施例中所述，2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-DMAEOE)，即，2′-O-(CH2)2O-(CH2)2N(CH3)2和N-甲基乙酰胺(也称作NMA、2′-O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3)。
其它糖取代基包括甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(OCH2CH2CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基(-O-CH2-CH＝CH2)和氟代(F)。2′-糖取代基可位于阿糖(上)位或核糖(下)位内。一个2′-阿糖修饰为2′-F(见Loc等人，Biochemistry，2002，41，3457-3467)。可在寡聚化合物的其他位置上特别在3’末端核苷上或在2′-5′连接的寡核苷酸中的糖的3′位上，以及5’末端核苷酸的5′位上进行相似的修饰。寡聚化合物也可具有糖模拟物例如环丁基部分替代呋喃戊糖基(pentofuranosyl)。教导制备经如此修饰的糖结构的代表性美国专利包括，但不限于，U.S.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920和6,147,200，每份专利此处全文引用作为参考。
进一步代表性的糖取代基包括式Ia或IIa基团 其中Rb为O、S或NH；Rd为单键、O、S或C(＝O)；Re为C1-C10烷基、N(Rk)(Rm)、N(Rk)(Rn)、N＝C(Rp)(Rq)、N＝C(Rp)
(Rr)或具有式IIIa； Rp和Rq每个独立地为氢或C1-C10烷基；Rr为-Rx-Ry；每个Rs、Rt、Ru和Rv独立地为氢、C(O)Rw、经取代或未经取代的C1-C10烷基、经取代或未经取代的C2-C10链烯基、经取代或未经取代的C2-C10炔基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、化学官能团或缀合物基，其中取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫羟基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基和炔基；或任选地，Ru和Rv一起与它们连接的氮原子形成苯二甲酰亚氨基部分。
每个Rw独立地为经取代的或未经取代的C1-C10烷基、三氟乙基、氰基乙氧基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、烯丙氧基、9-芴基甲氧基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基、2，2，2-三氯乙氧基、苄氧基、丁酰基、异丁酰基、苯基或芳基；Rk为氢、氮保护基或-Rx-Ry；Rx为键或连接部分；Ry为化学官能团、缀合物基或固相支持介质，每个Rm和Rn独立地为，H、氮保护基、经取代的或未经取代的C1-C10烷基、经取代的或未经取代的C2-C10链烯基、经取代的或未经取代的C2-C10炔基，其中取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫羟基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、链烯基和炔基；NH3+、N(Ru)(Rv)、胍基和酰基，这里所述酰基为酸性酰胺或酯；或Rk和Rm一起为氮保护基，在任选地包括选自N和O的额外的杂原子的环结构中连接，或者为化学官能团。
Ri为ORz、SRz或N(Rz)2；
每个Rz独立地为，H、C1-C8烷基、C1-C8卤烷基、C(＝NH)N(H)Ru、C(＝O)N(H)Ru或OC(＝O)N(H)Ru；Rf、Rg和Rh包含环系统，该环系统具有约4至约7个碳原子或具有约3至约6个碳原子和1或2个杂原子，其中所述杂原子选自氧、氮和硫，以及其中所述环系统为脂肪族、不饱和的脂肪族、芳族或饱和或不饱和杂环环系统；Rj为具有1至约10个碳原子的烷基或卤烷基、具有2至约10个碳原子的链烯基、具有2至约10个碳原子的炔基、具有6至约14个碳原子的芳基、N(Rk)(Rm)ORk、卤、SRk或CN；ma为1至约10；每个mb独立地为0或1；mc为0或1至10的整数；md为1至10的整数；me为0、1或2；条件是mc为0时，md大于1。
在标题为“Capped 2’-Oxyethoxy Oligonucleotide”的美国专利号6,172,209中公开了式I的代表性取代基，此处全文引用作为参考。
在标题为“RNA Targeted 2′-Oligomeric compounds that areConformationally Preorganized”的美国专利号6,271,358中公开了式II的代表性环取代基，此处全文引用作为参考。
糖取代基包括O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3))2，其中n和m为1至约10。
在1999年7月7日申请的标题为“Functionalized Oligomers”的美国专利号6,593,466中公开了在式III显示的代表性胍取代基，因此全文引用作为参考。
在美国专利号6,147,200中公开了代表性乙酰胺基取代基，因此全文引用作为参考。
在标题为“2′-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Oligomeric compounds”的国际公开号WO00/08044895中公开了代表性二甲基氨基乙氧基乙基取代基，因此全文引用作为参考。
本发明的寡聚化合物也包含任意组合的两种或多种相同的或化学上不同的糖、碱基和核苷间键修饰。这里所用术语“化学上不同的”意为不同的化学本体，无论该本体完全不同或部分不同。例如，寡聚化合物可包含2’-氟以及2’-MOE修饰。将这两种修饰视作在同一分子中化学上不同的本体。
经修饰的核碱基/天然存在的核碱基寡聚化合物也可以包括核碱基(在本领域中常简称为“碱基”或“杂环碱基部分”)修饰或取代。如此处所用，“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。这里还称作杂环碱基部分的经修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤、8-氨基、8-硫羟基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤，特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
杂环碱基部分也可包括那些其中嘌呤或嘧啶碱基为其它杂环所替代的杂环碱基，如7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括那些在美国专利号3,687,808公开的、那些在The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，858-859页，Kroschwitz，J.I.，编著John Wiley & Sons，1990，由Englisch等人Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公开的，和Sanghvi，Y.S.，15章，Antisense Research and Applications，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编著CRC Press，1993公开的那些核碱基。这些核碱基中某些碱基对提高本发明的寡聚化合物的亲合力特别有用。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已证实5-甲基胞嘧啶取代提高了核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编者，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，276-278页)并且是目前合适的碱基取代，甚至当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰联合时也是如此。
本发明的寡聚化合物可同样包括替代一个或多个杂环碱基部分的多环杂环化合物。前面已经报道了多种三环杂环化合物。通常在反义应用中使用这些化合物以提高经修饰的链对靶链的结合性质。研究最彻底的修饰针对鸟嘌呤，因此已经将它们命名为G-夹(clamp)或胞嘧啶类似物。众多这样的多环杂环化合物具有通式 与第二链中的鸟嘌呤形成3氢键的代表性胞嘧啶类似物包括1，3-二氮杂吩嗪-2-酮(R10＝O、R11-R14＝H)(Kurchavov等人，Nucleosides andNucleotides，1997，16，1837-1846)、1，3-二氮杂吩噻嗪-2-酮(R10＝S，R11-R14＝H)，(Lin，K.-Y.；Jones，R.J.；Matteucci，M.J.Am.Chem.Soc.1995，117，3873-3874)和6，7，8，9-四氟-1，3-二氮杂吩嗪-2-酮(R10＝O，R11-R14＝F)(Wang，J.；Lin，K.-Y.，Matteucci，M.Tetrahedron Lett.1998，9，8385-8388)。已证实这些掺入到寡核苷酸中的碱基修饰与互补鸟嘌呤杂交并且已经证实后者也与腺嘌呤杂交并且通过扩展堆积相互作用而增强螺旋的热稳定性(也见2002年5月24日申请的标题为“经修饰的肽核酸”的美国专利申请序号10/155,920；2002年5月24日申请的标题为“核酸酶抗性嵌合寡核苷酸”的美国专利申请序号10/023,295，两份专利此处均全文引用作为参考)。
当胞嘧啶类似物/取代基具有附着在刚性1，3-二氮杂吩嗪-2-酮支架(R10＝O，R11＝-O-(CH2)2-NH2，R12-14＝H)上的氨基乙氧基部分时，观察到进一步螺旋稳定性质(Lin，K.-Y.；Matteucci，M.J.，Am.Chem.Soc.1998，120，8531-8532)。结合研究表明相对5-甲基胞嘧啶(dC5me)，一个掺入将能增强模型寡核苷酸与其互补的靶DNA或RNA的结合亲合力并且ΔTm提高达18℃，这仍是已知的由单一修饰所致亲合力增强的最高值。而另一方面，螺旋稳定性的提高并不是损害寡核苷酸特异性。与dC5me相比，Tm数据显示了完美匹配或错配的序列之间更大的差异。已提出被束缚的氨基充当为额外的氢键供体以便与互补鸟嘌呤的Hoogsteen面即O6相互作用，从而形成4氢键。这意味着扩展的碱基堆积和额外的特异性氢键联合介导了G-夹的增加的亲合力。
在美国专利6,028,183和美国专利6,007,992公开了服从本发明的其他三环杂环化合物和使用它们的方法，两份专利的内容此处全文引用作为参考。
吩嗪衍生物增强的结合亲合力及其未受损的序列特异性使它们成为对于开发更有效的基于反义的药物的有价值的核碱基类似物。实际上，已经从体外实验中获得了有希望的数据，其表明含吩嗪取代的七核苷酸能够激活RNA酶H、增强细胞摄入并表现增加的反义活性(Lin，K-Y；Matteucci，M.J.Am.Chem.Soc.1998，120，8531-8532)。对于G夹活性增强更为明显，因为表明单一取代即可显著改善20聚体2’-脱氧硫代磷酸酯寡核苷酸的体外效力。(Flanagan，W.M.；Wolf，J.J.；Olson，P.；Grant，D.；Lin，K.-Y.；Wagner，R.W.；Matteucci，M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，3513-3518)。然而，为优化寡核苷酸设计并且为更好理解这些杂环修饰对生物学活性的影响，评估这些修饰对寡聚物核酸酶稳定性的影响是重要的。
作为有用的杂环碱基其他经修饰的多环杂环化合物公开在，但不限于在上面提到的US 3,687,808，以及U.S.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,434,257；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,646,269；5,750,692；5,830,653；5,763,588；6,005,096和5,681,941，以及2001年11月28日提交的美国专利申请序号09/996,292，这些专利中的部分专利此处引用作为参考。
缀合物用于本发明组合物中的寡聚化合物也可经修饰而具有一个或多个部分或缀合物以增强所得到寡聚化合物的活性、细胞分布和细胞摄入。在一个实施方案中，通过将缀合物基共价地连接官能团例如羟基或氨基，制备了经如此修饰的寡聚化合物。发明的缀合物基包括嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、能增强寡聚体药物动力学性质的基团，和能增强寡聚体药物代谢动力学性质的基团。通常的缀合物基包括胆固醇、脂类、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素，和染料，例如包括Cy3和Alexa。在本发明上下文中，增强药物动力学性质的基团包括改善寡聚体摄入、增强寡聚体降解抗性、和/或强化与RNA序列特异杂交的基团。在本发明上下文中，增强药物代谢动力学性质的基团包括改善寡聚体摄入、分布、代谢或排泄的基团。在1992年10月23日提交的国际专利申请PCT/US92/09196中公开了代表性的缀合物基，该专利全文此处引用作为参考。
缀合物部分包括但不限于脂类部分，例如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)，硫醚例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，脂肪族链，例如，十二双醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等人，Biochinaie，1993，75，49-54)，磷脂，例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙铵、1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-磷酸三乙铵(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937).
本发明的寡聚化合物也可缀合活性药物物质，例如，阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮基布洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂草、吲哚美辛、巴比妥类、头孢菌素、磺胺药、抗糖尿病的、抗菌的或抗生素药物。在美国专利申请09/334,130(1999年7月15日提交)中描述了寡核苷酸-药物缀合物和它们的制备，该专利此处全文引用作为参考教导制备这样的寡核苷酸缀合物的代表性美国专利包括，但不限于，U.S.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,6Q8,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，每份专利此处引用作为参考用于本发明组合物中的寡聚化合物也可经修饰而具有一个或多个稳定基团，该稳定基团通常附着于单链寡聚化合物一个或两个末端，或双链化合物任一条链的3’或5’末端的一个或多个，以增强如核酸酶稳定性等性质。帽结构包括在稳定基团内。“帽结构或末端的帽结构”意指化学修饰，该修饰可掺入寡核苷酸任一末端(见例如Wincott等人，WO97/26270，此处引用作为参考)。这些末端修饰保护具有末端核酸分子的寡聚化合物免遭外切核酸酶降解，并且能帮助寡聚化合物在细胞内递送和/或定位。帽可存在于5’末端(5’-帽)或3′(3’-帽)末端或两个末端。该帽结构不应与存在于天然的mRNA分子5’末端的倒置甲基鸟嘌呤“5’帽”混淆。在非限制性实例中，该5′帽包括倒置的无碱基残基(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏型-呋喃戊糖基核苷酸、无环3′，4′-断核苷酸；无环3，4-二羟丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸；3′-3′-倒置的核苷酸部分；3′-3′-倒置的无碱基部分；3′-2′-倒置的核苷酸部分；3′-2′-倒置的无碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸；或桥接或非桥接的甲基膦酸酯部分(更多细节见Wincott等人，国际PCT公开WO97/26270，此处引用作为参考)本发明的3′-帽结构包括，例如，4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(p-D-赤型呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯、1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏型-呋喃戊糖基核苷酸、无环3′，4′-断核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸；45′-5′-倒置的核苷酸部分；5′-5′-倒置的无碱基部分；5′-氨基磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥接或非桥接的5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥接或非桥接的甲基膦酸酯和5′-巯基部分(更多细节见Beaucage和Tyer，1993，Tetrahedron 49，1925，此处引用作为参考)。
用来对寡聚化合物的一个或两个末端加帽以赋予核酸酶稳定性的其他3′和5′稳定基团包括那些在2003年1月16日公布的WO03/004602中公开的基团。
3’-桥修饰用于描述同源双链核酸的构象几何的术语为对RNA为“A”型，对DNA为“B”型。RNA和DNA双链体各自构象几何由X射线衍射分析核酸纤维测定(Arnott和Hukins，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1970，47，1504)。通常，RNA:DNA双链体较DNA:DNA双链体更稳定并且具有较高的解链温度(Tm)(Sanger等人，Principles of Nucleic Acid Structure，1984，Springer-Verlag；New York，NY.；Lesnik等人，Biochemistry，1995，34，10807-10815；Conte等人，Nucleic Acids Res.，1997，25，2627-2634)。RNA提高的稳定性已经归因于几个结构特征，最引入注意的是A型几何导致改善的碱基堆积相互作用(Searle等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。在RNA中存在的2’羟基使糖对C3’桥折叠偏转，该折叠也称为Northern折叠(pucker)，该折叠导致双链体促进A型几何。此外，RNA的2’羟基可形成水介导的氢键网络，其帮助稳定RNA双链体(Egli等人，Biochemistry，1996，35，8489-8494)。另一方面，脱氧核酸优选C2′桥糖折叠，即，也称作Southern折叠，据认为该折叠赋予了稳定性较低的B型几何(Sanger，W.(1984)核酸结构原理，Springer-Verlag，New York，NY)。如此处所用，B型几何既包括C2′-桥折叠也包括O4′-桥折叠。这与Berger等人，Nucleic Acids Research，1998，26，2473-2480一致，Berger等人指出，在考虑产生B型双链体的呋喃糖构象时，也应当对O4′-桥折叠的贡献予以考虑。
然而，DNA:RNA杂交双链体稳定性通常比纯的RNA:RNA双链体稳定性低，并且取决于它们的序列可能比DNA:DNA双链体稳定性更高或更低，(Searle等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。杂合双链体的结构介于A-型和B-型几何之间，这种结构可导致弱堆积相互作用(Lane等人，Eur.J.Biochem.，1993，215，297-306；Fedoroff等人，J.Mol.Biol.，1993，233，509-523；Gonzalez等人；Biochemistry，1995，34，4969-4982；Horton等人，J.Mol.Biol.1996，264，521-533)。靶RNA和合成的序列间形成的双链体的稳定性对于针对但不限于包括RNA酶H、RNAi在内的反义机制或需要寡聚化合物结合RNA靶链的任何机制的疗法是关键的。就反义而言，有效地抑制mRNA需要反义化合物具有与mRNA足够高的结合亲合力。否则寡聚反义化合物与靶mRNA链之间所希望的相互作用将较少发生，结果导致降低的功效。
修饰糖折叠的一种常规方法是用影响糖几何的取代基取代糖的2’位。对环构象的影响依赖于2’位取代基的性质。已经研究了众多不同的取代基以测定它们的糖折叠效应。例如，已经对2’-卤素的研究表明2’-氟衍生物展示了C3’桥形式的最群体(65％)，而2’-碘展示了最低的群体(7％)。腺嘌呤(2’-OH)群体对脱氧腺嘌呤群体分别为36％和19％。进一步，腺嘌呤二聚体(2’-脱氧-2’-氟-腺嘌呤-2’-脱氧2’-氟腺嘌呤)的2’-氟基的影响进一步与经堆积的构象的稳定有关。
如所期望，通过以2’-氟基替换2’-OH基能增强双链体相对稳定性，因此增加了C3’-桥群。推测2’-F键的高度极性和对C3’-桥折叠的极端偏爱将稳定A型双链体中堆积的构象。来自UV减色性、圆二色性和1H NMR的数据也表面随着卤取代基电负性的降低，堆积度下降。而且，糖部分的2’位上的空间体积在A型双链体中较在B型双链体中得到更好地容纳。因此，认为在二核苷单磷酸酯的3’末端上的2’取代基对堆积构象产生许多效应空间互斥、呋喃糖折叠偏好、静电排斥、疏水性吸引和成氢键能力。认为这些取代基效应由取代基的分子大小、电负性、和疏水性决定。互补链的解链温度同样随2’取代的腺嘌呤二磷酸酯而增高。构象的3’桥偏好还是取代基的存在为结合增强的原因还不清楚。然而，可以用3’-桥构象实现相邻碱基更大重叠(堆积)。
本发明的一个方面，寡聚化合物包括经合成方式修饰以诱导3’-桥糖构象的核苷。核苷可掺入杂环碱基、糖部分或两者的合成修饰，以诱导所希望的3’-桥糖构象。这些经修饰的核苷用于模拟类RNA核苷，以便在维持所希望的3’-桥构象几何的同时增强寡聚化合物的特定性质。作为RNA干扰机器的必需条件，存在对RNA型双链体(A型螺旋，主要是3’-桥)明显的偏爱，这种偏爱部分地由如下事实所支持在秀丽隐杆线虫(C.elegans)系统中，2’-脱氧-2’-F-核苷组成的双链体高效率启动RNAi反应。通过使用更稳定的3’-桥核苷而增强的性质包括，但不限于，通过调整蛋白质结合、蛋白质解离塑料(off-rate)、吸收和清除调节药物代谢动力学性质、调节核酸酶稳定性以及化学稳定性、调节寡聚体的结合亲合力和特异性(对酶以及对互补序列的亲和力和特异性)、以及提高RNA切割效率。本发明提供充当RNAi途径触发物的寡聚化合物，该化合物具有经如此方式修饰以支持C3’-桥型构象的一个或多个核苷。
构象图 C2’-桥/SouthernC3’-桥/Northern核苷构象受多种因素影响，这些因素包括在呋喃戊糖基糖2’、3’或4’位上的取代。电负性取代基通常偏好直立位，而需要空间的取代基通常偏好平伏位(核酸结构原理，Wolfgang Sanger，1984，Springer-Verlag)。可成功完成支持3’-桥构象的2’-位修饰并维持作为识别元件的2’-OH(Gallo等人，Tetrahedron(2001)，57，5707-5713.Harry-O′kuru等人，J.Org.Chem.，(1997)，62(6)，1754-1759和Tang等人，J.Org.Chem.(1999)，64，747-754)。
或者，通过如由2’脱氧-2’F-核苷所例证的2’-OH缺失而成功实现对3’-桥构象的偏爱(Kawasaki等人，J.Med.Chem.(1993)，36，831-841)，该偏好采用了将电负性氟原子置于直立位的3’-桥构象。核糖环的其它修饰包括，例如在4’-位置取代以产生经4’-F修饰的核苷(Guillerm等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters(1995)，5，1455-1460以及Owen等人，J.Org.Chem.(1976)，41，3010-3017)或例如，产生亚甲基卡巴核苷(methanocarba nucleoside)的类似物的修饰也诱导了对3’-桥构象的偏好(Jacobson等人，J.Med.Chem.Lett.(2000)，43，2196-2203和Lee等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters(2001)，11，1333-1337)。以相似思路，触发RNAi反应的寡聚化合物可由一种和多种经修饰的核苷以如此方式组成，其中将该核苷的构象锁定为C3’-桥型构象，即锁定核酸(LNA，Singh等人，Chem.Commun.(1998)，4，455-456)，和经乙烯桥接的核酸(ENATM，Morita等人，Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(2002)，12，73-76)。
经修饰的核苷和它们寡聚体的优选构象通过多种方法例如分子动态计算、核磁共振光谱学和CD测量得到评估。因此，选择预测在寡聚的环境中可诱导类RNA构象，A型双链体几何结构的修饰以用于本发明的经修饰的寡核苷酸。服从本发明的众多经修饰的核苷的合成为本领域公知(见例如，1988年Plenum出版社Leroy B.Townsend编辑《核苷和核苷酸的化学》第1-3卷，以及下面的实施例部分)。
一方面，本发明涉及所制备的针对核酸靶标、与天然RNA相比具有增强的性质的寡聚化合物。在设计增强性寡聚化合物时，鉴定了靶标，并且选择具有有效的长度并且与靶序列一部分互补的序列的寡聚化合物。为可能的增强修饰细查了所选择序列中每一个核苷。一种修饰将为以具有相同3’-桥构象几何但是还具有增强了的性质的核苷替代一个或多个RNA核苷。相比于天然RNA，这种修饰能增强化学稳定性和核酸酶稳定性，并且与此同时可更廉价和更容易地合成和/或掺入寡核苷酸。所选择的寡聚化合物序列可进一步划分为区域并对每个区域的核苷评估嵌合构象可以导致的增强性修饰。既然经常可以对一个或多个末端的核苷进行有利的修饰，因此，也应该对5’和3’末端给予考虑。本发明的寡聚化合物可包含单链上或一条或多条双链序列的至少一个5’-位磷酸酯上至少一个5’-修饰的磷酸酯基。也可考虑其他修饰，例如核苷间键、缀合物基、取代基糖或碱、以核苷模拟物取代一个或多个核苷以及能增强所选择的序列对它的预期靶的亲合力的任何其它修饰。
赋予核苷酸的增强的核酸酶抗性和极高亲合力的一种合成2’-修饰是2-甲氧基乙氧基(2′-MOE，2′-OCH2CH2OCH3)侧链(Baker等人，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000)。2′-MOE取代的一个即刻优点是提高了结合亲合力，该修饰产生亲合力较之于众多相似的2’-修饰例如O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基的修饰产生的亲合力强得多。已经证实具有2’-O-甲氧基乙基取代基的寡聚体是基因表达的抑制物，具备体内应用有希望的特点(Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altmann等人，Chimia，1996，50，168-176，Altmann等人，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637；和Altmann等人，Nucleosides Nucleotide，1997，16，917-926)。相对于DNA，具有2′-MOE修饰的寡聚体表现出提高的RNA亲合力以及更高的核酸酶抗性。在翼核苷和脱氧-硫代磷酸酯核苷酸(也称为缺口寡聚体或缺口体)的内部区域中具有2′-MOE取代基的嵌合寡聚体已显示在低剂量下能有效降低动物模型中肿瘤生长。2′-MOE取代的寡聚体也已在几种疾病状态中显示了作为反义化合物的光明前景。已批准了一种此类MOE取代的寡聚体用于治疗CMV视网膜炎。
大多数2’-MOE取代基呈现环绕于乙基连接体C-C键的扭曲构象。然而，在两个案例中观察到了环绕于C-C键的反式(trans)构象。晶体中的晶格相互作用包括双链体通过它们的小沟相互堆积。因此，对某些残基，2’-O-取代基的构象受相邻的双链体接触的影响。通常取代基构象的变化(例如，环绕C-C键的g+或g-)在链间、小沟间和链内的取代基之间产生一系列相互作用。在一个位置上，来自于两个残基的取代基原子处于小沟间范德华接触之中。类似的，两个来自相邻的链内残基的取代基原子之间发生密切接触。
以前测定的A-DNA双链体晶体结构为掺入单独的2’-O-甲基T残基的双链体的结构。在以上提到适用于2’-MOE取代基的晶体结构中，已经观察到2’-MOE残基的保守水合模式。观察到单个的水分子位于取代基的O2’、O3’和甲氧基氧原子之间，与三方形成2.9至3.4的接触。此外，取代基的氧原子参与了其它几个氢键接触。例如，特定2’-O-取代基的甲氧基氧原子通过桥接的水分子与来自相反链的腺苷的N3形成氢键。
在一些情况中，水分子陷入经修饰的核苷的氧原子O2’、O3’和OC’之间。乙二醇连接体C-C键周围具有反式构象的2’-MOE取代基与相反链中鸟苷OC’和N2之间以紧密接触连接，并且在OC’和N3(G)之间经水介导连接。当结合含有经2’-MOE修饰链的双链体的可获得的热力学数据时，该晶体结构可适用于进一步详细分析其它修饰的结构稳定性。
在深入的晶体学结构研究中，进行了分子建模实验以研究具有2’-O-修饰的寡核苷酸增强了的结合亲合力。对上面的SEQ ID NO10的化合物实施了计算机模拟，该化合物在寡核苷酸中每个核苷都具有2’-O-修饰。用AMBER力场方法对水性溶液中寡核苷酸进行了模拟(Cornell等人，J.Am.Chem.Soc.，1995，117，5179-5197)(来自UCSF，San Francisco，CA的建模软件包)。在Indigo2 SGI机上进行了计算(Silicon Graphics，Mountain View，CA)。
另一个产生3’-桥糖构象几何的2’-糖取代基是2’-OMe基。就相应的天然(2’-OH)种类而言，以2’-OMe基2’取代鸟苷、胞苷和尿苷二核苷磷酸酯显示增强的堆积效应，因此得出糖采用C3’-桥构象的结论。在此实例中，认为甲基的疏水性吸引力倾向于克服其空间体积的去稳定性效应。
通过测定寡核苷酸与其互补链杂交复合体的解链温度(Tm)比较了寡核苷酸与其互补靶标链结合的能力。解链温度(Tm)——双螺旋的特征性物理性质——是出现50％螺旋(杂交)对卷曲(未杂交)形式时的温度(摄氏度)。通过UV光谱测定杂交复合体的形成和破坏(解链)测量Tm。在杂交期间发生的碱基堆积伴随UV吸收的减少(减色性)。因此UV吸收的减少表明高Tm。Tm越高，链之间键的强度越大。
Freier和Altmann，Nucleic Acids Research，(1997)254429-4443，已经发表了关于寡核苷酸结构性修饰对它们与靶RNA形成的双链体的稳定性影响的研究。在该研究中，作者回顾了已经合成的含有超过200种不同修饰的一系列寡核苷酸，并且评估了它们的杂交亲合力和Tm。经研究的糖的修饰包括在糖2’-位上的取代、3’-取代、4’-氧替代、二环糖的使用和四元环替代。对几种核碱基修饰也进行了研究，所述修饰包括在胸腺嘧啶的5或6位的取代、嘧啶杂环的修饰和嘌呤杂环的修饰。也对经修饰的核苷间键进行了研究，所述键包括中性、含磷和无磷的核苷间键。
在靶向mRNA靶链的经修饰的寡核苷酸中增加C3’-桥糖的百分数应该预组织该链以结合RNA。文献中已经报道和研究过的几种糖修饰中，电负性取代基例如2’-氟基或2’-烷氧基的掺入将使糖构象转向3’-桥(northern)折叠构象。这使得掺入了此种修饰的寡核苷酸预组织以便具有A-型构象几何。这种A型构象导致了寡核苷酸对靶RNA链增强的结合亲合力。
此外，对含有乙二醇基序的2’-取代基而言，侧链中环绕O-C-C-O扭转的氧原子之间的旁(gauche)相互作用对双链体具有稳定效应(Freier同前)。这种旁相互作用已经多年来通过实验观察到(Wolfe等人，Acc.Chem.Res.，1972，5，102；Abe等人，J.Am.Chem.Soc.，1976，98，468)。这gauche效应可能导致支持双链体形成的侧链构型。仍不能解释该稳定性构型的确切本质。尽管我们不想为理论所束缚，可能保持在单个gauche构型中的O-C-C-O扭转而非在烷基侧链中观察到的更为随机的分布为形成双链体提供了熵优势。
将A-型构象特征(3’-桥)赋予所得双链体的服从本发明的代表性2’-取代基包括2′-O-烷基、2′-O-取代的烷基和2′-氟基取代基。多种烷基和芳基醚和硫醚、胺和单烷基和二烷基取代的胺是适合的取代基。进一步打算对本发明的一种或多种寡聚化合物在一个或多个单体亚单位(核苷是适合的)和/或核苷间键上的多个位点进行多额修饰，以增强例如但不限于在所选择的应用中活性的性质。
包含作为2’-修饰的本发明的环结构包括环己基、环戊基和苯环以及具有类似环己基、环戊基和苯环的空间足迹(spacial footprints)的杂环环。本发明的2’-O-取代基包括但不限于2′-O-(反式2-甲氧基环己基、2′-O-(反式2-2-甲氧基环戊基、2′-O-(反式2-脲基环己基)和2′-O-(反式2-甲氧基苯基)。
所定义的化学除非本文另外定义，烷基意为C1-C12、C1-C8或C1-C6，直链或(若可能)支链脂肪族烃基。
除非本文另外定义，杂烷基意为C1-C12、C1-C8或C1-C6，直链或(若可能)支链脂肪族烃基，其在包括链末端部分的链中含有至少一个，或约1个至约3个杂原子。杂原子包括N、O和S。
除非本文另外定义，环烷基意为C3-C12、C3-C8或C3-C6脂肪族烃基环。
除非本文另外定义，链烯基意为C2-C12、C2-C8或C2-C6链烯基，该链烯基可为直链或(若可能)支链的烃基部分，该烃基部分至少包含一个碳-碳双键。
除非本文另外定义，炔基意为C2-C12、C2-C8或C2-C6炔基，其可为直链或(若可能)支链的烃基部分，该烃基部分至少包含一个碳-碳叁键。
除非本文另外定义，杂环烷基意为包含至少三个环成员的环部分，其中至少一个环成员为碳，并且1、2或三个环成员为非碳。碳原子的数目可为1至约12、1到约6，并且环成员的总数可在3至约15间变动，或从约3至约8变动。环杂原子为N、O和S。杂环烷基包括吗啉代、硫代吗啉代、哌啶基、哌嗪基、高哌啶基(homopiperidinyl)、高哌嗪基(homopiperazinyl)、高吗啉代(homomorpholino)、高硫代吗啉代(homothiomorpholino)、吡咯烷基、四氢唑基、四氢咪唑基、四氢噻唑基、四羟异唑基、四氢吡唑基、吡喃基和四氢异噻唑基。
除非本文另外定义，芳基意为包含至少一个芳环的任何烃环结构。芳环具有约6至约20个环碳。芳环也包括苯基、萘基、蒽基和菲基。
除非本文另外定义，杂芳基意为环部分，该环部分包含至少一个完全不饱和的环，该环由碳和非碳原子组成。环系统可包含约1至约4个环。碳原子的数目可在1至约12间变动，或在1至约6间变动，并且环成员的总数可在3至约15间变动，或为约3至约8。环杂原子为N、O和S。杂芳基部分包括吡唑基、苯硫基、吡啶基、咪唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、嘌呤基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并咪唑基、苯并噻吩基等。
除非本文另外定义，其中部分定义为化合物的部分，例如杂芳基烷基(杂芳基和烷基)、芳烷基(芳基和烷基)等，每个亚部分均如此定义。
除非本文另外定义，吸电子基团是将电荷吸离它所连接的碳原子的基团，例如氰基或异氰酸根合基。其它指出的吸电子基团包括那些电负性超过碳原子电负性的基团，例如，卤素、硝基或在邻位或对位以一个或多个氰基、异硫氰酸根合基、硝基或卤素取代的苯基。
除非本文另外定义，术语卤素和卤具有它们的普通意思。术语卤素和卤素具有它们的普通意义。卤(卤素)取代基为F、Cl、Br和I。
除非本文另外定义，前面提到的任选的取代基是根据所希望的性质的适合的取代基。包括卤素(F、Cl、Br、I)、烷基、链烯基，和炔基部分、NO2、NH3(经取代或未经取代的)、酸部分(例如-CO2H、-OSO3H2等)、杂环烷基部分、杂芳基部分、芳基部分等。
在前面所有的式中，波浪线(～)表示连接5’-磷酸酯的氧或硫的键。磷酸酯保护基包括那些在美国专利号US 5,760,209、US 5,614,621、US6,051,699、US 6,020,475、US 6,326,478、US 6,169,177、US 6,121,437、US6,465,628中公开的磷酸酯保护基，每份专利此处全文明确地引用作为参考。
寡聚体合成如适宜，根据文献中关于DNA(1993年Humana出版社Agrawal编辑Protocols for Oligonucleotides and Analogs)和/或RNA(Scaringe，Methods(2001)，23，206-217.Gait等人、1998年Smith编辑Gallo等人，Applications of Chemically synthesized RNA in RNAProtein Interactions1-36、Tetrahedron(2001)，57，5707-5713)合成的方法实施了经修饰和未经修饰的核苷的寡聚化。此外，在下面的实施例中说明了合成本发明的寡聚化合物的具体方案。
通过众知的固相合成技术可方便并且常规地合成根据本发明使用的寡聚化合物。包括，例如Applied Biosystem(Foster City，CA)的几家供货商出售此类合成的设备。可以额外地或备选性地使用为本领域公知的任何其他方法进行此类合成。众所公知使用相似技术制备诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物的寡核苷酸。
本发明的寡聚化合物也可混合、胶囊化、缀合或与其它分子、分子结构或化合物的混合物，例如脂质体、受体靶向分子、经口的、直肠的、局部的其它的剂型联合以促进摄入、分布和/或吸收。教导制备这种促进摄入、分布和/或吸收的剂型的代表性美国专利包括，但不限于，美国专利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，每份专利此处引用作为参考。
盐、前体药物和生物等同物发明的寡聚化合物包括任何药学可接受的盐、酯或这种酯的盐、或施用于包括人的动物时，能够(直接地或间接地)提供生物活性代谢物或其残基的任意其它化合物。据此，例如，本公开也涉及发明的化合物的前体药物和药学可接受的盐、这种前体药物的药学可接受的盐、和其它生物等同物。
术语“前体药物”表示一种治疗剂，该治疗剂以非活性或低活性形式制备，这种非活性或低活性形式经内源性酶或其它化学品和/或条件作用在机体或细胞内转换为活性形式(即药物)。特别地，根据Gosselin等人1993年12月9日公布的WO93/245510中或Imbach等人的WO94/26764中公开的方法，将本发明的寡核苷酸的前体药物形式制备为SATE((S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯)衍生物。
术语“药学可接受的盐”指本发明化合物的生理和药学可接受的盐即，保持亲本化合物所希望的生物学活性并且不因此赋予不希望的毒性效应的盐。
可与金属或胺，例如碱金属和碱土金属或有机胺形成药学可接受的加碱盐。用作阳离子的金属的实例为钠、钾、镁、钙等。合适的胺的实例为N，N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(见，例如，Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，J.of Pharma Sci.，1977，66，1-19)。通过将游离酸形式与足量所希望的碱接触以常规的方式产生盐而制备所述酸性化合物的碱加成盐。通过将盐形式与酸接触并且以常规方式分离自由酸可再生游离酸形式。游离酸形式在某些物理性质如在极性溶剂中的溶解性不同于它们各自的盐形式，但是除此之外就本发明而言，盐与它们各自的游离酸等同。如此所用，“药物加成盐”包括本发明组合物诸成分的一种成分的酸性形式药学可接受的盐。药物加成盐包括胺的有机或无机酸盐。酸式盐为氢氯酸盐、乙酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其它合适的药学可接受的盐为本领域技术人员公知，并且包括多种无机和有机酸的碱式盐，例如，与无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；与有机羧酸、磺酸、硫代酸或膦酸或N取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、双羟萘酸、烟酸或异烟酸，和与氨基酸，诸如在自然环境中参与蛋白质合成的20种α氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸、和与苯基乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1，5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油、葡萄糖-6-磷酸、N-环己基氨基磺酸(形成环己基氨基磺酸盐)，或与其它酸性有机化合物，例如抗坏血酸形成的盐。也可用药学可接受的阳离子制备化合物的药学可接受的盐。合适的药学可接受的阳离子为本领域技术人员公知，并且包括碱金属、碱土金属、铵和季铵阳离子。也可能是碳酸盐或碳酸氢盐。
对于寡核苷酸，药学可接受的盐的实例包括但不限于(a)与例如钠、钾、铵、镁、钙、多胺例如精胺和亚精胺等阳离子形成的盐；(b)与例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸；磷酸、硝酸等的无机酸形成的酸加成盐；(c)与例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等等的有机酸形成的盐；(d)与例如氯、溴和碘的元素阴离子形成的盐。在一个实施方案中，提供作为钠盐的双链寡聚化合物。
如此所用，术语“患者”指遭受一种或多种与存活蛋白表达或过量表达有关的疾病侵袭的哺乳动物。将可以理解最适宜的患者是人，也可以理解本发明特别涉及抑制哺乳动物存活蛋白表达或过量表达。
已经认识本领域的技术人员可通过以有效量的本发明的化合物治疗正在受存活蛋白表达或过量表达有关的疾病疾病侵袭的患者而影响所述疾病。因此术语“治疗”意指所有的其中，其中可以减慢、中断、抑制、控制或中止本文描述的疾病的发展，但是不必表示完全消除所有症状。
如此所用，本发明的化合物的术语“有效量”或“治疗有效量”指能有效地治疗或防止此处所描述的疾病的量。
本发明的寡聚化合物可用于诊断、治疗、预防和作为研究试剂和试剂盒。用于治疗时，对怀疑患有能通过调节存活蛋白表达而治疗的疾病或病症的患者，例如人，通过施用根据本发明的反义化合物进行治疗。通过将有效量的反义化合物添加到合适的药学可接受的稀释剂或载体中，可在药物组合物中使用发明的化合物。也可预防性使用本发明的反义化合物和方法例如，以防止或延缓感染、炎症或肿瘤形成。
本发明还包括包含本发明的寡聚化合物的药物组合物和剂型。本发明的药物组合物可以多种途径施用，取决于是否需要局部或全身性治疗，并且取决于欲治疗的部位。施用可为局部的(包括眼的和粘膜的，包括阴道和直肠递送)、经肺，例如通过粉剂或气溶胶的吸入或吹入，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮的、皮内的和透皮的、经口的或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射、滴注或灌注。或颅内的，例如鞘内或室内施用。认为具有至少一个2’-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸尤其可用于经口施用。
供局部施用的药物组合物和剂型可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规的药物载体、水性的、粉末或油状基质、增稠剂等可为必需或所希望的。也可使用经涂布的安全套、手套等等。
经口施用的组合物和剂型包括粉剂或粒剂、在水或非水性介质中的悬浮剂或溶液剂、胶囊、小药囊或片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂和粘合剂也为所希望的。经口施用的组合物也包括在2001年8月22日提交的共同待决美国专利申请序号09/944,493和2001年8月22日提交的09/935,316中所描述的脉冲递送组合物和生物粘附性组合物，这两个共同待决专利的全部内容此处引用作为参考。此处描述了疾病治疗的经口施用。然而，经口施用不是唯一的途径。例如，因为方便或为避免与经口施用相关的潜在并发症，静脉内途径为所希望的。当通过静脉内途径施用本发明的化合物时，可使用静脉内快速浓注或缓慢灌注。
用于肠胃外、颅内或心室内施用的组合物和剂型可包括无菌水性溶液剂，该溶液剂也可包含缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加物例如，但不限于，渗透增强剂、载体化合物和其它药学可接受的载体或赋形剂、包含本发明的寡聚化合物的药物组合物和/或剂型也可包括渗透增强剂，以便增强寡核苷酸的营养递送。可将渗透增强剂分属于五大类中的一类，即，脂肪酸、胆汁酸、鳌合剂、表面活性剂和非表面活性剂(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，8，91-192；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，71，1-33)。可包含来自于这些大类中一类或多类的一种或多种渗透增强剂。作为渗透增强剂的一种或多种脂肪酸和它们的衍生物包括，例如，油酸、月桂酸(C12)、癸酸(C10)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、油酸单甘油酯(a.k.a.1’-单油酰基-消旋-甘油)、二月桂酸甘油酯(dilaurin)、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、单或二甘油酯和它们的生理学可接受的盐(即，油酸盐、月桂酸盐、癸酸盐、肉桂酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐和亚油酸盐)(Lee等人，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems，1991，82，91-192；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，71，1-33；El-Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。一些脂肪酸的实例为癸酸钠和月桂酸钠，通常以浓度0.5％至5％单独地或联合地使用。
多种天然胆汁盐和它们的合成性衍生物作为渗透增强剂发挥作用。因此，术语“胆汁盐”包括胆汁天然存在的成分和任何它们的合成衍生物。胆汁盐的实例为鹅脱氧胆酸(CDCA)和/或熊去氧胆酸(UDCA)，通常以浓度0.5％至2％使用。
可使用包含一种或多种渗透增强剂的复合剂型。例如，胆汁盐可与脂肪酸联合使用制造复合剂型。合适的联合包括联合CDCA与癸酸钠或月桂酸钠(通常0.5％至5％)。
鳌合剂包括，但不限于，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5’-甲氧基水杨酸盐和Homovanilate)、胶原的N-酰基衍生物、Laureht-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，82，92-192；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，71，1-33；Buur等人，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。鳌合剂具有作为DNA酶抑制物的额外优点。
表面活性剂包括，例如，十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，82，92-191)；和全氟化合物乳剂，例如FC-43(Takahashi等人，J.Phare.Pharmacol.，1988，40，252-257)。
非表面活性剂包括，例如，不饱和环脲、1-烷基-和1-链烯基氮杂环-alkanone衍生物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，1991，82，92-191)；和非类固醇类消炎剂，例如双氯酚酸钠、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等人，J.Pharm.Pharntacol.，1987，39，621-626)。
“药学可接受的载体(赋形剂)”是药学可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它供递送一种或多种核酸至动物的药学惰性赋形剂。药学可接受的载体可为液体或固体，并且当与给定药物组合物的核酸和其它成分联合时，应当考虑施用方式进行选择，从而提供所希望的体积、均一性等等。一般的药学可接受的载体包括，但不限于，结合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖或其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉甘醇酸钠等)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。在美国专利4,704,295；4,556,552；4,309,406和4,309,404中描述了缓释经口递送系统和/或经口施用剂型的肠包衣。
本发明的组合物可额外地包含通常在药物组合物中发下的其它附加成分，这些附加成分通常以本领域建立的使用水平使用。因此，例如，组合物可包含额外的相容性药学活性物质例如，抗瘙痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂，或可包含用于物理上配制本发明组合物的多种剂型的额外物质，例如，染料、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，这类物质加入时不应当过度干扰发明组合物中成分的生物学活性。
无论采用什么方法将发明的寡聚化合物导入患者，可用胶体分散系统作为递送赋形剂以增强化合物的体内稳定性和/或以将化合物靶向特定的器官、组织或细胞类型。胶体分散系统包括，但不限于，大分子复合体、纳米胶囊(nanocapsule)、微球体、珠和基于脂质的系统，包括油包水乳液、微团、混合微团、脂质体和结构未经表征的脂寡核苷酸复合体。一种胶体分散系统是多种脂质体。脂质体是微型球体，该微型球体具有由按双层结构组织的脂质构成的一个或多个外层包裹的水性核心(通常见，Chonn等人，Current Op.Biotech.，1995，6，698-708)。
发明的某些实施方案为脂质体和其它组合物提供了一种或多种通过非反义机制发挥作用的化学治疗剂。此类化学治疗剂的实例包括但不限于柔红霉素、柔毛霉素、放线菌素D、阿霉素、表阿霉素、去甲柔毛霉素、去羟阿霉素、博来霉素、麦磺磷芥、异环磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、卡莫司汀、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、强的松、羟孕酮、睾酮、三苯氧胺、达卡巴嗪、甲基苄肼、六甲三聚氰胺、五甲三聚氰胺、米托蒽醌、胺苯吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、喷司他丁、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5F-U)、5-氟脱氧尿苷(5F-UdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、曲麦克特、伊立替康、拓扑替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂、卡铂和己烯雌酚(DES)。通常见The Merck Manualof Diagnosis and Therapy第15版1987，第1206页至1228页Berkow等人编著，Rahway，N.J。当与发明的化合物一起使用时，这些化学治疗剂可单独(例如，5-FU和寡核苷酸)使用或者顺序(例如5-FU和寡核苷酸持续一段时间后接着使用MTX和寡核苷酸)使用，或与一种或多种其它这样的化学治疗剂联合(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放射治疗和寡核苷酸)使用。
消炎药，包括但不限于非类固醇消炎药和皮质醇和抗病毒药，包括但不限于病毒唑、阿糖腺苷、无环鸟苷和更昔洛韦，这些药物也可以与本发明的组合物联合。通常分别The Merck Manual of Diagnosis and Therapy第15版Berkow等人编著，1987，Rahway，N.J，第2499页至2506页和第46页至第49页。其它非反义化学治疗剂也在本发明范围内。两种或多种联合的化合物可一起或顺序使用。
认为治疗组合物的配制和它们随后施用是本领域内技术人员能力范围所及。剂量依赖于欲治疗疾病状态的严重度和反应性，治疗持续时间持续数日到数月，或直到实现治愈或疾病状态的减轻。可通过测量患者体内药物积累计算出最佳给药方案。技术人员可轻易的确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量根据单个的寡核苷酸的相对效力变动，并且可依据在体外试验和动物模型中发现有效EC50而估计。通常，剂量为每公斤体重0.01μg至100g，并且每日、每周、每月或每年施用一次或多次。本领域普通技术人员能依据经测定药物在体液或组织中保持时间和浓度轻易地估计给药重复率。在成功的治疗后，喜欢患者经历维持治疗以防止疾病状态复发，其中以每公斤体重0.01μg至100g，并且每日、每周、每月或每年施用一次或多次的维持剂量施用寡核苷酸。对双链化合物，必须考虑到第二链的增加的核酸负荷(对包含两条分开链的化合物)或额外的核酸长度(对具有双链区域的自身互补的单链)来计算剂量。
可以多种不同方法向细胞内导入双链化合物。例如，可通过微注射；以双链化合物包被的微粒轰击；将细胞浸浴在双链化合物溶液中；在双链化合物存在时对细胞电穿孔；双链化合物的脂质体介导的递送、化学品如磷酸钙、阴离子脂质等介导的转染；病毒感染；转化等施用双链化合物。双链化合物可与增强细胞摄入RNA、稳定退火链、或增强抑制靶多核苷酸序列功能的成分一同导入。对于细胞培养物或组织外植体，可在含有双链化合物或易于进行脂质介导的转化的溶液中方便地孵育细胞。
测定施用于人或动物患者从而预防或治疗与存活蛋白表达或过量表达有关的病理的双链化合物的最佳量，以及施用含有此类双链寡核苷酸的治疗组合物或药物组合物的方法在药学领域内技术人员的能力范围内。人或动物患者的给药依赖于症状、病症和疾病的性质、受感染细胞或组织的性质、患者的状况、体重、一般健康、性别、饮食、时间、持续时间，和施用途径；双链化合物的吸收、分布、代谢和排泄率；与其它药物的联合；病理的严重性和正在治疗的疾病状态的反应性。施用的双链化合物的量也依赖于靶多核苷酸序列和其区域的性质，和双链化合物的性质，并且可容易地优化以获得所希望的有效水平。治疗的时间可持续数日至数周和数月，或直到实现治愈或者实现疾病状态的可接受的减轻或防止。可通过测量患者机体内的药物积累和治疗的有效性计算最佳给药方案。普通技术人员可轻易确定最佳剂量、给药方法和重复率。
尽管特别根据某些实施方案描述了本发明的实施方案，而但是下面的实施例仅用于阐明本发明而不意在限制本发明。。
实施例实施例1用于寡核苷酸合成的核苷亚磷酰胺脱氧和2’-烷氧基酰胺盐2’-脱氧和2’-甲氧基β-氰乙基二异丙基亚磷酰胺盐自商业来源购得(例如，Chemgenes，Needham，MA或Glen Research，Inc.Sterling，VA)。其它2’-烷氧基取代的核苷酰胺盐如美国专利5,506,351中所描述制备，此处引用作为参考。为使用2’-烷氧基酰胺盐合成寡核苷酸，使用未修饰的寡核苷酸标准循环，只是在脉冲递送四唑和碱基后的等待步骤增加至360秒。
用商业途径可获得的亚磷酰胺(Glen Research、Sterling VA或ChemGenes，Needham，MA)按照已公开的方法(Sanghvi等人，NucleicAcids Research，1993，21，3197-3203)合成了含有5-甲基-2’-脱氧胞苷(5-Me-C)的寡核苷酸。
2’-氟酰胺盐2’-氟脱氧腺苷酰胺盐如前面(Kawasaki等人，J Med.Chem.，1993，36，831-841)和美国专利5,670,633(此处引用作为参考)中所描述，合成了2’-氟寡核苷酸。简言之，使用商业途径可获得的9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤作为起始物质并根据经改进的文献方法合成N6-苯甲酰基-2’-脱氧-2’-氟腺苷，其中替代2’-β-三苯甲基的SN2导入2’-α-氟原子。因此N6-苯甲酰基-9’-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤作为3’，5’-双四氢吡喃基(THP)中间物以中等产率得到选择性保护。用标准方法完成THP和N6-苯甲酰基的脱保护，并且使用标准方法获得5’-二甲氧基三苯甲基-(DMT)和5’-(DMT)-3’-亚磷酰胺中间物。
2’-氟脱氧鸟苷使用受四异丙基二硅氧烷基(TPDS)保护的9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤作为起始物质合成2’-脱氧-2’-氟鸟嘌呤，并且转换为中间物二异丁酰基阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤。TPDS基脱保护后，用THP保护羟基以产生受二异丁酰基二-THP保护的阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤。
选择性O-脱酰基化和三氟化(triflation)后，以氟化物处理粗产物，然后脱保护THP基。使用标准方法获得5’-DMT-和5’-DMT-3’-亚磷酰胺。
2’-氟尿苷通过改进的文献方法成功合成了2’-脱氧-2’-氟尿苷，该方法中用70％氟化氢-吡啶处理2，2’-脱水-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶。使用标准方法获得5’-DMT-和5’-DMT-3’亚磷酰胺。
2’-氟脱氧胞苷通过2’-脱氧-2’-氟尿苷的胺化合成了2’-脱氧-2’-氟胞苷，然后选择性保护以产生N4-苯甲酰基-2’-脱氧-2’-氟胞苷。使用标准方法获得5’-DMT-和5’-DMT-3’亚磷酰胺。
2’-O-(2-甲氧基乙基)修饰的酰胺盐如下或备选地，按照Martin，p.，Helvetica Chimica Acta，1995，78，486-504的方法制备2’-O-甲氧基乙基-取代的核苷酰胺盐。
2，2’-脱水(1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿苷)将5-甲基尿苷(核糖基胸腺嘧啶，从Yamasa，Choshi，Japan商业获得)(72.0g，0.279M)、二苯基碳酸(90.0g，0.420M)和碳酸氢钠(2.0g，0.024M)加入DMF(300ml)。加热混合物至形成回流，搅拌，使产生的二氧化碳气体以受控的方式释放。1小时后，减压浓缩稍变黑的溶液。搅拌下将得到的浆液倾入二乙醚(2.5L)。产物形成树胶。倾析醚并以最小量的甲醇(约400ml)中溶解残渣。将溶液倾入新鲜的醚中(2.5L)以产生坚硬树胶。倾析醚并在真空烘箱中干燥树胶(在60℃，1mm Hg，24小时)以产生固体，将该固体压碎为浅褐色粉末(57g，85％粗产率)。NMR光谱与结构相一致，该结构混杂了苯酚钠盐(约5％)，该物质以原样用于进一步的反应(或可使用乙酸乙酯中甲醇梯度(10-25％)通过柱层析进一步纯化该物质得到白色固体，熔点222-224℃)。
2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷将2，2’-脱水-5-甲基尿苷(195g，0.18M)，三(2-甲氧基乙基)硼酸酯(231g，0.98M)和2-甲氧基乙醇(1.2L)加入2L不锈钢压力容器中，并且置于预热至160℃的油浴中。在155-160℃加热48小时后，开启容器并且使溶液蒸干，并且用MeOH(200ml)研制。在热丙酮(1L)中悬浮残渣。将不溶解的盐过滤，以丙酮(150ml)洗涤，并且蒸发滤液。将残渣(280g)溶于CH3CN(600ml)并蒸发。在含有0.5％Et3NH的CH2Cl2/丙酮/MeOH(20∶5∶3)中装填硅胶柱(3kg)。在CH2Cl2(250ml)中溶解残渣并且吸附于二氧化硅(150g)后加入柱上。以装柱溶剂洗脱产物，产生160g(63％)产物。通过再次纯化不纯的级分获得额外的物质。
2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(160g，0.506M)与吡啶(250ml)共蒸发，并且将干燥了的残渣溶于吡啶(1.3L)。加入第一等分试样的二甲氧基三苯甲基氯(94.3g，0.278M)并在室温下搅拌混合物一小时。加入第二等分试样的二甲氧基三苯甲基氯(94.3g，0.278M)并再搅拌反应物1小时。然后加入甲醇(170mL)终止反应。HPLC表明存在约70％产物。蒸发溶剂并用CH3CN(200ml)研制。将残渣溶于CHCl3(1.5L)中，并且以2×500ml饱和NaHCO3和2×500ml饱和NaCl萃取，有机相用Na2SO4干燥，过滤和蒸发。获得275g残渣。在3.5kg硅胶柱上纯化残渣，该凝胶柱以含有0.5％ET3NH的EtOAc/己烷/丙酮(5∶5∶1)填充和洗脱。蒸发纯的级分以产生164g产物。从不纯的级分获得额外约20g产物，得到总产量183g(57％)。
3’-O-乙酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷混合2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-尿苷(106g，0.167M)、DMF/吡啶(由562ml DMF和188ml吡啶制备的3∶1混合物750ml)和乙酸酐(24.38ml，0.258M)并在室温下搅拌24小时。通过首先加入MeOH淬灭tlc样品通过tlc监视反应。由tlc判断反应完成时，加入MeOH(50ml)，并在35℃蒸发混合物。残渣溶于CHCl3(800mL)，并且以2×200ml饱和碳酸氢钠和2×200ml饱和NaCl萃取。水层以200ml CHCl3再次萃取。以硫酸钠干燥合并的有机物并蒸发产生122g残渣(约90％产物)。残渣在3.5kg硅胶柱上纯化并以EtOAc/己烷(4∶1)洗脱。纯的产物级分蒸发得到96g(84％)。从后面的级分中回收额外的1.5g产物。
3’-O-乙酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷将3′-O-乙酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-二-甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷(96g，0.144M)溶于CH3CN(700ml)中制备第一种溶液并备用。
将三乙胺(189ml，1.44M)加入三唑(90g，1.3M)的CH3CN(1L)溶液中，冷却至-5℃，并且用悬挂搅拌器(overhead stirrer)搅拌0.5小时。将POCl3经30分钟逐滴加至维持在0-10℃的搅拌的溶液中，并且将得到的混合物额外搅拌2小时。将第一种溶液经45分钟逐滴加至后一溶液中。将得到的反应混合物冷室温中过夜贮存。将盐从反应混合物中过滤并且将溶液蒸发。在EtOAc(1L)中溶解残渣并且通过过滤除去未溶解的固体。滤液以1×300ml NaHCO3和2×300ml饱和NaCl洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发。残渣用EtOAc研制以产生标题化合物。
2’-O-甲氧基乙基-5’-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷室温下搅拌溶于二烷(500ml)和NH4OH(30ml)中的3′-O-乙酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷(103g，0.141M)溶液2小时。蒸发二烷溶液并且残渣与MeOH(2×200ml)共沸。残渣在MeOH(300ml)中溶解并转移至2L不锈钢压力容器中。加入经NH3气饱和的MeOH(400ml)并且在加热容器至100℃并保持2小时(tlc显示完全转化)。将容器内容物蒸干并且将残渣在EtOAc(500ml)中溶解，并且以饱和NaCl(200ml)洗涤一次。有机物经硫酸钠干燥并且将溶剂蒸发产生85g(95％)标题化合物。
N4-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷在DMF(800ml)中溶解2’-O-甲氧基乙基-5’-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(85g，0.134M)并且搅拌下加入苯甲酸酐(37.2g，0.165M)。在搅拌3小时后，tlc显示反应接近95％完成。将溶剂蒸发并且将残渣与MeOH(200ml)共沸。残渣在CHCl3(700ml)中溶解，并且以饱和NaHCO3(2×300ml)和饱和NaCl(2×300ml)萃取，经MgSO4干燥并且蒸发产生残渣(96g)。以含有0.5％Et3NH的EtOAc/己烷(1∶1)作为洗脱溶剂在1.5kg硅胶柱上层析该残渣。将纯的产物级分蒸发产生90g(90％)标题化合物。
N4-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷-3’-酰胺盐在CH2Cl2(1L)中溶解N4-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(74g，0.10M)。在氮环境搅拌下加入四唑二异丙基胺和2-氰基乙氧基-四(异丙基)亚磷酸酯(40.5ml，0.123M)。得到的混合物在室温搅拌20小时(tlc显示反应为95％完成)。反应混合物以饱和NaHCO3(1×300ml)和饱和NaCl(3×300ml)萃取。水性洗涤物用CH2Cl2(300mL)再次萃取，合并萃取物，经MgSO4干燥和浓缩。用EtOAc/己烷(3∶1)作为洗脱溶剂，在1.5kg硅胶柱上层析获得的残渣。合并纯级分以产生90.6g(87％)标题化合物。
2’-(氨基乙氧基)核苷酰胺盐和2’-(二甲基氨基乙氧基)核苷酰胺盐按照美国专利6,127,533(此处引用作为参考)中的方法，制备了氢基乙氧基和二甲基氨基乙氧基酰胺盐。
实施例2寡核苷酸合成使用标准亚磷酰胺化学用碘氧化在自动DNA合成仪(AppliedBiosystems model 380B)上合成未取代和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。
除了以3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1，1-二氧化物在乙腈中的0.2M溶液替代供亚磷酸盐键分步硫化的标准氧化瓶以外，同合成磷酸二酯寡核苷酸一样合成了硫代磷酸酯。硫杂化等待步骤增至68秒并且后续为加帽步骤。在将寡核苷酸从CPG柱上切割并且在55℃的浓氢氧化铵中去保护(18小时)后，用0.5M NaCl溶液中的乙醇以2.5倍体积沉淀纯化寡核苷酸。如美国专利5,508,270中所描述，制备了次膦酸酯寡核苷酸，将所述专利此处引用作为参考。
如美国专利4,469,863中所描述，制备了烷基膦酸酯寡核苷酸，将所述专利此处引用作为参考。
如美国专利5,610,289或5,625,050中所描述，制备了3’-脱氧-3’-亚甲基膦酸酯寡核苷酸，将所述专利此处引用作为参考。
如美国专利5,256,775或5,366,878中描述，制备了亚亚磷酰胺寡核苷酸，将所述专利此处引用作为参考。
如公布的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(各自作为WO94/17093和WO94/02499公布)中所描述，制备了烷基硫代膦酸酯寡核苷酸，此处引用作为参考。如美国专利5,476,925中所描述，制备了3’-脱氧-3’-氨基亚磷酰胺寡核苷酸，将所述专利此处引用作为参考。
如美国专利5,023,243中所描述，制备了磷酸三酯寡核苷酸，将所述专利此处引用作为参考。
如美国专利5,130,302和5,177,198中所描述，制备了硼磷酸酯(branophosphate)寡核苷酸，此处将所述专利均引用作为参考。
通过Naka等人J.Am.Chem.Soc.1227233-7243,2000和美国专利号5,639,873教导的方法制备了4-核糖核苷和2’-脱氧4’-核糖核苷组合物，此处将所述专利均完整的引用作为参考。
实施例3寡核苷合成如美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289中所描述，制备了亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷，其也确认为MMI连接的寡核苷、亚甲基二甲基联亚氨基寡核苷，其也确认为MDH连接的寡核苷，以及亚甲基羰基氨基连接的寡核苷，其也确认为酰胺-3连接的寡核苷，以及亚甲基氨基羰基连接的寡核苷，其也确认为酰胺-4连接的寡核苷，以及具有例如，交替的MMI和P＝O或P＝S键的混合主链化合物，所有专利此处均引用作为参考。本发明的寡聚化合物也可包含混合的键，在混合的键中任何数量的两种或多种键可以任何顺序出现，并且在寡聚化合物中的任何位置出现，例如包含硫代磷酸酯键的化合物的5’一半和包含磷酸二酯键的3’一半。将这些化合物称为混合的硫代磷酸酯键和磷酸二酯键。
如美国专利5,264,562和5,264,564中描述，制备了甲缩醛(formacetal)和硫代甲缩醛连接的寡核苷，将所述专利此处引用作为参考。
如美国专利5,223,618中描述，制备了环氧乙烷连接的寡核苷，将所述专利此处引用作为参考。
实施例4PNA合成根据在Peptide Nucleic Acids(PNA)Synthesis，Properties andPotential Applications，Bioorganic & Medicinal Chemistry，1996，4，5-23中提及的多种方法的任一种，制备了肽核酸(PNA)。也可根据美国专利5,539,082、5,700,922和5,719,262制备肽核酸，将所述专利此处引用作为参考。
实施例5嵌合寡核苷合成本发明的嵌合寡核苷酸、寡核苷或混合的寡核苷酸/寡核苷可具有数种不同的类型。这些类型包括第一类型，其中连接的核苷的“缺口”片段位于连接的核苷5’和3’“翼”片段之间，以及第二“开放末端”类型，其中“缺口”片段位于寡聚化合物3’末端或5’末端。第一类型寡核苷酸在本领域也称作“缺口体”或带缺口的寡核苷酸。第二类型的寡核苷酸在本领域也称作“半体”或“翼体”(wingmer)。
本发明的双链化合物可为数种类型，包括但不限于，siRNA、规范siRNA、平末端siRNA或发夹。启动RNAi反义机制的本发明的单链化合物也在本发明的范围内。这些单链化合物包括，但不限于，ssRNAi和反义RNA(asRNA)。
(2’-O-Me)-(2’-脱氧)-(2’-O-Me)嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸如上述，用Applied Biosystems自动DNA合成仪合成了具有2’-O-烷基硫代磷酸酯和2’-脱氧硫代磷酸酯寡核苷酸片段的嵌合寡核苷酸。用自动合成仪和提供DNA部分的2’-脱氧-5’二甲氧基三苯甲基-3’-O-亚磷酰胺和提供经2’-MOE修饰的核苷酸的5’-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-3’-O-亚磷酰胺合成了寡核苷酸。通过将递送四唑和碱基后的等待步骤增加至600秒，调整了标准合成循环，所述调整对RNA重复四次，并且对2’-甲氧基重复两次。从支持体上切除受完全保护的寡核苷酸并且在室温下3∶1氨/乙醇中过夜去保护磷酸基，然后冻干。然后在室温在甲醇氨中进行处理24小时以使所有碱基脱保护并且再次冻干样品。沉淀在THF的中1MTBAF中室温重悬24小时以使2’位脱保护。以1M TEAA终止反应并且将样品在G25大小排阻柱上脱盐之前经旋转蒸发缩减至1/2体积。然后用分光光度法分析回收的寡聚物的产率并且用毛细管电泳和质谱分析纯度。
(2’-O-(2-甲氧基乙基))-(2’-脱氧)-(2 ’-O-(甲氧基乙基))嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸按上述对2’-甲基嵌合寡核苷酸的步骤，以2’-O-(甲氧基乙基)酰胺盐替代2’-O-甲基酰胺盐，制备2’-O-(2-甲氧基乙基))-(2’-脱氧)-(2’-O-(甲氧基乙基))嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸。
(2’-O-(2-甲氧基乙基)磷酸二酯)-(2’-脱氧硫代磷酸酯)-(2’-O-(2-甲氧基乙基)磷酸二酯)嵌合寡核苷酸按上述对2’-O-甲基嵌合寡核苷酸的步骤，以2’-O-(甲氧基乙基)酰胺盐替代2’-O-甲基酰胺盐，制备(2’-O-(2-甲氧基乙基磷酸二酯)-(2’-脱氧硫代磷酸酯)-(2’-O-(甲氧基乙基)磷酸二酯)嵌合寡核苷酸，使用碘氧化以在嵌合结构的翼部分生成磷酸二酯核苷酸间键并且用3H-1，2苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1，1二氧化物(Beaucage Reagent)进行硫化以便为中心缺口生成硫代磷酸酯核苷酸间键。
其它嵌合寡核苷酸、嵌合寡核苷和混合的嵌合寡核苷酸/寡核苷根据美国专利5,623,065合成，此处引用作为参考。
RNA合成通常，RNA合成化学以在策略性中间反应中选择性掺入多种保护基。虽然本领域的技术人员将理解保护基在有机合成中的用途，一类有用的保护基包括甲硅烷基醚。特别地使用大体积的甲硅烷基醚保护5’羟基与用酸不稳定原酸酯保护基保护2’羟基。以标准固相合成技术使用这套保护基。重要的是在所有其它合成步骤后最后除去酸不稳定原酸酯基。而且在合成期间，甲硅烷基保护基早期使用确保了当需要时方便的去除而没有2’羟基的不希望的脱保护。
按照这种依次保护5’羟基同时用经差异性移去并且具有不同化学稳定性的保护基保护2’羟基的方法，合成了RNA寡核苷酸。
以逐步方式合成RNA寡核苷酸。向固相支持体结合的寡核苷酸依次(3’至5’方向)加入每一种核苷酸。在链3’末端的第一个核苷共价结合在固相支持体上。加入核苷酸前体，核苷亚磷酰胺和激活剂，将第二个碱基偶联至第一个核苷的5’末端。洗涤支持体并且将任何未反应的5’羟基用乙酸酐加帽以产生5’-乙酰基部分。然后将该键氧化为更为稳定并且是最后所希望的P(V)键。在核苷酸加入循环结束时，以氟化物切除5’甲硅烷基。对每一个随后的核苷酸重复该循环。
合成后，使用DMF中的1M 2-氨甲酰基-2-氰基乙烯基-1，1-二硫醇二钠盐(S2Na2)三水合物切割磷酸酯上的甲基保护基。用水从固相支持体结合的寡核苷酸洗去脱保护溶液。然后支持体用40％甲胺水溶液55℃处理10分钟。这将使RNA寡核苷酸释放至溶液中，脱保护外向环胺，并且修饰2’基团。在此阶段可用阴离子交换HPLC分析寡核苷酸。
最后一个除去的保护基是2’原酸酯基。由Dharmacon Research，Inc.(Lafayette.Co)开发的乙二醇单乙酯原酸酯保护基是一个有用的原酸酯保护基实例，其具有如下的重要性质。它对合成核苷亚磷酰胺和合成寡核苷酸的条件稳定。然而，在寡核苷酸合成后，用甲胺处理寡核苷酸既从固相支持体上切除寡核苷酸又从原酸酯上除去了乙酰基。得到的在原酸酯上的2-乙基-羟基取代基的吸电子力比乙酰基化的前体低。因此，经修饰的原酸酯变得对酸催化的水解更为不稳定。特别指出，在除去乙酰基后，切割速率加快约10倍。因此这种原酸酯具有足够稳定性以便与寡核苷酸合成相容，并且当随后修饰后，容许在与最后RNA寡核苷酸产物相容的相对温和的水性条件下实施脱保护。
此外，RNA合成方法为本领域公知(Scaringe，S.A.Ph.D.Thesis，University of Colorado，1996；Scaringe，S.A.等人，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，11820-11821；Matteucci，M.D.和Caruthers，M.H.，J Am.Chem.Soc.，1981，103，3185-3191；Beaucage，S.L和Caruthers，M.H.，Tetrahedron Lett.，1981，22，1859-1862；Dahl，B.J.等人，ActaChem.Scand.，1990，44，639-641；Reddy，M.P.等人，Tetrahedropa Lett.，1994，25，4311-4314；Wincott，F.等人，Nucleic AcidsRes.，1995，23，2677-2684；Griffin，B.E.等人，Tetrahedron，1967，23，2301-2313；Griffin，B.E.等人，Tetrahedron，1967，23，2315-2331)。
本发明的RNA反义化合物(RNA寡核苷酸，无论单链或双链)可通过此处的方法合成或从Dharmacon Research，Inc.(Lafayette.Co)购买。一旦合成，即可用本领域所知的方法将互补的RNA反义化合物复性，形成双链(双链体化)反义化合物。例如，将RNA寡核苷酸的每条互补链(50μM RNA寡核苷酸溶液)各30μl与15μl 5×复性缓冲液(100mM乙酸钾，30mM HEPES-KOH pH7.4，2mM乙酸镁)混合后90℃加热1分钟，然后37℃1小时。得到的双链体反义化合物可用于试剂盒、鉴定、筛选或用于研究靶核酸功能，或诊断或治疗目的其它方法。
实施例6寡核苷酸分离在将寡核苷酸或寡核苷从受控的孔玻璃柱(Applied Biosystems)上切割并且在浓氢氧化铵中55℃脱保护18小时后，通过2.5体积的乙醇沉淀两次纯化寡核苷酸或寡核苷。在变性凝胶上用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所合成的寡核苷酸，并且判断为至少85％全长物质。在合成中得到的硫代磷酸酯和磷酸二酯键的相对量通过31P核磁共振光谱定期检测。并且对于某些研究，用HPLC纯化寡核苷酸，如Chiang等人，J.Biol.Chem.1991，266，18162-18171所描述。经HPLC纯化的物质得到的结果与未经HPLC纯化的物质得到的结果相似。
实施例7寡核苷合成-96孔板形式在能够同时组装96条序列的自动化合成仪上按标准96孔形式通过固相P(III)亚磷酰胺化学合成寡核苷酸。通过水性碘氧化提供了磷酸二酯核苷酸间键。通过使用无水乙腈中的3，H-1，2苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1，1二氧化物(Beaucage Reagent)硫化，生成了硫代磷酸酯核苷酸间键。自供货商(例如PE-Applied Biosystems，Foster City，CA，或Pharmacia，Piscataway，NJ)购买标准的受碱基保护的β-氰基乙基二丙基亚磷酰胺。
按已知文献中或申请专利的方法制备非标准的核苷。它们用作碱基受保护的β-氰基乙基二丙基亚磷酰胺。
将寡核苷酸从支持体上切除并在升高的温度(55-60℃)下以浓NH4OH脱保护12-16小时，并且真空干燥释放的产物。然后将经干燥的产物在无μ菌水中重新悬浮以提供主平板，然后用机器人加样器稀释主平板的所有分析性样品和测试平板样品。
实施例8寡核苷酸分析-96孔板形式每一孔中的寡核苷酸的浓度通过样品稀释和UV吸收光谱估计。在96孔形式(Beckman P/ACEJ MDQ)中以毛细管电泳(CE)，或对单独制备的样品，在商业CE装置(例如，Beckman P/ACEJ 5000，ABI 270)中评估单个产物的全长完整性。使用电喷质谱经化合物的质量分析确定碱基和主链组成。所有试验测试平板都用单通道或多通道机器人加样器从主平板中稀释。若平板中至少85％的化合物为至少85％全长，则判断该平板为可接受的。
实施例9细胞培养和寡核苷酸治疗可在多种细胞类型的任一种中检测反义化合物对靶核酸表达的影响，条件是靶核酸以可测量的水平存在。可使用，例如PCR或RNA印迹分析常规地测定这种影响。为阐明的目的提供了下述细胞类型，但是可常规地使用其它细胞类型。
MCF7从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)得到人乳腺癌细胞系MCF7。在补充了10％胎牛血清(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)的低糖DMEM(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)中常规培养MCF7细胞。当细胞达到约90％汇合时，通过胰蛋白酶消化并稀释常规地传代细胞。以约7000个细胞/孔的密度在96孔板(Falcon-Primaria #3872)中接种细胞供用于RT-PCR分析。对RNA印迹或其它分析，可将细胞接种于100mm或其它标准细胞培养板上并使用适合体积的培养基和寡核苷酸进行类似的处理。
HeLa细胞从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)得到人上皮样癌细胞系HeLa。在补充了10％胎牛血清(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的高糖DMEM(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中常规培养HeLa细胞。当细胞达到约90％汇合时，通过胰蛋白酶消化并稀释常规地传代细胞。以约50,000个细胞/孔的密度在24孔板(Falcon-Primaria #3846)中培养细胞或以约5,000个细胞/孔的密度在96孔细板中培养细胞供用于RT-PCR分析。对于RNA印迹或其它分析，在细胞达到约90％汇合时，收获细胞。
U-87MG细胞从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)得到人成角质细胞瘤U-87MG细胞系。在补充了10％胎牛血清(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)和抗生素的DMEM(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中培养U-87MG细胞。当细胞达到适合的汇合时，通过胰蛋白酶消化并稀释常规地传代细胞。以约10,000个细胞/孔的密度在96孔板(Falcon-Primaria #3872)中接种细胞供用于RT-PCR分析。
对于RNA印迹或其它分析，可将细胞接种于100mm或其它标准的组织培养板中并使用合适体积的培养基和寡核苷酸进行类似的处理。对于RNA印迹或其它分析，可将细胞接种于100mm或其它标准的组织培养板中并进行类似的处理，使用合适体积的培养基和寡核苷酸类似地处理。
HUVEC细胞HUVEC细胞得自ATCC并在补充了SingleQuots补充物的EBM(Clonetics Corp，Walkersille，MD)中常规培养。当细胞达到90％汇合时，以胰蛋白酶消化和稀释常规传代，将细胞保持多达15次传代。对生长在96孔板中的细胞(10,000个细胞/孔)，将孔以200μl OPTI-MEM-1TM减血清的培养基(Gibco BRL)洗涤一次，然后以130μl含12μg/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1TM和终浓度为25nM所希望的双链化合物处理。在处理5小时后，用新鲜培养基替代原培养基。dsRNA处理16小时后收获细胞，在此时分离RNA并且以RT-PCR测量靶标的减少。
当细胞达到80％汇合时，细胞以寡核苷酸处理。对生长在96孔板中的细胞，将孔以200μl OPTI-MEM-1减血清的培养基(Gibco BRL)洗涤一次，然后以130μl含3.75μg/ml LIPOFECTIN(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1和终浓度为150nM所希望的双链化合物处理。对dsRNA化合物，使用2×130μl OPTI-MEM-1。在处理4小时后，用新鲜培养基替代原培养基。寡核苷酸处理16小时后，收获细胞。所用的寡核苷酸浓度在细胞系之间不同。为测定特定细胞系的最佳寡核苷酸浓度，细胞以一系列浓度的阳性对照寡核苷酸处理。对人细胞，阳性对照RNA酶H寡核苷酸为ISIS 13920，TCCGTCATCGCTCCTCAGGG，SEQ ID NO1，该阳性对照寡核苷酸为具有靶向人H-ras的硫代磷酸酯主链的2′-O-甲氧基乙基缺口体(粗体显示2′-O-甲氧基乙基)。对小鼠或大鼠细胞，阳性对照寡核苷酸为ISIS 15770，ATGCATTCTGCCCCCAAGGA，SEQ ID NO2，该阳性对照寡核苷酸为具有靶向小鼠和大鼠二者c-raf的硫代磷酸酯主链的2′-O-甲氧基乙基缺口体(粗体显示2′-O-甲氧基乙基)。然后使用导致H-ras(ISIS 13920)或c-raf(ISIS 15770)mRNA 80％抑制的阳性对照寡核苷酸浓度作为在该细胞系的后续实验中新的寡核苷酸的筛选浓度。若未达到80％抑制，使用导致H-ras或c-raf mRNA 60％抑制的阳性对照寡核苷酸的最低浓度作为在该细胞系的后续实验中寡核苷酸筛选浓度。若未达到60％抑制，认为这个特定细胞系不适合寡核苷酸转染实验。
实施例10存活蛋白表达的寡核苷酸抑制的分析可以本领域公知的多种方法测定存活蛋白表达的反义调节。例如，可通过例如，RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或实时PCR(RT-PCR)定量存活蛋白的mRNA水平。目前优选实时定量PCR。可用总细胞RNA或Poly(A)+mRNA进行RNA分析。在例如1993年Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，pp.4.1.1-4.2.9和4.5.1-4.5.3，John Wiley & Sons，Inc.中教导了分离RNA的方法。RNA印迹分析在本领域内为常规并且在例如，1996年Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，pp.4.2.1-4.2.9，JohnWiley & Sons，Inc.中教导。可用商业途径可获得的ABI PRISM 7700Sequence Detection System方便地完成实时定量(PCR)，从PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA可获得该系统并且根据制造商说明使用。其它PCR方法也为本领域公知。
可用本领域公知的多种方法定量存活蛋白的水平，所述方法为例如免疫沉淀、蛋白质印迹分析(免疫印迹)、ELISA或荧光激活细胞分选术(FACS)。可鉴定并从多个来源，例如MSRS抗体目录(Aerie Corporation，Birmingham，MI)获得或由常规抗体产生方法制备针对存活蛋白的抗体。在例如，1997年Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，第2卷，pp.11.12.1-11.12.9，John Wiley & Sons，Inc.中教导了制备多克隆抗血清的方法。在1997年Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，第2卷，pp.11.4.1-11.11.5，John Wiley& Sons，Inc.中教导了单克隆抗体的制备。
免疫沉淀方法是本领域标准的，并且可在例如1998年Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Volume 2，pp.10.16.1-10.16.11，John Wiley & Sons，Inc.，中发现。蛋白质印迹(免疫印迹)分析是本领域标准的，并且可在例如1997年Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，第2卷，pp.10.8.1-10.8.21，John Wiley& Sons，Inc.中发现。酶联免疫吸附测定(ELISA)是本领域标准的，并且可在例如1991年Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，第2卷，pp.11.2.1-11.2.22，John Wiley & Sons，Inc.中发现。
实施例11Poly(A)+mRNA分离根据Miura等人，Clin.Chem.，1996，42，1758-1764分离了Poly(A)+mRNA。在例如1993年Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，第1卷，pp.4.5.1-4.5.3，John Wiley & Sons，Inc.中教导了分离Poly(A)+mRNA的其它方法。简而言之，对于生长在96孔板中的细胞，从细胞除去生长培养基并以200μl冷PBS洗涤每孔。每孔加入60μl裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.6，1mM EDTA，0.5M NaCl，0.5％NP-40，20mM氧钒基核糖核苷络合物)，温和搅拌平板并在室温温育5分钟。将55μl裂解物转移至Oligo d(T)包被的96孔板(AGCT Inc.，Irvine CA)。平板在室温温育60分钟，以200μl洗涤缓冲液(10mM Tris-ClpH7.6，1mM EDTA，0.3M NaCl)洗涤3次。在终末洗涤后，在纸巾上沾吸平板，然后空气干燥5分钟。每孔加入60μl预热到70℃的洗脱缓冲液(5mM Tris-Cl pH7.6)，该平板在90℃热平板上温育5分钟，并且将洗脱物转移到新的96孔平板中。
使用适合体积的所有溶液，在100mm或其它标准板上类似生长的细胞。
实施例12总RNA分离用购自Qiagen，Inc.(Valencia，CA)的RNEASY 96试剂盒和缓冲液，并按照制造商推荐的方法分离总RNA。简而言之，对于生长在96孔板中的细胞，从细胞除去生长培养基并以200μl冷PBS洗涤每孔。每孔加入RLT缓冲液100μl并且将平板剧烈搅动20秒。然后每孔加入100μl70％乙醇并且内容物经上下三次吹吸混合。然后将样品转移到RNEASY 96孔平板，其与安装了废弃物收集盘并且连接了真空源的QIAVAC歧管相连。应用真空15秒。向RNEASY 96孔平板的每孔加入1ml RW1缓冲液并且再应用真空15秒。然后RNEASY 96孔平板的每孔加入1ml RPE缓冲液并且应用真空15秒。然后重复缓冲液RPE洗涤并且额外的应用真空10分钟。然后平板从QIAVAC歧管移去并且在纸巾上沾吸干。然后重新将平板与装配了含有1.2ml收集管的收集管架的QIAVAC歧管连接。然后通过向每一孔中移液60μl水并孵育1分钟，并且应用真空30秒洗脱RNA。可用额外60μl水重复洗脱步骤。
实施例13实时定量PCR分析存活蛋白mRNA水平使用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA)根据制造商说明以实时定量PCR测定存活蛋白mRNA水平的量。该系统是密闭管封、基于非凝胶的荧光检测系统，可允许实时高通量地定量聚合酶链式反应(PCR)产物。与其中扩增产物在PCR完成后定量的标准PCR相反，实时定量PCR中产物在它们积累时即被定量。这种定量通过在PCR反应中包含可与正向和反向PCR引物之间特异性复性并且包含两种荧光染料的寡核苷酸探针而实现。报告分子染料(例如，从Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA获得的JOE或FAM)附着在探针的5’末端并且猝灭剂染料(例如，从Operon Technologies Inc.，Alameda，CA或PE-Applied Biosystems，Foster City，CA获得的TAMRA)附着在探针的3’末端。当探针和染料完整时，3’猝灭剂染料的接近猝灭了报告分子染料的发射。在扩增期间，探针与靶序列的退火产生了可由Taq聚合酶的5’外切核酸酶活性切割的底物。在PCR扩增循环延伸期期间，Taq聚合酶对探针的切割将报告分子染料从探针的剩余部分(并且因此从猝灭剂部分)释放并产生序列特异荧光信号。随每个循环，额外的报告分子染料分子从它们各自的探针中切割下来，并且由嵌入ABI PRISM 7700 SequenceDetection System的激光光学元件以规则(六秒)间隔监测荧光强度。在每次测定中，含有来自未经处理的对照样品RNA系列稀释物的一系列平行反应生成了标准曲线，该标准曲线用于定量测试样品经反义寡核苷酸处理后的抑制百分率。
自PE-Applied Biosystems，Foster City，CA获得PCR试剂。通过向含有25μl Poly(A)mRNA溶液的96孔板加入25μl PCR混合物(1×TAQMAN缓冲液A，5.5mM MgCl2，dATP、dCTP和dGTP各300uM，600uM dUTP，正向引物、反向引物和探针各100nM、20单位RNA酶抑制物、1.25单位AMPLITAQ GOLD和12.5单位MuLV逆转录酶)。经48℃温育30分钟实施RT反应。随后95℃温育10分钟以激活AMPLITAQGOLD，实施两步法PCR方案的40个循环95℃15秒(变性)，随后为60℃1.5分钟(复性/延伸)。使用已公布的序列信息(GenBank登录号U75285，此处引用作为SEQ ID NO3)设计针对人存活蛋白的探针和引物与人存活蛋白序列杂交。对于人存活蛋白，PCR引物为正向引物AAGGACCACCGCATCTCTACA(SEQ ID NO4)反向引物CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT(SEQ ID NO5)，并且PCR探针为FAM-CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA(SEQ ID NO6)其中FAM(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)为荧光报告分子染料，TAMRA(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)为猝灭剂染料。对于人GAPDH，PCR引物为正向引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO7)反向引物GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO8)，并且PCR探针为5′JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3′(SEQID NO9)其中JOE(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)为荧光报告分子染料，TAMRA(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)为猝灭剂染料。
实施例14蛋白质印迹法分析存活蛋白水平用标准方法实施蛋白质印迹分析(免疫印迹分析)。细胞在寡核苷酸处理16-20小时后收获，以PBS洗涤一次，悬浮于Laemmli缓冲液(100μl/孔)，煮沸5分钟并且在16％SDS-PAGE凝胶中上样。凝胶在150V下运行1.5小时，并转移至蛋白质印迹膜。使用针对存活蛋白的适合的一级抗体，并使用针对一级抗体种类的放射标记或荧光标记的二级抗体。用PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)显示带。
实施例15设计和筛选靶向存活蛋白的双链反义化合物(siRNA)根据本发明，可设计一系列包含本发明反义化合物和它们的互补物的双链寡聚化合物(siRNA)以靶向存活蛋白。如此处所述，双链体反义链的核碱基序列包含靶向存活蛋白的寡核苷酸的至少一部分。链的末端可通过加入一个或多个天然的或经修饰的核碱基修饰以形成突出端进行修饰。然后将dsRNA的有义链设计和合成为与反义链互补并且也在两末端之一包含修饰或附加。例如，在一个实施方案中，dsRNA双链体的两条链将与中央的核碱基互补，每条链在一个末端或两个末端具有突出端。
例如，含有具备序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ ID NO10)并且具有脱氧胸苷的双核碱基突出端的反义链的双链体将具有如下结构cgagaggcggacgggaccgTT反义(SEQ ID NO11)TT gctctccgcctgccctggc互补(SEQ ID NO12)如所示，这种双链化合物代表规范siRNA。
在另一个实施方案中，如所示，可制备具有平末端的含有相同序列CGAGAGGCGGACGGGACCG(SEQ ID NO10)的反义链的双链体cgagaggcggacgggaccg反义(SEQ ID NO10)gctctccgcctgccctggc互补(SEQ IN NO13)如所示，这种双链化合物代表平末端siRNA。
双链体RNA链可通过此处公开的方法合成或从Dharmacon ResearchInc.，(Lafayette，CO)购买。一旦合成，即将互补链复性。将单链等分试样并稀释为50μM浓度。一旦稀释，即将每条链各30μl与15μl复性缓冲液5×溶液混合。所述缓冲液终浓度为100mM乙酸钾、30mMHEPES-KOH pH7.4和2mM乙酸镁。终体积为75μl。将该溶液90℃温育1分钟，然后离心15秒。将管在37℃放置1小时后在实验中使用双链体。dsRNA双链体终浓度为20μM。可将这种溶液冷冻(-20℃)贮存并且冻融达5次。
双链体反义化合物(siRNA)一经制备，即可按照此处所述方案评估它们调节存活蛋白表达的能力。
细胞培养条件、体外测定dsRNA IC50值IC50
通过将多种浓度的dsRNA与表现出与存活蛋白表达或过度表达相关的病理的合适细胞系、组织或器官在体外接触，并且测定在这些浓度的dsRNA对包括，但不限于，存活蛋白病理或致病机理的多个步骤、阶段或方面诸参数的定量影响，可测定本发明的dsRNA体外IC50。可研究的代表性参数包括，例如，存活蛋白mRNA的翻译或存活蛋白的合成；对替代标记物的影响或体外可方便测量的指示潜在dsRNA治疗效果的任何其它参数。
在现有技术条件下，本领域普通技术人员有可能采用现有的基于细胞的测定法，或开发全新的体外测定法以不过过度实验来测定此处公开的dsRNA的IC50值。
蛋白质印迹对于蛋白质印迹分析，在10cm组织培养皿(Falcon，#3003)中以7.5×105个细胞/皿的密度平铺细胞。对于RT-PCR分析，按1×104个细胞/孔平铺96孔板(Corning Incorporated，#3596)。在3μl/ml OPTIMEM减血清培养基(Gibco/Invitrogen)/100nM siRNA双链体的浓度下使用Lipofectin(GIBCO/Invitrogen)转染试剂。在加入siRNA之前，Lipofectin试剂与OPTIMEM培养基温育30分钟。加入所希望量的siRNA并混合。进一步在OPTIMEM中实施1∶1稀释。细胞以1×磷酸缓冲盐水洗涤两次然后以OPTIMEM中的siRNA/Lipofectin混合物处理。在温育4小时后，以完全生长培养基替代OPTIMEM培养基。在额外16-20小时后收获细胞供蛋白质印迹或RT-PCR分析。
在温育期结束时，除去培养基并且细胞以PBS洗涤两次。通过将缓冲液直接加入平板，在加入CompleteTMMini蛋白酶抑制物片剂(Roche，#1836153)以及1mM原钒酸钠(Sigma)的RIPA缓冲液(20mMTris-HCI，pH7.4、5mM EDTA、50mM NaCl、10mM焦磷酸钠、50mM氟化钠和1％Nonidet P40)中裂解细胞。以刮取法收集裂解物，转移到微量离心管并且在4℃以14,000转/分钟离心30分钟清除细胞碎片。用BCA蛋白质测定试剂(Pierce)测定蛋白质浓度。总细胞蛋白质进行SDS-PAGE并转移至Immobilon-P膜(Millipore，#IPVH091)。用针对存活蛋白的一级抗体(R & D Systems，#AF886)和针对β-肌动蛋白的一级抗体(Sigma，#A5441)检测膜。用辣根过氧化物酶连接的抗兔Ig和抗鼠Ig抗体(Pharmacia)作为二级抗体。通过用SuperSigmal West Pico化学发光试剂(Pierce)温育膜5分钟，使抗原抗体复合物显现，随后用配置了冷CCD照相机的Fluor-S成像仪(Biorad)捕获化学发光。用Quantity One软件(Biorad)定量每份样品的目的蛋白质带。通过比较样品的存活蛋白/肌动蛋白比率与未处理对照的存活蛋白/肌动蛋白比率计算每份样品的抑制百分率。用Graph Pad Prism软件(GraphPad Software)经抑制百分数数据的非线性回归分析得到IC50。
RNA分离按推荐的方案(Qiagen)用RNeasy96试剂盒分离总RNA。简而言之，在除去生长培养基后，细胞以200μl冷PBS洗涤。洗涤后，加入RLT缓冲液100μl，将平板剧烈振荡约20秒。向每孔加入100μl 70％乙醇并且将内容物上下三次吹吸混合。然后将样品应用于置于QIAvac歧管的QIAvac顶部基座中的RNeasy96平板孔，QIAvac歧管连接真空源。应用真空30秒或直至转移完成。每孔加入80μl DNA酶I温育混合物(20mM Tris-HCl，pH8.4，2mM MgCl2，50mM KCl和来自Invitrogen的225单位/ml DNA酶I)并且在室温温育30分钟。加入缓冲液RW1(1ml/孔)并且应用真空30秒。每孔加入RPE缓冲液(1ml/孔)并且应用真空30秒。洗涤步骤用缓冲液RW1和RPE再次重复。然后平板从歧管除去并在纸巾上沾吸。然后平板放回QIAvac歧管并且应用真空10分钟。为洗脱RNA，直接向每孔的膜上加入30μl无RNA酶的水，温育1分钟并且应用真空30秒。为最大限度回收总RNA，洗脱步骤用额外的每孔30μl无RNA酶的水重复。
存活的定量通过使用ABI PRISM7900序列检测系统(Applied Biosystems)的实时定量RT-PCR测定存活蛋白和GAPDH mRNA水平的定量。向具有10μl总RNA的96孔板中加入15μl TaqMan One Step PCR Master Mix(AppliedBiosystems，#4309169)试剂(含正向引物和反向引物各100nM，以及200nM探针)实施RT-PCR。对人存活蛋白，正向PCR引物为5′GCACCACTTCCAGGGTTTATTC3′(SEQ ID NO186)，反向引物为5′TCTCCTTTCCTAAGACATTGCTAAGG3′(SEQ ID NO187)。所用的存活蛋白TaqMan探针是5′(FAM)TGGTGCCACCAGCCTTCCTGTG3′(SEQ ID NO188)(BiosearehTechnologies，Inc.)。实施例15至最后的全部实验均使用针对SEQ ID No14设计的该引物-探针组。对人GAPDA，使用Taq Man GAPDH ControlReagent Kit(Applied Biosystems，#402869)。通过比较样品的存活蛋白/GADPH的mRNA比率与未处理对照的存活蛋白/GADPH的mRNA比率计算每份样品的抑制百分率。用GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware)经抑制百分数数据的非线性回归分析得到IC50。
实施例16设计表型试验和体内研究存活蛋白抑制物的用途表型试验一旦通过此处公开的方法已经鉴定靶向存活蛋白的活性寡聚化合物，在一个或多个表型试验中进一步研究该化合物，每一个试验具有指示特定疾病状态或病症的治疗功效的的可度量的终点。
表型试验、试剂盒和供其用途的试剂为本领域的技术人员所公知，并且此处用于研究存活蛋白在健康和疾病中的作用和/或关系。可从数家商业供货商中的任何一家购买的代表性表型试验包括那些测定细胞生存力、细胞毒性、增殖或细胞存活的试验(Molecular Probes，Eugene，OR；PerkinElmer，Boston，MA)、以蛋白质为基础的试验包括酶试验(Panvera，LLC，Madison，WI；BD Bioseiences，Franklin Lakes，NJ；OncogeneResearch Products，San Diego，CA)、细胞调节、信号传导、炎症、氧化过程和凋亡(Assay Designs Inc.，Ann Arbor，MI)、甘油三酯积累(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、血管发生试验、管形成试验、细胞因子和激素试验和代谢试验(Chemicon InternationalInc.，Temecula，CA；AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。
在一个非限定性实例中，用体外研究鉴定的存活蛋白抑制物和经上述方法测定的最佳浓度的对照化合物处理经测定适合于特定表型试验的细胞(例如，挑选用于乳腺癌研究的MCF-7细胞、肥胖研究的脂肪细胞)。在治疗期结束时，通过对测定表型结果和终点的试验特异的一种或多种方法分析了经处理和未经处理的细胞。
表型终点包括细胞形式随时间或治疗剂量的变化或细胞成分例如蛋白质、脂类、核酸、激素、糖类或金属水平的变化。包括pH、细胞周期阶段、细胞摄入或排出生物学指示物的细胞状态的测量也是目标终点。
处理后细胞的基因型的分析(测量细胞的一种或多种基因的表达)也用作存活蛋白抑制物的功效和效力的指示物。在经处理或未经处理的细胞中测量了特征基因，或那些怀疑与特定的疾病状态、病症或表型相关的基因。
实施例17双链RNA(dsRNA)对人存活蛋白表达的调节根据本发明，设计了包含本发明的反义化合物和它们的互补物的一系列双链寡聚化合物以靶向存活蛋白mRNA。将dsRNA的有义链设计并且合成为反义链的反向互补物，它们的名单在表1中显示。在HeLa细胞中评估寡聚化合物。用于HeLa细胞的培养方法见于例如，www.atcc.org。
对于生长在96孔板的细胞，以200μl OPTI-MEM-1TM减少血清的培养基(Gibco BRL)洗涤孔一次，然后以130μl含有12μg/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1TM和终浓度为25nM所希望的dsRNA处理。在处理5小时后，以新鲜培养基替代原培养基。dsRNA处理16小时后收获细胞，在这个时候如上所述，分离RNA并且用RT-PCR测量靶标减少。
表1显示了dsRNA寡聚化合物的反义序列。在处理HeLa细胞之前，根据实施例16中描述的方法，通过反义和有义链的复性生成dsRNA寡聚体。靶位点由第一个(5’最)核苷酸编号显示，如在序列源(参考Genbank登录号NM 001168.1，此处引用作为SEQ ID NO14)所给出，dsRNA寡核苷酸反义链结合所述靶位点。
表1中所有化合物为dsRNA，长度为20个核苷酸，首先按5’至3’方向列出反义链(顶部链)，并且其次也按5’至3’方向列出有义链(底部链)。所有核苷为核糖并且主链键为磷酸酯(P＝O)。“靶位点”指反义链所靶向的存活蛋白mRNA中靶区域的最5’位置。
如此处所述通过实时定量PCR获得了数据。以靶向人存活蛋白mRNA的双链寡聚化合物(由于它们各自有义链杂交的反义链)处理HeLa细胞。
表1dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平
除了ISIS 339046、339047、339053、339065、339068和339072之外的所有dsRNA化合物均表现了超过45％的存活蛋白表达抑制。
在剂量反应实验中，如此处其它实施例中所述，用按每100nM寡核苷酸混合了3μg/ml LIPOFECTIN的所指示的寡核苷酸1.1nM、3.3nM、10nM和30nM处理HeLa细胞。未处理的细胞作为对照。在处理16小时后，从细胞制备RNA供随后的实时PCR分析。
用实时PCR定量人存活蛋白mRNA表达水平并且如此处其它实施例中所描述，用Ribogreen归一化基因靶标量。数据为来自两次实验的平均数并且在表2中显示。
双链体两条链的身份由下划线分开显示，首先显示反义链(反义链_有义链)。
表2dsRNA寡聚化合物对人存活蛋白mRNA水平的抑制剂量反应
如表2所显示，受试化合物以浓度依赖方式抑制HeLa细胞中人存活蛋白mRNA的表达。
实施例18具有5’-磷酸酯帽的双链RNA(dsRNA)对人存活蛋白表达的调节根据本发明，设计了包含示于表1中(ISIS 339045-339073)中、均带有5’末端磷酸酯基修饰的反义化合物和其互补物的一系列双链寡聚化合物以靶向存活蛋白mRNA。对应的dsRNA化合物为ISIS 341201-341229(表3)。将dsRNA有义链设计并且合成为反义链的反向互补物，它们的名单在表2中显示。在HeLa细胞中评估寡聚化合物。用于HeLa细胞的培养方法见于例如，www.atcc.org。
对于生长在96孔板的细胞，以200μl OPTI-MEM-1TM减少血清的培养基(Gibco BRL)洗涤一次，然后以130μl含有12μg/mlLIPOFECTINTM(Gibco BRL)的OPTI-MEM-1TM和终浓度为25nM所希望的dsRNA处理。在处理5小时后，以新鲜培养基替代原培养基。dsRNA处理16小时后收获细胞，此时如上所描述，分离RNA并且用RT-PCR测量靶标减少。
表3中显示了dsRNA寡聚化合物。在处理HeLa细胞之前，根据实施例17中所述方法，通过反义和有义链的复性生成dsRNA寡聚体。靶位点由第一个(5’最)核苷酸编号显示，如序列源参考(Genbank登录号NM_001168.1，此处引用作为SEQ ID NO14)所给出，该dsRNA寡核苷酸反义链结合靶位点。
表3中所有化合物均为寡核苷酸，长度为20个核苷酸，首先列出反义链，并且其次列出有义链(底部链)，两者均按5’至3’方向。表3中的化合物具有磷酸酯(P＝O)主链键并且在每条链中也包含了末端5’磷酸酯帽。表3中的化合物为平末端siRNA。
如此处其它实施例中所描述，通过实时定量PCR获得了数据。以靶向人存活蛋白mRNA的双链寡聚化合物处理HeLa细胞。
表3具有55’磷酸酯帽的dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平
除了ISIS 341203、341209、341221、341224和341225之外的所有dsRNA化合物均表现出大于40％存活蛋白表达抑制。这些数据表明在某些靶位点，具有5’磷酸酯的双链化合物在抑制存活蛋白表达方面表现了更强的效力(比较表1和3)。
实施例19比较靶向存活蛋白mRNA相同位点的siRNA构建体根据本发明，研究了ISIS 339048序列改变对HeLa细胞中人存活蛋白mRNA抑制的影响。ISIS 343867(5′-UUUGAAAAUGUUGAUCUCC-3′SEQ ID NO81)是平末端siRNA的反义链，结合至与ISIS 339048所结合的存活蛋白mRNA的相同位点。差异在于ISIS 343867是缺少ISIS339048的5’末端腺嘌呤的19聚体化合物。SIS341881(UUUGAAAAUGUUGAUCUCCTT；SEQ ID NO82)是规范siRNA反义链，结合至与ISIS 339048所结合的存活蛋白mRNA的相同位点。差异在于ISIS 341881在3’末端含有dTdT(脱氧胸苷-脱氧胸苷)(“dTdT”突出端”)。SIS 343868具有序列5’-GGAGAUCAACAUUUUCAAA-3’(SEQ IDNO83)，并且是对应于ISIS343867的有义链。ISIS 341880(SEQ ID NO84)是对应于ISIS341881的有义链。在表4中显示了构建体，首先显示反义链，随后为有义链，两者都为5’至3’方向。在表4中显示了存活蛋白siRNA构建体的序列，并且剂量反应结果在表5中显示。
表4在HeLa细胞中以剂量反应实验测试siRNA构建体对人存活蛋白mRNA表达的抑制
表5靶向存活蛋白mRNA相同位点的siRNA寡聚化合物对人存活蛋白mRNA水平的抑制剂量反应
如表5中所显示，经测试的化合物以剂量依赖方式抑制HeLa细胞中人存活蛋白mRNA表达。ISIS 343867和ISIS 341881在几乎最低的剂量下更为有效地抑制存活蛋白mRNA水平，提示平末端的19聚体siRNA或在3’末端带有dTdT修饰的规范的21聚体siRNA可能是最初平末端20聚体siRNA ISIS 339048的有利修饰物。
这三种化合物的IC50值(nM)如下平末端siRNA(20聚体)339048_339078，0.28nM；平末端siRNA(19聚体)343867_343868，0.19 nM和规范siRNA 341881_341880，0.15nM将IC50定义为与未处理对照比较，导致mRNA(或蛋白)表达50％抑制的寡聚化合物的浓度。由这些数据显示，规范siRNA和平末端siRNA(19聚体)二者的表现均比平末端siRNA(20聚体)好得多。
靶向人存活蛋白的额外的平末端构建体经修饰的化合物
设计了靶向人存活蛋白(GenBank登录号NM_01168.1；SEQ ID NO14)的一系列siRNA化合物并且以5’至3’方向在表6中显示。
表6靶向人存活蛋白的siRNA化合物
在表6中序列的修饰如下ISIS 346272全部为核糖，全部为P＝O键。
ISIS 346279-346281、346286、346287全部为P＝S键。
ISIS 346282-346284、346289和346290交替为P＝O/P＝S键，以P＝O开始。
ISIS 346291、346292、346294、346295和346296；交替为P＝S/P＝O键；以P＝S开始。
ISIS 348310全部是核糖，具有P＝O主链。
ISIS 352505在5、8、11、14和17-19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主链。
ISIS 352506在6、7、10、11和17-19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主链。
ISIS 352507在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主链。
ISIS 352508在5、8、11和14位置上是2′-MOE；在17-19位置上是2′-O-甲基。P＝O主链。
ISIS 352509在4、9和18位置上是2′-MOE。P＝O主链。
ISIS 352510在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位置上是2′-MOE。P＝O主链。
ISIS 352511在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上是2′-MOE。P＝O主链。
ISIS 352512在每个位置上是2′-O-甲基，P＝O主链。
ISIS 352513在2-18位置上是2′-O-甲基。P＝O主链。
ISIS 352514在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上是2′-MOE，P＝O主链。
ISIS 352515在15-19位置上是2′-O-甲基核糖。P＝O主链。
ISIS 352516在1-7键是P＝S连接体，在8-18键是P＝O连接体。
ISIS 353537在1-3和17-19位置上是4′-硫代核糖，P＝O主链。
ISIS 353538在3、9、12和17-19位置上是4′-硫代核糖，P＝O主链。
ISIS 353539在1-3、9和12位置上是4′-硫代核糖；在17-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主链。
ISIS 353540在1-3位置上是4′-硫代核糖；在17-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主链。
ISIS 355710在1-5位置上是2′-ara-氟-2 ′-脱氧核糖；在15-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主链。
ISIS 355711在1-5、8、9和12-16位置上是2′-ara-氟-2′-脱氧核糖；在6、7、10、11和17-19位置上是2′-O-甲基核糖，P＝O主链。
ISIS 355712在5、8、11、14位置上是LNA，在17-19上是2′-O-甲基。P＝O主链。
ISIS 355713交替的2′-O-甲基核糖/2′-ara-氟-2′-脱氧核糖，在位置1上以2′OMe开始。P＝O主链。
ISIS 355714交替的2′-O-甲基核糖/2′-ara-氟-2′-脱氧核糖，在位置1上以2′-ara-氟开始。P＝O主链。
ISIS 355715在4、9、18位置上是LNA。P＝O主链。
ISIS 355716在1、2、6、11、20位置上是LNA。P＝O主链。
实施例20通过单链RNAi化合物调节人存活蛋白表达在人脐静脉内皮细胞(HBVEC)中评估了一系列单链寡聚化合物(asRNA)抑制人存活蛋白的能力。用于HBVEC的培养方法见于例如，www.atcc.org。
表7中显示了asRNA寡聚化合物的序列。靶位点由最前端第一个(5’最)核苷酸编号显示，如在序列源参考(Genbank登录号NM 001168.1，此处引用作为SEQ ID NO14)所给出，asRNA寡核苷酸结合该靶位点。
在表7中的所有化合物均为寡核糖核苷酸，长度为20核苷酸，具有全程的硫代磷酸酯主链键，并且在5’末端具有末端磷酸酯，并且所有化合物均以5’至3’方向描绘。
如此处其它实施例中所述，通过实时定量PCR获得了数据。
表7通过asRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平
如表7中所显示，所有asRNA化合物均表现了至少40％存活蛋白表达的抑制。
实施例21使用针对人存活蛋白的dsRNA构建体抑制HeLa细胞中存活蛋白mRNA的表达如以上所述，在HeLa细胞中使用人存活蛋白引物-探针对(SEQ ID186-188)测试了多种dsRNA构建体以测定在19聚体ISIS 343867(SEQ IDNO81)，20聚体339048(SEQ ID NO23)中的PS取代效应，以及测定2′-O-甲基(2′-OMe)，2′-氟基(2′-F)，2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)和4′-硫(4′-S)化学的效应。在表8和9中显示了结果。第一个ISIS编号为反义链，第二个ISIS编号为有义链。
表8平末端siRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平在19聚体中的PS取代效应
这些数据显示表明19聚体平端磷酸二酯siRNA在抑制存活蛋白表达方面更有效，并且具有低于为其20聚体对等相应物IC50的10倍1/10的IC50(比较行A和行B)。而且，当主链键全部为硫代磷酸酯键替代时，测试的化合物丧失以IC50所测量的提高的效力丧失了。然而，减少靶减少的能力仍然维持(比较行A和行BC)。
同时也表明将磷酸二酯键以交替出现重新引入反义链中导致功效恢复，如通过降低的IC50值所测量，但是不能达到全部P＝O主链的水平(比较行D和行H)。
最后，当每一条链中交替的磷酸二酯/硫代磷酸酯键以相反对齐(一条链中P＝O，相反另一条链中为P＝S)时对IC50值和表达水平具有最强的影响，获得比天然最佳的构建体更好的值(比较行I和行A)。
表9平末端siRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平在20聚体中的PS取状效应
这些数据表明，与19聚体相比，平末端的20聚体对两条链中的硫代磷酸酯主链修饰具有更强的耐受性，全部P＝S的20聚体的IC50值两条链中全部P＝O的20聚体的IC50值相当(比较行B和C)。然而，两种构建体均未达到用19聚体观察到的IC50值(比较行B和C与行A)。
令人惊奇地，相反对齐的(一条链中P＝O，相反另一条链中为P＝S)交替核苷酸间键能够降低IC50至用19聚体天然P＝O构建体观察到的IC50(比较行I和A)。
糖的化学修饰的效应设计了一系列平末端siRNA以研究糖修饰对双链化合物抑制人存活蛋白mRNA表达能力的影响。如此处其它实施例中所述，在HeLa细胞中实施了研究，并且通过RT-PCR测定mRNA水平、如下为对化合物的修饰ISIS 352511包含在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上的2′-O-甲基修饰(下划线)。
ISIS 352512在每个2’位点上包含2′-O-甲基修饰(下划线)。
ISIS 355714包含在1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位置上2′氟基修饰(粗体)；并且在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上包含2′-O-甲基修饰。
ISIS 352514在2、4、6、8、10、12、14、16和18位置上包含交替的2′-MOE修饰。
所有其它化合物为天然RNA化合物。在表10中显示结果。
表10通过siRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平糖修饰的影响
这些数据表明含有2’氟和2’OMe交替基序的双链化合物是抑制人存活蛋白表达的最佳构建体。
实施例22使用针对人存活蛋白的dsRNA构建体在HeLa细胞中的剂量反应实验在剂量反应实验中，如此处其它实施例中所述，用每100nM寡核苷酸混合了3μg/ml LIPOFECTIN的所指示的dsRNA寡核苷酸0.02、0.2、2.0和20.0nM处理HeLa细胞。未处理的细胞作为对照。在处理16小时后，从细胞制备RNA供随后实时PCR分析。
用实时PCR定量人存活蛋白mRNA表达水平并且如此处其它实施例中所描述，用Ribogreen归一化基因靶量。数据为来自两次实验的平均数并且在表11中显示。首先显示反义链的Isis编号，然后为有义链的Isis编号(反义_有义)。
表11dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平剂量反应
如表11中所显示，众多dsRNA化合物以剂量依赖方式抑制人存活蛋白mRNA在HeLa细胞中的表达实施例23使用针对人存活蛋白的dsRNA构建体在HeLa细胞中的剂量反应实验在剂量反应实验中，如此处其它实施例中所描述，用每100nM寡核苷酸混合了3μg/ml LIPOFECTIN的所指示的寡核苷酸0.014nM、0.04nM、0.12nM、0.37nM、1.11nM、3.33nM、10nM和30nM处理HeLa细胞。未处理的细胞作为对照。在处理16小时后，从细胞制备RNA供随后实时PCR分析。
用实时PCR定量人存活蛋自mRNA表达水平并且如此处其它实施例中所描述，用Ribogreen归一化基因靶量。数据为来自两次实验的平均数并且在表12中显示。首先显示反义链的Isis编号，然后为有义链的Isis编号(反义_有义)。
表12dsRNA寡聚化合物抑制人存活蛋白mRNA水平剂量反应
如表12中所显示，多数dsRNA化合物以剂量依赖方式抑制在HeLa细胞中人存活蛋白mRNA的表达实施例24在U-87MG细胞中剂量依赖性抑制存活蛋白mRNA表达用上述的方法在U-87MG细胞中测试了双链化合物抑制人存活蛋白mRNA表达的能力。在0.0019nM、0.0096nM、0.048nM、0.24nM、1.2nM、6.0nM、30.0nM和150.0nM浓度下，测试了多种靶向人存活蛋白的dsRNA构建体。结果总结于表13中。首先显示反义链的Isis编号，然后为有义链的Isis编号(反义_有义)表13dsRNA化合物剂量依赖性抑制人存活蛋白mRNA表达。
如表13中所显示，多数dsRNA化合物以剂量依赖形式抑制U-87MG细胞中人存活蛋白mRNA的表达。
实施例25规范siRNA寡核苷酸抑制存活蛋白设计了一系列靶向人存活蛋白的规范siRNA。对存活蛋白特异并且如下所描述的dsRNA诸序列中的每条序列包含RNA寡核苷酸双链体(未显示)每条链的3’末端端两个脱氧胸苷核苷酸。由Dharmacon Research Inc实施基因特异性siRNA的合成、双链体形成及纯化。在表中，“位置”指dsRNA反义链结合的基因位置。将表中的每条序列这样列出使得反义链(顶部链)按5’至3’方向书写；其互补有义链(底部链)也按5’至3’方向书写。
表14设计靶向人存活蛋白的规范siRNA寡核苷酸
当用上述的RT-PCR和定量蛋白质印迹测定法测试存活蛋白mRNA的抑制时，化合物U17、U20、U23、U36、U48和U54表现出低于100nM的IC50。
在定量RT-PCR分析和蛋白质印迹分析中化合物U17都表现出强烈的活性，并且因此特别优选用于本文描述的适应症。
实施例26靶向存活蛋白的额外的双链化合物的IC50值表15和16汇总了使用多种dsRNA并使用这里所述方法得到的IC50值。测试的构建体包含5’至3’方向的反义链，和5’至3’方向的有义链。在表15中，“D”为剂量反应(mRNA水平)，“W”为蛋白质印迹。所有核苷间键均为磷酸二酯，除非标注了指示硫代磷酸酯键的小写“s”。
表15靶向人存活蛋白的dsRNA构建体的IC50数据
表16针对人存活蛋白的dsRNA的IC50值
实施例27在人成胶质细胞瘤异种移植模型中测量抗肿瘤活性在本领域公知的动物模型中测试了此处所述一种或多种寡聚化合物，包括dsRNA化合物的抗肿瘤活性。两种此类动物模型为(1)U-87MG人成胶质细胞瘤异种移植肿瘤模型(Kiaris H，Schally AV，Varga JL，Antagonists of growth hormone-releasing hormone inhibit the growth ofU-87MG human glioblastoma in nude mice Neoplasia。2000 May-Jun；2(3)242-50)和YUSAC-2人黑素瘤异种移植肿瘤模型(Grossman D，KimPJ，Schechner JS，Altieri DC，Inhibition of melanoma tumor growth invivo by survivin targeting.Proc Natl Acad Sci USA.2001 Jan 16；98(2)635-40)。每组使用共计10CD1 nu/nu(Charles River)小鼠。为了移植，肿瘤细胞经胰酶消化，在PBS中洗涤，并且在PBS中以6×107个细胞/ml(U-87MG)重悬浮和在DMEM中以4×107个细胞/ml(YUSAC-2)重悬浮。仅仅在植入前，照射动物(450TBI)并且在Matrigel(1∶1)中混合细胞。在左后肋中皮下(s.c.)注射在0.2ml体积中的总计6×106个肿瘤细胞(U-87MG)和4×106(YUSAC-2)个肿瘤细胞。肿瘤细胞植入3天后，开始以测试寡聚化合物(在0.9％NaCl中溶解，注射级)或错配的对照寡核苷酸(在0.9％NaCl中溶解)或赋形剂(0.9％NaCl)治疗。对于U-87MG研究，将0.2ml体积的化合物每隔一天共约12剂腹膜内(i.p)施用；对于YUSAC-2研究，将0.2ml体积的化合物每隔一天共约13剂静脉内(i.v)施用。每星期两次测量肿瘤长度和宽度，用式肿瘤体积＝(L×W2)×0.536计算肿瘤体积。以肿瘤体积对每个治疗组肿瘤植入后的天数作图。
当与用赋形剂或25mg/kg错配对照寡核苷酸治疗的携带肿瘤的动物相比时，一种或多种寡聚化合物的治疗延缓了人成胶质细胞瘤和黑素瘤的生长。
实施例28在小鼠血浆中交替的2’-O-甲基/2’-氟siRNA构建体的稳定性用类似以前所描述的那些方法(Leeds，J.M.，等人，1996，Anal.Biochem.，235，36-43；Geary，R.S.等人，1999，Anal.Biochem.，274，241-248)的提取和毛细管电泳方法分析了来自经稀释的小鼠血浆的完整双链体RNA。来自于3-6个月龄的雌性Balb/c(Charles River Labs)小鼠的经肝素处理的小鼠血清从-80℃解冻，并且以磷酸缓冲盐水(140mM NaCl，3mM KCl，2mM磷酸钾，10mM磷酸钠)稀释至25％(v/v)。将浓度为1001μM的约10nmol预复性的siRNA加至25％血浆中，并且在37℃温育0、15、30、45、60、120、180、240、360和420分钟。在指示的时间取出等分试样，以EDTA处理至终浓度为2mM，并且在0℃的冰上放置直至通过毛细管凝胶电泳(Beckman P/ACE MDQ-UV，具有eCap DNACapillary tube)分析。测量siRNA双链体峰的面积并且用来计算剩余的完整siRNA百分率。将浓度为2.5mM的腺苷三磷酸(ATP)加入每次的注射液中作为内部校正标准。零时间点取自在磷酸缓冲盐水中稀释siRNA随后毛细管电泳时。将完整siRNA百分率对时间作图，以便计算假一级半寿期。在表17中显示结果。
表17在小鼠血浆中交替2’-O-甲基/2’-氟平端siRNA构建体的稳定性
反义链ISIS 353538在3、8、11、17-19位置上包含4′硫修饰，并且与未经修饰的有义RNA链配对。
反义链ISIS 355713包含对糖的交替2′O甲基/2′F修饰并且与具有交替的2′F/2′O甲基修饰的有义链配对。所述交替修饰为相反对齐，反义链在1位上经2’Ome修饰而有义链在1位经2’F修饰。明显地，交替的2′-O-甲基/2′-氟构建体保持相对未变并且在血清中稳定。
根据前面的描述，除此处所描述那些方案以外，本发明的多种修改方案对本领域的技术人员将是显而易见的。这些修改方案也将落入附带的权利要求的范围内。本申请中引用的每篇文献在本文中全文引用作为参考。
序列表<110>ISIS药物公司伊莱利利公司<120>存活蛋白表达的调节<130>ISIS0134-500WO(BIOL0042WO)<160>233<170>FastSEQ for Windows版本4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>1tccgtcatcg ctcctcaggg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>2atgcattctg cccccaagga 20<210>3<211>14796<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人(H.sapien)<400>3tctagacatg cggatatatt caagctgggc acagcacagc agccccaccc caggcagctt 60gaaatcagag ctggggtcca aagggaccac accccgaggg actgtgtggg ggtcggggca 120cacaggccac tgcttccccc cgtctttctc agccattcct gaagtcagcc tcactctgct 180tctcagggat ttcaaatgtg cagagactct ggcacttttg tagaagcccc ttctggtcct 240aacttacacc tggatgctgt ggggctgcag ctgctgctcg ggctcgggag gatgctgggg 300gcccggtgcc catgagcttt tgaagctcct ggaactcggt tttgagggtg ttcaggtcca 360ggtggacacc tgggctgtcc ttgtccatgc atttgatgac attgtgtgca gaagtgaaaa 420ggagttaggc cgggcatgct ggcttatgcc tgtaatccca gcactttggg aggctgaggc 480
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<223>寡聚化合物
<400>123cugugcucu guuuugucu 19<210>124<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>124agacaaaaca ggagcacag19<210>125<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>125guggcaccag aggugcuuc 19<210>126<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>126gaagcaccuc uggugccac19<210>127<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>127gaaggcagug ucccuuuug19<210>128<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>128caaaagggacc acugccuuc 19<210>129<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>129gaugcaugac uugugugug 19<210>130<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>130cacacacaag ucaugcauc 19<210>131<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>131uggagacaga gucccuggc 19<210>132<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>132gccagggacu cugucucca 19<210>133<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<100>133cauggcuuucc uuauuuugu 19<210>134<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>134acaaaauaag aaagccaug 19<210>135<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>135auguuaauuc acagaauag 19<210>136<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>136cuauucugug aauuaacaa 19<210>137<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>137cuacaauuaa aacuaagca 19<210>138<211>19
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>138ugcuuaguuu uaauuguag 19<210>139<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>139acuaaagcaca aagccauuc19<210>140<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>140gaauggcuuu gugcuuagu 19<210>141<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>141uagagugaua ggaagcguc 19<210>142<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>142gacgcuuccu aucaacucua19
<210>143<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>143gcgucuggca gauacuccu 19<210>144<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>144aggaguaucu gccagacgc 19<210>145<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>145aaggcagugg ccuaaaucc 19<210>146<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>146ggauuuaggc cacugccuu 19<210>147<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>147
ggcaguggccuaaauccuu 19<210>148<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>148aaggauuuag gccacugcc 19<210>149<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>149augacuuggc ucgaugcug19<210>150<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>150cagcaucgag ccaagucau19<210>151<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>151ccuucacauc ugucacguu19<210>152<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>152aacgugacag augugaagg 19<210> 153<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>153uucacagaau agcacaaac 19<210> 154<211>19<212> RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>154guuugugcua uucugugaa 19<210>155<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>155gccugcaccc cggagcgga 19<210>156<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>156uccgcuccgg ggugcaggc 19<210>157<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<400>157cauaaaaagc auucguccg 19<210>158<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>158cggacgaaug cuuuuuaug 19<210>159<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>159agcagcuggc ugccaugga 19<210>160<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>160uccauggcag ccagcugcu 19<210>161<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>161gcugcaccac uuccagggu 19<210>162<211>19<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>162acccuggaag uggugcagc 19<210>163<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>163uucccuggug ccaccagcc 19<210>164<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>164ggcugguggc accagggaa 19<210>165<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>165ugggccccuu agcaauguc 19<210>166<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>166gacauugcua aggggccca 19<210>167
<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>167aggaaaggag aucaacauu 19<210>168<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>168aauguugauc uccuuuccu 19<210>169<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>169uuagauguuu caacugugc 19<210>170<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>170gcacaguuga aacaucuaa 19<210>171<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>171caguuggcugc uucucucuc19
<210>172<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>172gagagagaag cagccacug 19<210>173<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>173cucauuuuug cuguuuuga 19<210>174<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>174ucaaaacagc aaaaaugag 19<210>175<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>175uguucgcgug ggcagagcc 19<210>176<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>176ggcucugccc acgcgaaca 19<210>177<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>177ugugucugga ccucauguu 19<210>178<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>178aacaugaggu ccagacaca 19<210>179<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>179cacaguccug aguguggac 19<210>180<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>180guccacacuc aggacugug 19<210>181<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>181uggacuuggc aggugccug 19<210>182<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>182caggcaccug ccaagucca 19<210>183<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>183ucugagcugc agguuccuu 19<210>184<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>184aaggaaccug cagcucaga 19<210>185<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>185gugccuccuc agaggacag 19<210>186<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<400>186cuguccucug aggaggcac 19<210>187<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>187guuguugugu uuuuuuguu 19<210>188<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>188aacaaaaaaa cacaacaac 19<210>189<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>189acuaagcaca aagccauuc 19<210>190<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<100>190gaauggcuuu gugcuuagu 19<210>191<211>19
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>191gccauucuaa gucauuggg 19<210>192<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>192cccaaugacu uagaauggc 19<210>193<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>193gucauugggg aaacggggu 19<210>194<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>194accccguuuc cccaaugac 19<210>195<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>195cggggugaac uucaggugg19
<210>196<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>196ccaccugaag uucaccccg 19<210>197<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>197gcccccugcc uggcagccc 19<210>198<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>198gggcugccag gcagggggc 19<210>199<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>199guccgcccag guccccgcu 19<210>200<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>200
agcggggacc ugggcggac 19<210>201<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>201gucuggcgua agaugaugg 19<210>202<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<100>202ccaucauucuu acgccagac19<210>203<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>203gaugauggau uugauucgc 19<210>204<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>204gcgaaucaaa uccaucauc 19<210>205<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>205ccucuggagg ucaucucgg 19<210>206<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>206ccgagaugac cuccagagg19<210>207<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>207auuugaaucg cgggacccg 19<210>208<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>208cgggucccgc gauucaaau 19<210>209<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>209cggcaugggu gccccgacg 19<210>210<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚化合物<400>210cgucggggca cccaugccg 19<210>211<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>211ggcccagugu uucuucugc 19<210>212<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>212gcagaagaaa cacugggcc 19<210>213<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>213ugcagcgggu gcugcuggu 19<210>214<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>214accagcagca cccgcugca 19<210>215<211>19<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>215accaggugag aagugaggg 19<210>216<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>216cccucacuuc ucaccuggu 19<210>217<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>217uugccacugc ugugugauu 19<210>218<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>218aaucacacag caguggcaa 19<210>219<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>219cuggccgcuc cucccucag 19<210>220
<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>220cugagggagg agcggccag 19<210>221<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>221cccagugagc cgcggggca 19<210>222<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>222ugccccgcgg cucacuggg 19<210>223<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>223gcugcaggcc gugugucug 19<210>224<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>224cagacacacg gccugcagc 19
<210>225<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>225cauagagcug cagggugga 19<210>226<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>226uccacccugc agcucuaug 19<210>227<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>227auuguuacag cuucgcugg 19<210>228<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>228ccagcgaagc uguaacaau 19<210>229<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物
<400>229agaaauaaaa agccuguca 19<210>230<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚化合物<400>230ugacaggcuu uuuauuucu 19<210>231<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>231gcaccacttc cagggtttat tc 22<210>232<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>232tctcctttcc taagacattg ctaagg 26<210>233<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR探针<400>233tggtgccacc agccttcctg tg 2权利要求
1.具有第一链和第二链的双链化合物，其中所述第一链与编码人存活蛋白(SEQ ID NO14)的核酸分子互补；所述第二链与所述第一链互补；所述第一链和第二链每条链长度为8-80个核碱基；并且该双链化合物抑制人存活蛋白的表达。
2.权利要求1的双链化合物，其中所述链的一条或两条链长度为10-50个核碱基。
3.权利要求1的双链化合物，其中所述链的一条或两条链长度为12-30个核碱基。
4.权利要求1的双链化合物，其中所述链的一条或两条链长度为12-24个核碱基。
5.权利要求1的双链化合物，其中所述链的一条或两条链长度为19-23个核碱基。
6.权利要求1-5任意一项的双链化合物，其中第一链和编码人存活蛋白的核酸分子之间的互补性为至少70％。
7.权利要求1-5任意一项的双链化合物，其中第一链和编码人存活蛋白的核酸分子之间的互补性为至少80％。
8.权利要求1-5任意一项的双链化合物，其中第一链和编码人存活蛋白的核酸分子之间的互补性为至少90％。
9.权利要求1-5任意一项的双链化合物，其中第一链和编码人存活蛋白的核酸分子之间的互补性为至少95％。
10.权利要求1的双链化合物，其中第一链键合第二链。
11.权利要求10的双链化合物，其中键为共价的。
12.权利要求10的双链化合物，其中键经由核酸连接体。
13.权利要求10的双链化合物，其中两条链为自身互补的并且形成发夹结构。
14.权利要求5的双链化合物，该双链化合物为siRNA，其中所述siRNA包含所述第一和第二链之间的中央互补部分和在所述第一和第二链之间任选地互补的末端部分。
15.权利要求14的siRNA，其中末端部分是位于每条链的3’或5’末端的长度为1-6个核碱基的突出端。
16.权利要求14的siRNA，该siRNA为规范siRNA，其中所述第一和第二链之间的中央互补部分的长度为19个核碱基并且末端部分由dTdT的3’突出端组成。
17.权利要求16的规范siRNA，其包含化合物U17、U20、U23、U36、U48或U54。
18.权利要求17的规范siRNA，其包含化合物U17。
19.权利要求5的双链化合物，该双链化合物为平末端siRNA。
20.权利要求19的平末端siRNA，该平末端siRNA靶向人存活蛋白(SEQ ID NO14)的3’UTR。
21.权利要求1-14任意一项的化合物，该化合物经化学修饰。
22.权利要求21的化合物，其中化学修饰针对糖、核碱基或核苷间键。
23.权利要求22的化合物，其中针对糖的修饰为2’修饰。
24.权利要求23的化合物，其中2’糖修饰选自2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-甲基、锁定核酸(LNA)或2’-氟修饰。
25.权利要求23的化合物，其中2’修饰为2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)。
26.权利要求23的化合物，其中2’修饰为2’-O-甲基。
27.权利要求23的化合物，其中2’修饰为2’-F。
28.权利要求23的化合物，其中糖的2’修饰导致二环糖。
29.权利要求28的化合物，其中二环修饰为锁定核酸(LNA)。
30.权利要求22的化合物，其中针对糖的修饰为4’-硫代。
31.权利要求21的化合物，其包含两种或两种以上化学上不同的糖修饰。
32.权利要求22的化合物，其包含化学修饰的核碱基。
33.权利要求32的化合物，其中所述经修饰的核碱基是5’-甲基胞苷。
34.权利要求22的化合物，其包含至少一种核苷间键修饰。
35.权利要求34的化合物，其包含交替的硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键。
36.权利要求21的化合物，其包含混合的硫代磷酸酯和磷酸二酯键。
37.权利要求21的化合物，该化合物为缀合物。
38.权利要求1的化合物，其包含选自硫代磷酸酯键、2’-氟、2’-O-甲基和4’-硫代的一种或多种修饰。
39.权利要求19的平末端siRNA，该平末端siRNA的长度为19个核碱基。
40.权利要求39的平末端siRNA，该平末端siRNA在每条链中具有交替的PO/PS核苷间键，其中所述键为相反对齐。
41.权利要求39的平末端siRNA，该平末端siRNA在每条链中具有交替的PO/PS核苷间键，其中所述键为相同对齐。
42.权利要求19的平末端siRNA，该平末端siRNA的长度为20个核碱基。
43.权利要求42的平末端siRNA，该平末端siRNA在每条链中具有交替的PO/PS核苷间键，其中所述键为相反对齐。
44.权利要求42的平末端siRNA，该平末端siRNA在每条链中具有交替的PO/PS核苷间键，其中所述键为相同对齐。
45.权利要求19的平末端siRNA，该平末端siRNA的长度为21个核碱基。
46.权利要求19的平末端siRNA，该平末端siRNA的长度为22个核碱基。
47.权利要求19的平末端siRNA，该平末端siRNA的长度为23个核碱基。
48.权利要求15的平末端siRNA，其中所述末端突出端部分位于一条所述链的一个5’末端。
49.权利要求15的siRNA，其中所述末端突出端部分位于一条所述链的一个3’末端。
50.权利要求14的siRNA，其中中央互补部分的长度为19个核碱基。
51.权利要求14的siRNA，其中中央互补部分的长度为20个核碱基。
52.权利要求14的siRNA，其中中央互补部分的长度为21个核碱基。
53.权利要求14的siRNA，其中中央互补部分的长度为22个核碱基。
54.权利要求14的siRNA，其中中央互补部分的长度为23个核碱基。
55.药物组合物，其包含权利要求1-54任意一项的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
56.权利要求1-54任意一项的化合物的药学可接受的盐。
57.权利要求56的药学可接受的盐，其为钠盐。
58.权利要求1的双链化合物，该双链化合物具有不大于1nM的IC50。
59.权利要求1的双链化合物，该双链化合物具有不大于2nM的IC50。
60.权利要求1的双链化合物，该双链化合物具有不大于5nM的IC50。
61.修饰编码人存活蛋白(SEQ ID NO14)的核酸的方法，该方法包括将编码人存活蛋白的核酸分子与权利要求1-54任意一项的化合物接触，从而所述编码人存活蛋白的核酸分子受到修饰。
62.权利要求61的方法，其中所述修饰的特征为切割所述编码人存活蛋白的核酸分子。
63.抑制细胞或组织中存活蛋白表达的方法，该方法包括将所述细胞或组织与权利要求1-54任意一项的化合物接触。
64.治疗与存活蛋白表达或过量表达相关的疾病的方法，该方法包括对动物，尤其对人施用有效量的权利要求1-54任意一项的化合物。
65.权利要求64的方法，其中疾病为癌。
66.权利要求65的方法，其中癌选自肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌和非霍奇金淋巴瘤。
67.长度为8至80个核碱基的单链RNAi寡核苷酸，该单链RNAi寡核苷酸与编码人存活蛋白(SEQ ID NO14)的核酸分子特异杂交并且通过RNAi反义机制发挥作用而抑制所述编码人存活蛋白的核酸分子的表达。
68.权利要求67的单链RNAi寡核苷酸，其长度为19至23个核碱基。
69.权利要求68的单链RNAi寡核苷酸，其为反义RNA。
70.权利要求67的单链RNAi寡核苷酸，其经化学修饰。
71.权利要求70的单链RNAi寡核苷酸，其中所述修饰针对核碱基、糖或核苷间键。
全文摘要
提供了调节存活蛋白表达的化合物和组合物。通过RNAi反义作用机制起作用的化合物例证的化合物包括双链和单链构建体，以及siRNA、规范siRNA、平末端siRNA和单链反义RNA化合物。还提供了使用这些化合物调节存活蛋白表达和治疗与存活蛋白表达相关的疾病的方法。
文档编号A61K48/00GK1984921SQ200480015280
公开日2007年6月20日 申请日期2004年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者B·巴特, B·K·帕泰特, E·斯韦兹 申请人:Isis 药物公司, 伊莱利利公司