蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细胞中的用途
【专利摘要】本发明提供了蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细胞中的用途，在存在蛋白激酶抑制剂时，对非神经细胞进行培养，不需要使用转录因子，即能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞。
【专利说明】蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细胞中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神 经细胞中的用途，更具体地，涉及蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细胞中的用途、 制备神经细胞的方法、用于制备神经细胞的试剂盒、试剂盒在从非神经细胞制备神经细胞 中的用途、神经细胞或其衍生物、神经细胞或其衍生物在制备药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 中枢神经系统紊乱（CNS)疾病，包括老年痴呆症（Alzheimer' s Disease， AD)、帕金森病（Parkinsin' s Disease, Η))、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)、多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS)和脑白质营养不良 (Leukodystrophies)等，在全世界范围内，CNS疾病影响数百万人的健康，而目前大部分 CNS疾病仍没有有效的治疗方法。在非人灵长类动物和啮齿动物中，神经细胞移植已经被 证明是一种非常有前景的治疗CNS疾病的方法。然而，细胞治疗要求高质量且数量庞大的 神经细胞，但神经细胞的来源有限。在过去的二十年，已有多种方法用于在体外制备神经细 胞，包括从人胚胎干细胞（hESC)、诱导多能干细胞（hiPSC)和体细胞转化获得神经细胞。但 目前将制备获得的神经细胞用于细胞移植仍存在多种限制，例如，从hESC转化获得的神经 细胞由于存在少量未转化的hESC而存在致瘤危险，同时由于异体移植而存在免疫排斥问 题，hiPSC虽然可以从特定患者获得而减轻免疫排斥问题，但其和hESC-样，存在安全性问 题。
[0003] 最近，从体细胞直接转化获得神经细胞吸引了众多研究者的注意。在2010年， Wernig研究组首先提出采用转录因子可以将纤维细胞直接转化为神经细胞。随后研究者 证实了多种多样的神经因子和微RNAs可以用于诱导纤维细胞-神经细胞转化。最新的报 道表明过表达转录因子可以诱导老鼠纤维细胞重编程为能产生髓鞘的少突胶质前体细胞 (OPCs)。由此，在疾病模型和细胞治疗的发展中，直接纤维细胞-OPCs转化成为了一种可替 换hESC/hiPSC技术的方法。直接纤维细胞-OPCs转化具有以下优点：不需要制备、扩增、分 化多能细胞的时间，诱导获得的有丝分裂后期的神经细胞具有较低的致瘤性和畸胎瘤形成 可能。因而，直接从纤维细胞转化获得的神经细胞适合用于自体移植。然而，目前报道的从 纤维细胞直接转化神经细胞的方法中均需要使用转录因子，这将使得转化周期较长，且安 全性较差。
[0004] 因而，目前关于体外制备神经细胞的方法仍有待改善。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 一个目的在于提出一种采用蛋白激酶抑制剂有效制备获得安全性高、适于自体移植的神经 细胞的手段。
[0006] 在本发明的第一方面，本发明提供了蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细 胞中的用途。发明人惊奇地发现，在存在蛋白激酶抑制剂时，不需要使用转录因子，非神经 细胞即能够有效转化为神经细胞。
[0007] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制 剂、AKT抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。由此，能够有效诱导非神经细胞 转化为神经细胞。
[0008] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂 Y27632、AKT/mTOR 抑制剂 Palomid 529、PI3K 抑制剂 LY294002、FAK 抑制剂 PF562271 以及 免疫抑制剂雷帕霉素。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞，且转化率较高。
[0009] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0010] 根据本发明的实施例，所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维 细胞、上皮细胞、成人细胞和新生儿细胞的至少一种。由此，在存在蛋白激酶抑制剂时，能够 快速有效地转化为神经细胞。
[0011] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备神经细胞的方法。根据本发明的实 施例，该方法包括：在存在蛋白激酶抑制剂时，对非神经细胞进行培养。发明人发现，利用本 发明的该方法，不需要使用转录因子，即能够快速有效地制备获得神经细胞，且获得的神经 细胞适合用于自体移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，同时安全性高，不存在免疫 排斥反应。
[0012] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制 齐[J、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。由此，能够有效诱导非神 经细胞转化为神经细胞。
[0013] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂 Y27632、AKT/mTOR 抑制剂 Palomid 529、PI3K 抑制剂 LY294002、FAK 抑制剂 PF562271 以及 免疫抑制剂雷帕霉素。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞，且转化率较高。
[0014] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0015] 根据本发明的实施例，所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维 细胞、上皮细胞、成人细胞和新生儿细胞的至少一种。由此，在存在蛋白激酶抑制剂时，能够 快速有效地转化为神经细胞。
[0016] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于制备神经细胞的试剂盒。根据本发 明的实施例，该试剂盒包含：第一培养基，所述第一培养基包含：第一基础培养基，蛋白激 酶抑制剂，脑原性神经营养因子（BDNF)，神经营养因子3(NT3)，丙戊酸钠（VPA)，双丁酰环 腺苷酸（dbcAMP)，以及视黄酸（Retinoic acid, RA)。其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下 列的至少一种：R〇CK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。 发明人发现，利用该试剂盒，能够有效地将非神经细胞诱导转化为神经细胞，且操作简单、 方便快捷。
[0017] 根据本发明的实施例，本发明的试剂盒进一步包括：第二培养基，所述第二培养基 包含：第二基础培养基，蛋白激酶抑制剂，N2细胞培养基添加剂（N-2)，B27细胞培养基添加 剂（B-27)，谷氨酰胺（Glutamax)，刺猬蛋白（SHH)，成纤维细胞生长因子（FGF2)，重组人血 小板衍生生长因子（PDGF-AA)，以及视黄酸；或/和第三培养基，所述第三培养基包含：第三 基础培养基，蛋白激酶抑制剂，N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，刺 猬蛋白，头发生素蛋白（Noggin)，双丁酰环腺苷酸，胰岛素样生长因子（IGF)，神经营养因 子3,以及视黄酸。其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂、AKT/ mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。由此，能够有效获得成熟的不同种 类的神经细胞。
[0018] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0019] 根据本发明的实施例，所述第一基础培养基为神经细胞基础培养基，所述第二基 础培养基为DMEM/F12培养基，所述第三基础培养基为DMEM/F12培养基。由此，有利于将非 神经细胞转化为神经细胞。
[0020] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/mT0R 抑制剂Palomid529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉 素的至少一种，优选ROCK抑制剂Y27632。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞， 且转化效率和转化率较高。
[0021] 根据本发明的实施例，所述第一培养基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制剂Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的脑原性神经营养因子，20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3,0· 5mM -1. 5mM的丙戊酸钠，25 μ Μ-100 μ Μ的双丁酰环腺苷酸，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。根据 本发明的实施例，所述第二培养基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632, lx Ν2细胞 培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，lOOng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白， 10ng/ml - 40ng/ml的成纤维细胞生长因子，10ng/ml - 40ng/ml的重组人血小板衍生生长 因子，以及〇. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述第三培养基包含：5 μ Μ _ 20μΜ的ROCK抑制剂Y27632，lx Ν2细胞培养基添加剂，lx Β27细胞培养基添加剂，lx谷 氨酰胺，l〇〇ng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3,50ng/ ml - 200ng/ml 的头发生素蛋白，50ng/ml - 200ng/ml 双丁酰环腺苷酸，50ng/ml - 200ng/ml 胰岛素样生长因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神经细胞直 接诱导转化为神经细胞，且转化率较高。
[0022] 根据本发明的实施例，所述第一培养基包含：10μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632,10ng/ ml的脑原性神经营养因子，10ng/ml的神经营养因子3, ImM的丙戊酸钠，50 μ Μ的双丁酰环 腺苷酸，以及〇. 5 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述第二培养基包含：10 μ Μ的ROCK 抑制剂Y27632, lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ ml的刺猬蛋白，20ng/ml的成纤维细胞生长因子，20ng/ml的重组人血小板衍生生长因子， 以及0. 5 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述第三培养基包含：10 μ Μ的ROCK抑制剂 Y27632, lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺 猬蛋白，l〇〇ng/ml的头发生素蛋白，100ng/ml的双丁酰环腺苷酸，100ng/ml的胰岛素样生 长因子，l〇ng/ml的神经营养因子3,以及0. 5 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神 经细胞直接诱导转化为神经细胞，转化效率和转化率较高，同时获得的神经细胞能够有效 用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存在免疫 排斥反应。
[0023] 在本发明的第四方面，本发明提供了前面所述的试剂盒在从非神经细胞制备神经 细胞中的用途。发明人发现，利用前面所述的试剂盒能够有效诱导非神经细胞转化为神经 细胞，且获得的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓 损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0024] 在本发明的第五方面，本发明提供了一种制备神经细胞的方法。根据本发明的实 施例，该方法包括以下步骤：（1)利用第一培养基，培养非神经细胞，其中，所述第一培养基 包含：第一基础培养基，蛋白激酶抑制剂，脑原性神经营养因子，神经营养因子3,丙戊酸 钠，双丁酰环腺苷酸，以及视黄酸，其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK 抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。利用本发明的该方 法，不需要使用转录因子，即能够快速有效地从非神经细胞转化获得神经细胞，且制备获得 的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安 全性高，不存在免疫排斥反应。
[0025] 根据本发明的实施例，本发明的制备神经细胞的方法进一步包括：(2)利用第二 培养基或第三培养基，培养经过第一培养基培养的非神经细胞，其中，所述第二培养基包 含：第二基础培养基，蛋白激酶抑制剂，N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨 酰胺，刺猬蛋白，成纤维细胞生长因子，重组人血小板衍生生长因子，以及视黄酸；所述第三 培养基包含：第三基础培养基，蛋白激酶抑制剂，N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添 加剂，谷氨酰胺，刺猬蛋白，头发生素蛋白，双丁酰环腺苷酸，胰岛素样生长因子，神经营养 因子3,以及视黄酸，其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂、AKT/ mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。利用本发明的该方法，不需要使用 转录因子，即能够快速有效地从非神经细胞转化获得神经细胞，且制备获得的神经细胞能 够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存 在免疫排斥反应。
[0026] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0027] 根据本发明的实施例，所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维 细胞、上皮细胞、成人细胞和新生儿细胞的至少一种。由此，在存在蛋白激酶抑制剂时，能够 快速有效地转化为神经细胞。
[0028] 根据本发明的实施例，所述第一基础培养基为神经细胞基础培养基，所述第二基 础培养基为DMEM/F12培养基，所述第三基础培养基为DMEM/F12培养基。由此，有利于将非 神经细胞转化为神经细胞。
[0029] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/mT0R 抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉 素的至少一种，优选ROCK抑制剂Y27632。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞， 且转化效率和转化率较高。
[0030] 根据本发明的实施例，所述第一培养基包含：所述第一培养基包含：5μ Μ-2〇μ Μ 的ROCK抑制剂Υ27632, 5ng/ml - 20ng/ml的脑原性神经营养因子，20ng/ml - 80ng/ml 的神经营养因子3,0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸钠，25μΜ-100μΜ的双丁酰环腺苷酸，以及 0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述第二培养基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK 抑制剂Y27632, lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，100ng/ ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，10ng/ml - 40ng/ml的成纤维细胞生长因子，10ng/ml - 40ng/ml 的重组人血小板衍生生长因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述 第三培养基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632, lx Ν2细胞培养基添加剂，lx Β27细 胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，l〇〇ng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神 经营养因子3,50ng/ml - 200ng/ml的头发生素蛋白，50ng/ml - 200ng/ml双丁酰环腺苷酸， 50ng/ml - 200ng/ml胰岛素样生长因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效 地将非神经细胞直接诱导转化为神经细胞，且转化率较高。
[0031] 根据本发明的实施例，所述第一培养基包含：1〇μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632,10ng/ ml的脑原性神经营养因子，10ng/ml的神经营养因子3, ImM的丙戊酸钠，50 μ Μ的双丁酰环 腺苷酸，以及〇. 5 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述第二培养基包含：10 μ Μ的ROCK 抑制剂Y27632, lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ ml的刺猬蛋白，20ng/ml的成纤维细胞生长因子，20ng/ml的重组人血小板衍生生长因子， 以及0. 5 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述第三培养基包含：10 μ Μ的ROCK抑制剂 Y27632, lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺 猬蛋白，l〇〇ng/ml的头发生素蛋白，100ng/ml的双丁酰环腺苷酸，100ng/ml的胰岛素样生 长因子，l〇ng/ml的神经营养因子3,以及0. 5 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神 经细胞直接诱导转化为神经细胞，转化效率和转化率较高，同时获得的神经细胞能够有效 用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存在免疫 排斥反应。
[0032] 在本发明的第六方面，本发明提供了一种神经细胞或其衍生物。根据本发明的实 施例，所述神经细胞是根据前面所述的方法获得的。发明人发现，利用本发明的神经细胞或 其衍生物，能够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安 全性高，不存在免疫排斥反应。
[0033] 在本发明的第七方面，本发明提供了前面所述的神经细胞或其衍生物在制备药物 中的用途，所述药物用于治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤。
[0034] 根据本发明的实施例，所述中枢神经系统紊乱疾病为选自阿尔茨海默病、帕金森 病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症和脑白质营养不良的至少一种。由此，治疗效 果较佳。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1显示了根据本发明的实施例1，部分筛选实验结果，其中，
[0036] 图1Α为筛选过程的流程示意图，
[0037] 图1Β为培养7天时，对照组和实验组细胞的照片，
[0038] 图1C为培养7天时，对照组和实验组的转化率结果；
[0039] 图2显示了根据本发明的实施例3, iOPCs和iOLs的免疫检测结果，其中，
[0040] 图2A为分化培养前的iOPCs的免疫染色实验结果，
[0041] 图2B为分化培养后所得到的iOLs的免疫染色实验结果；
[0042] 图3显示了根据本发明的实施例4, western印迹分析和免疫染色实验检测结果， 其中，
[0043] 图3A为western印迹分析检测结果，
[0044] 图3B为iOPCs免疫染色实验检测结果，
[0045] 图3C为iOLs免疫染色实验检测结果；
[0046] 图4显示了根据本发明的实施例5,微阵列分析结果图，其中，
[0047] 图4A为iOPCs、人类脑源性OPCs、iOLs和亲本成纤维细胞之间的基因差异表达谱，
[0048] 图4B为iOPCs、人类脑源性OPCs、iOLs和亲本成纤维细胞之间差异表达基因的聚 类分析结果；
[0049] 图5显示了根据本发明的实施例6,免疫组织化学检测结果，其中，
[0050] 图5A为注射iOPCs位点的同一脑组织切片的免疫荧光结果图和H&E染色结果图，
[0051] 图5B为注射iOPCs位点脑组织切片的免疫染色结果图，
[0052] 图5C为注射iOPCs位点脑组织切片的共聚焦显微镜照片；
[0053] 图6显示了根据本发明的实施例7, MR90纤维细胞转化得到的神经元细胞的免疫 染色实验结果图；
[0054] 图7显示了根据本发明的实施例7, MR90纤维细胞转化得到的神经元细胞的电生 理学检测结果，其中，
[0055] 图7a为从-60mV开始，以10mV的增幅对细胞施加电压至+60mV过程中记录的电 流轨迹（上图）及钠电流和电压之间的关系（下图），
[0056] 图7b为当电压在500ms内从-80mV增加至+60mV的过程中，记录得到的膜电流的 轨迹，
[0057] 图7c为保持电压为-80mV时，记录得到的自发的突触电流的轨迹；以及
[0058] 图8显示了根据本发明的实施例7, MR90纤维细胞转化得到的神经胶质细胞的免 疫染色实验结果图。
【具体实施方式】
[0059] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市购获得的常规产品。
[0060] 在本发明的第一方面，本发明提供了蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细 胞中的用途。发明人惊奇地发现，在存在蛋白激酶抑制剂时，不需要使用转录因子，非神经 细胞即能够有效转化为神经细胞。
[0061] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制 剂、AKT抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。由此，能够有效诱导非神经细胞 转化为神经细胞。
[0062] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂 Y27632、AKT/mTOR 抑制剂 Palomid 529、PI3K 抑制剂 LY294002、FAK 抑制剂 PF562271 以及 免疫抑制剂雷帕霉素。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞，且转化率较高。 [0063] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0064] 根据本发明的实施例，所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维 细胞、上皮细胞、成人细胞和新生儿细胞的至少一种。由此，在存在蛋白激酶抑制剂时，能够 快速有效地转化为神经细胞。
[0065] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备神经细胞的方法。根据本发明的实 施例，该方法包括：在存在蛋白激酶抑制剂时，对非神经细胞进行培养。发明人发现，利用本 发明的该方法，不需要使用转录因子，即能够快速有效地制备获得神经细胞，且获得的神经 细胞适合用于自体移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，同时安全性高，不存在免疫 排斥反应。
[0066] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制 齐[J、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。由此，能够有效诱导非神 经细胞转化为神经细胞。
[0067] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂 Y27632、AKT/mTOR 抑制剂 Palomid 529、PI3K 抑制剂 LY294002、FAK 抑制剂 PF562271 以及 免疫抑制剂雷帕霉素。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞，且转化率较高。 [0068] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0069] 根据本发明的实施例，所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维 细胞、上皮细胞、成人细胞和新生儿细胞的至少一种。由此，在存在蛋白激酶抑制剂时，能够 快速有效地转化为神经细胞。
[0070] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于制备神经细胞的试剂盒。根据本发 明的实施例，该试剂盒包含：第一培养基，所述第一培养基包含：第一基础培养基，蛋白激 酶抑制剂，脑原性神经营养因子，神经营养因子3,丙戊酸钠，双丁酰环腺苷酸，以及视黄酸。 其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑 制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。发明人发现，利用该试剂盒，能够有效地将非神经细胞 诱导转化为神经细胞，且操作简单、方便快捷。
[0071] 根据本发明的实施例，所述第一基础培养基为神经细胞基础培养基，
[0072] 根据本发明的实施例，所述第一培养基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制剂Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的脑原性神经营养因子，20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3,0· 5mM -1. 5mM的丙戊酸钠，25 μ Μ-100 μ Μ的双丁酰环腺苷酸，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。由此， 能够快速有效地将非神经细胞直接诱导转化为神经细胞，且转化率较高。
[0073] 根据本发明的实施例，所述第一培养基包含：10μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632,10ng/ ml的脑原性神经营养因子，10ng/ml的神经营养因子3, ImM的丙戊酸钠，50 μ Μ的双丁酰环 腺苷酸，以及0. 5 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神经细胞直接诱导转化为神经 细胞，转化效率和转化率较高，同时获得的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗中枢 神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0074] 根据本发明的实施例，本发明的试剂盒进一步包括：第二培养基，所述第二培养基 包含：第二基础培养基，蛋白激酶抑制剂，Ν2细胞培养基添加剂，Β27细胞培养基添加剂，谷 氨酰胺，刺猬蛋白，成纤维细胞生长因子，重组人血小板衍生生长因子，以及视黄酸；或/和 第三培养基，所述第三培养基包含：第三基础培养基，蛋白激酶抑制剂，Ν2细胞培养基添加 剂，Β27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，刺猬蛋白，头发生素蛋白，双丁酰环腺苷酸，胰岛素样 生长因子，神经营养因子3,以及视黄酸。其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一 种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、ΡΙ3Κ抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。由此，能够 有效获得成熟的不同种类的神经细胞。
[0075] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0076] 根据本发明的实施例，所述第二基础培养基为DMEM/F12培养基，所述第三基础培 养基为DMEM/F12培养基。由此，有利于将非神经细胞转化为神经细胞。
[0077] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/mT0R 抑制剂Palomid529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉素 的至少一种，优选ROCK抑制剂Y27632。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞，且 转化效率和转化率较高。
[0078] 根据本发明的实施例，所述第二培养基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制剂Y27632， lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白，l〇ng/ml - 40ng/ml的成纤维细胞生长因子，10ng/ml - 40ng/ml的重组人血 小板衍生生长因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。根据本发明的实施例，所述第三培养 基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制剂Y27632，lx Ν2细胞培养基添加剂，lx Β27细胞培养 基添加剂，lx谷氨酰胺，l〇〇ng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神经营养 因子3,50ng/ml - 200ng/ml的头发生素蛋白，50ng/ml - 200ng/ml双丁酰环腺苷酸，50ng/ ml - 200ng/ml胰岛素样生长因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效地将 非神经细胞直接诱导转化为神经细胞，且转化率较高。
[0079] 根据本发明的实施例，所述第二培养基包含：10 μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632, lx Ν2 细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ ml的成纤维细胞生长因子，20ng/ml的重组人血小板衍生生长因子，以及0. 5 μ Μ的视黄酸。 根据本发明的实施例，所述第三培养基包含：1〇 μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632, lx Ν2细胞培养 基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白，100ng/ml的头发 生素蛋白，l〇〇ng/ml的双丁酰环腺苷酸，100ng/ml的胰岛素样生长因子，10ng/ml的神经营 养因子3,以及0. 5 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神经细胞直接诱导转化为神经 细胞，转化效率和转化率较高，同时获得的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗中枢 神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0080] 在本发明的第四方面，本发明提供了前面所述的试剂盒在从非神经细胞制备神经 细胞中的用途。发明人发现，利用前面所述的试剂盒能够有效诱导非神经细胞转化为神经 细胞，且获得的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓 损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0081] 在本发明的第五方面，本发明提供了一种制备神经细胞的方法。根据本发明的实 施例，该方法包括以下步骤：
[0082] (1)利用第一培养基，培养非神经细胞。
[0083] 根据本发明的实施例，第一培养基包含：第一基础培养基，蛋白激酶抑制剂，脑原 性神经营养因子，神经营养因子3,丙戊酸钠，双丁酰环腺苷酸，以及视黄酸。
[0084] 根据本发明的实施例，第一基础培养基的种类不受特别限制，只要能够有利于诱 导非神经细胞转化为神经细胞，本领域技术人员可以根据实际情况灵活选择。根据本发明 的实施例，第一基础培养基为神经细胞基础培养基。由此，有利于将非神经细胞转化为神经 细胞。
[0085] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制 齐IJ、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。
[0086] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂可以为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/ mTOR抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷 帕霉素的至少一种，优选ROCK抑制剂Y27632。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经 细胞，且转化效率和转化率较高。
[0087] 根据本发明的实施例，所述第一培养基包含：所述第一培养基包含：5μΜ_20μΜ 的ROCK抑制剂Υ27632, 5ng/ml - 20ng/ml的脑原性神经营养因子，20ng/ml - 80ng/ml的神 经营养因子3,0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸钠，25μΜ-100μ Μ的双丁酰环腺苷酸，以及0. 5μ Μ-? μ Μ 的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神经细胞直接诱导转化为神经细胞，且转化率较 高，如果各成分的浓度过高或过低转化效果均不理想。
[0088] 根据本发明的一个具体示例，所述第一培养基包含：10 μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632， 10ng/ml的脑原性神经营养因子，10ng/ml的神经营养因子3, ImM的丙戊酸钠，50 μ Μ的双丁 酰环腺苷酸，以及〇. 5 μ Μ的视黄酸。由此，非神经细胞能够在最适合的条件下逐渐转化为 神经细胞，转化效率和转化率较高，同时获得的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗 中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0089] 根据本发明的实施例，所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维 细胞、上皮细胞、成人细胞和新生儿细胞的至少一种。由此，在存在蛋白激酶抑制剂时，能够 快速有效地转化为神经细胞。
[0090] (2)利用第二培养基或第三培养基，培养经过第一培养基培养的非神经细胞，；
[0091] 根据本发明的实施例，所述第二培养基包含：第二基础培养基，蛋白激酶抑制剂， Ν2细胞培养基添加剂，Β27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，刺猬蛋白，成纤维细胞生长因子， 重组人血小板衍生生长因子，以及视黄酸。
[0092] 根据本发明的实施例，第二基础培养基的种类不受特别限制，本领域技术人员可 以根据实际情况灵活选择。根据本发明的实施例，所述第二基础培养基为DMEM/F12培养 基。
[0093] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制 齐IJ、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。
[0094] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/mT0R 抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉 素的至少一种，优选ROCK抑制剂Y27632。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞， 且转化效率和转化率较高。
[0095] 根据本发明的实施例，第二培养基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制剂Y27632, lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，lOOng/ml - 400ng/ml的刺 猬蛋白，l〇ng/ml - 40ng/ml的成纤维细胞生长因子，10ng/ml - 40ng/ml的重组人血小板衍 生生长因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神经细胞直接诱导 转化为神经细胞，且转化率较高。
[0096] 根据本发明的一个具体示例，第二培养基包含：10 μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白， 20ng/ml的成纤维细胞生长因子，20ng/ml的重组人血小板衍生生长因子，以及0. 5 μ Μ的视 黄酸。由此，非神经细胞能够在最适合的条件下逐渐转化为神经细胞，转化效率和转化率较 高，同时获得的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓 损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0097] 根据本发明的实施例，所述第三培养基包含：第三基础培养基，蛋白激酶抑制剂， Ν2细胞培养基添加剂，Β27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，刺猬蛋白，头发生素蛋白，双丁酰 环腺苷酸，胰岛素样生长因子，神经营养因子3,以及视黄酸。
[0098] 根据本发明的实施例，第三基础培养基的种类不受特别限制，本领域技术人员可 以根据实际情况灵活选择。根据本发明的实施例，所述第三基础培养基为DMEM/F12培养 基。由此，有利于将非神经细胞转化为神经细胞。
[0099] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制 齐IJ、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。
[0100] 根据本发明的实施例，所述蛋白激酶抑制剂为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/mT0R 抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉 素的至少一种，优选ROCK抑制剂Y27632。由此，能够有效诱导非神经细胞转化为神经细胞， 且转化效率和转化率较高。
[0101] 根据本发明的实施例，第三培养基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制剂Y27632, lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，lOOng/ml - 400ng/ml的刺 猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3, 50ng/ml - 200ng/ml的头发生素蛋白，50ng/ ml - 200ng/ml双丁酰环腺苷酸，50ng/ml - 200ng/ml胰岛素样生长因子，以及0. δμΜ-? μ Μ 的视黄酸。由此，能够快速有效地将非神经细胞直接诱导转化为神经细胞，且转化率较 商。
[0102] 根据本发明的一个具体示例，第三培养基包含：10 μ Μ的ROCK抑制剂Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白， 100ng/ml的头发生素蛋白，100ng/ml的双丁酰环腺苷酸，100ng/ml的胰岛素样生长因子， lOng/ml的神经营养因子3,以及0. 5 μ Μ的视黄酸。由此，非神经细胞能够在最适合的条件 下逐渐转化为神经细胞，转化效率和转化率较高，同时获得的神经细胞能够有效用于自体 细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0103] 根据本发明的实施例，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细 胞、神经元细胞、神经胶质细胞的至少一种。由此，制备获得的神经细胞能够有效用于自体 移植，治疗中枢神经紊乱疾病以及脊髓损伤，且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0104] 利用本发明的该方法，不需要使用转录因子，即能够快速有效地从非神经细胞转 化获得神经细胞，且制备获得的神经细胞能够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊 乱疾病以及脊髓损伤，并且安全性高，不存在免疫排斥反应。
[0105] 在本发明的第六方面，本发明提供了一种神经细胞或其衍生物。根据本发明的实 施例，所述神经细胞是根据前面所述的方法获得的。发明人发现，利用本发明的神经细胞或 其衍生物，能够有效用于自体细胞移植治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤，并且安 全性高，不存在免疫排斥反应。
[0106] 在本发明的第七方面，本发明提供了前面所述的神经细胞或其衍生物在制备药物 中的用途，所述药物用于治疗中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤。
[0107] 根据本发明的实施例，中枢神经系统紊乱疾病的种类不受特别限制。根据本发明 的实施例，前面所述的药物比较适合用于治疗选自阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓 侧索硬化症、多发性硬化症和脑白质营养不良等中枢神经紊乱疾病的至少一种。由此，治疗 效果较佳。
[0108] 实施例1 :蛋白激酶抑制剂的筛选
[0109] 首先，用〇· lmg/ml多聚鸟氨酸溶液（sigma，P4957)包被细胞培养板至少3小 时，接着用高压蒸汽处理过的纯水洗板3次，每5分钟一次，然后，加入含有2 μ g/ml纤 连蛋白（sigma, F0556)和 10 μ g/ml 层粘连蛋白（ROCHE, 11243217001)的 IX PBS 溶 液，500 μ 1/孔，并置于培养箱中过夜包被，随后移除培养板中的溶液，并用基础培养基 (DMEM 培养基（HyClone, SH30022)，10 % 胎牛血清（Fisher Scientific，SH3007003)， 10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（CORNING, 25060-CL)，lx MEM NEAA(100X，GIBCO, 11140)，ImM 丙酮酸钠（GIBC0, 25000)，lx 2-巯基乙醇（1000X，GIBC0, 21985)，lx 谷氨酰胺（100X， GIBC0, 35050)，双抗）洗板，然后，以2X104个细胞/孔的密度接种来自真皮的成人成纤 维细胞系（购自ATCC，PCS-201-012)，用上述基础培养基培养24小时，然后移除基础培 养基，并用PBS溶液洗板一次，接着实验组分别加入含有2 μ Μ不同蛋白激酶抑制剂（蛋 白激酶抑制剂库，Calbiochem，Cat#539744、539745和539746)的神经诱导培养基（神 经元细胞培养基（ScienCell，1521)，10ng/ml脑源性神经营养因子（PR0SPEC，CYT-207)， 10ng/ml 神经营养因子 3 (PR0SPEC，CYT-257)，ImM 丙戊酸钠（sigma, P4543)，50 μ Μ 双丁 酰环腺苷酸（sigma, D0627)，双抗，0· 5 μ Μ视黄酸（sigma, R2625)，2 μ Μ蛋白激酶抑制 剂），对照组加入不含蛋白激酶抑制剂的神经诱导培养基，继续培养，每两天换一次液， 培养过程中观察细胞的形态，并在培养第7天时计算转化率（转化率=诱导得到的神经 细胞的数量/总细胞数量），部分筛选实验结果见图1，其中，图1A为筛选过程的流程 示意图，图1B为培养7天时，对照组和实验组细胞的照片，其中，左图为对照组细胞的 照片，右图为添加 Rock抑制剂Y-27632 (在本文中Rock抑制剂Y-27632与Y-27632可 以互换使用）的实验组细胞的照片，图1C为培养7天时，对照组和添加不同蛋白激酶 抑制剂的实验组的转化率测定结果，其中，control表示对照组。当细胞转变为类神经 细胞形态后（大约接种成纤维细胞后7天左右），可以进一步用OPC(少突胶质前体细 胞）培养基（DMEM/F12(Invitrogen，11320)，lxN-2(R&Dsystems)，不含维他命A的lx B-27(Invitrogen), lx Glutamax(GIBCO, 35050), 200ng/ml SHH(R&D systems), 20ng/ml FGF2(R&D systems) ,20ng/ml FOGF-AACR&D systems),双抗，10 μ M Y_27632(Enzo Life S ciences，ALX-270-333-M005)，0.5yM RA(sigma，R2625))继续培养细胞。
[0110] 从图1的结果可以看出，加入ROCK抑制剂Y-27632能够高效地将来自真皮的成 人成纤维细胞诱导转化为神经细胞，而未加蛋白激酶抑制剂的对照组则没有观察到纤维细 胞向神经细胞的转化。特别需要指出的是，在培养的第3天至第7天，发明人观察到在含 有ROCK抑制剂Υ-27632的神经诱导培养基中培养的一个成纤维细胞亚种群从典型的大、扁 平、呈纺锤形的成纤维细胞（图1B左图）转化为小且多突起的神经细胞，即诱导少突胶质 前体细胞（i〇PCs)(图1B右图）。由图1C可以看出，当利用含有ROCK抑制剂Y27632的培 养基培养成纤维细胞时，转化率最高，达到80%左右。发明人选择转化率最高的5种蛋白激 酶抑制剂，即 ROCK 抑制剂 Y27632 (Y27632)、AKT/mTOR 抑制剂 Palomid 529 (P529)、PI3K 抑 制剂LY294002 (LY)、FAK抑制剂PF562271 (FAKi)以及免疫抑制剂雷帕霉素（）进行后续相 关试验。
[0111] 实施例2
[0112] 采用与实施例1相同的方法，分别利用ROCK抑制剂Y27632、AKT抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉素诱导人成纤维 细胞系MR90和WI38。结果表明，经神经诱导培养基培养一段时间后，在两种细胞系中，均 有成纤维细胞转化为少突胶质前体细胞，采用ROCK抑制剂Y27632诱导IMR90细胞的照片 及转化率结果见图1。
[0113] 实施例3
[0114] 在本实施例中，对实施例1中诱导得到的i〇PCs能否分化为成熟少突角质细胞进 行评估，具体如下：
[0115] 利用不含生长因子并添加甲状腺激素（一种已知的少突胶质细胞分化诱导剂） 的成熟培养基（1〇μΜ 的 ROCK抑制剂 Y27632(Enzo Life Sciences，ALX-270-333-M005)， lx N2细胞培养基添加剂，lx B27细胞培养基添加剂，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺 猬蛋白，l〇〇ng/ml的头发生素蛋白（R&D systems)，100ng/ml的双丁酉先环腺苷酸 (sigma, D0627)，100ng/ml的胰岛素样生长因子（R&D systems)，10ng/ml的神经营养因子 3 (PR0SPEC，CYT-257)，以及0. 5 μ Μ的视黄酸（sigma, R2625))对实施例1中利用含有2 μ Μ ROCK抑制剂Υ27632的神经诱导培养基培养7天后所得到的iOPCs进行分化培养，得到 iOLs (诱导少突胶质细胞），并对分化培养前后的iOPCs和iOLs分别进行免疫染色实验。具 体如下：
[0116] 在诱导转化的前一天，将5X104个成纤维细胞接种于包被的玻璃盖玻片上， 采用与实施例1相同的方法进行诱导转化，经过诱导转化后，于室温条件下，将得到的 iOPCs在含有4 %多聚甲醛的PBS溶液中固定20分钟，然后在含有0.2 %聚乙二醇辛 基苯基醚和10 %羊血清（NGS)的PBS溶液中透性化30分钟，接着于4摄氏度下，在含 有 10% NGS 和一抗（鼠抗-04(Millipore, 1:50)、兔抗-NF(Sigma-Aldrich, 1:1000)、鼠 抗-A2B5 (Mi 11 ipore, 1:50)、MBP (1:100, Covance ;1:100, Abeam)，、MAG(Mi 11 ipore, 1:50)、 MOG(Millipore，1:50))的PBS溶液中过夜孵育。然后，用PBS溶液洗涤细胞三次，并在室温 条件下，用抗兔或抗鼠二抗，Alexa Fluor-488 或 Alexa Fluor_594(l:500，Invitrogen)孵 育2小时。然后，利用免疫荧光显微镜或蔡司LSM 510META共聚焦显微镜观察细胞。检测 结果见图2,其中，Merge表示重合图，图2A为分化培养前的iOPCs的免疫染色实验结果，图 2B为分化培养后所得到的iOLs的免疫染色实验结果。
[0117] 图2A的结果表明，80 %的成纤维细胞转化为具有典型少突胶质细胞形态的04-阳 性细胞（即iOPCs)，进一步的，这些04-阳性细胞对另外两个0PC标记A2B5 (少突胶质前 体细胞表面抗原A2B5)和S100i3 (神经胶质特异性蛋白）也呈阳性。相反，利用不含ROCK 抑制剂Y27632的相同诱导培养基培养成纤维细胞4周后，所得到的细胞仍保持典型的成 纤维细胞形态，免疫染色实验表明该细胞对04 (少突胶质前体细胞表面抗原04)、A2B5和 S100i3呈阴性。上述结果表明，利用ROCK抑制剂Y27632能够直接诱导成纤维细胞转化为 iOPCs。图2B的结果表明，进行分化培养3-7天，大约70 %的iOPCs分化成为具有典型少突 胶质细胞形态的细胞。并且，所得到的少突胶质细胞表达髓鞘碱性蛋白（MBP)，以及成熟少 突胶质细胞的特定标记：髓磷脂相关糖蛋白（MAG)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（M0G)。由 此，说明ROCK抑制剂诱导得到的iOPCs能够进一步分化为功能性成熟少突胶质细胞。
[0118] 实施例4
[0119] ROCK是属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC (蛋白激酶A/蛋白激酶G/蛋白激酶C)家 族的一种激酶，在哺乳动物（如人、大鼠、小鼠）中包括R0CK1和R0CK2。R0CK1主要在肺、 肝脏、脾脏、肾脏和睾丸表达，而R0CK2主要分布于脑部和心脏。为了测定Rho-ROCK通路是 否参与纤维细胞-少突胶质前体细胞转化过程，检测ROCK基因沉默对纤维细胞-少突胶质 前体细胞转化的影响，具体如下：
[0120] 提供针对R0CK2基因的小发夹结构RNAs，包括shRNAl和shRNA2(Sigma-Aldrich， TRCN0000342532, TRCN0000342473)，然后将shRNAl和shRNA2分别转入来自真皮的成人成 纤维细胞中，并对转染后的细胞进行western印迹分析，接下来，利用不含蛋白激酶抑制剂 的神经诱导培养基对转染后的细胞进行培养，培养7天后，得到iOPCs，接着采用与实施例3 相同的方法，对得到的iOPCs进行免疫染色实验，接下来，利用成熟培养基对得到的iOPCs 进行分化培养，得到iOLs，然后采用与实施例3相同的方法，对得到的iOLs进行免疫染色实 验。实验结果见图3,其中，图3A为Western印迹分析检测结果，其中，Tubulin表示微管蛋 白，Control表示对照组，图3B为iOPCs免疫染色实验检测结果，图3C为iOLs免疫染色实 验检测结果。
[0121] 由图3A可以看出，转染后的细胞中R0CK2显著低表达，说明shRNAl和shRNA2 均能够有效抑制R0CK2的表达，经过神经诱导培养基培养后，转染后的细胞的转化率约为 60-80%，与用ROCK抑制剂处理的成纤维细胞的转化率基本相同。由图3B可以看出，通过 R0CK2基因沉默而得到的iOPCs对GFP(绿色荧光蛋白）、04、A2B5和S100 β呈阳性。由图 3C可以看出，经过分化培养，通过R0CK2基因沉默而得到的iOPCs能够分化为具有典型少突 胶质细胞形态的细胞，且分化获得的细胞（即iOLs)表达MBP、MAG和M0G。上述结果表明 R0CK2激酶参与成纤维细胞向神经细胞的转化过程。
[0122] 实施例5
[0123] 发明人假设ROCK抑制剂通过调节一组神经转录因子而引起纤维细胞-0PC转化， 为了分析Y27632处理得到的iOPCs、人类脑源性OPCs、iOLs和亲本成纤维细胞之间的相 似性，发明人通过微阵列分析生成了全基因表达数据。其中，微阵列分析在华盛顿大学基 因组中心进行，具体步骤如下：利用Illumina HumanHT-12v4表达微珠芯片，并用生物素 标记提取自上述个细胞的mRNA样品，然后进行直接杂交试验，并用微珠阵列阅读器扫描数 据。扫描得到的图片使用Illumina Beadscan v3进行量化，将量化后的数据输入Illumina GenomeStudio软件并通过Illumina's quantile方法进行标准化，然后将去除背景后所得 到的标准化数据以excel形式输出，随后，基于平均信号将输出的数据进行过滤，其中，设 置基线为50以便平均信号大于50的唯一基因可以用于后续的分析。选择每一个基因的 最大和最小信号值，然后将两者相除，只有相除结果值大于3(3倍差异表达）的基因被认 为是表达差异基因，然后，通过MeV软件将得到的所有表达差异基因进行聚类分析。进一 步的，为了确定iOPCs、人类脑源性OPCs、iOLs和亲本成纤维细胞之间的关系，分别对每个 样品进行微阵列分析，将得到的数据基于平均信号进行过滤，且基线设置为50,以便提高分 辨率。为了检验0PC分化通路与无限增殖的相关性，将来自http://www. geneontology. org/，G0:0030182的所有0PC分化基因都与微阵列分析数据进行比对，并通过基于网络的 Gorilla program(http://cbl_gorilla· cs. technion. ac. il/)进行基因富集分析。检测结 果见图4,其中，WT表示野生型。其中，图4A为iOPCs、人类脑源性OPCs、iOLs和亲本成纤 维细胞之间的基因差异表达谱，图4B为iOPCs、人类脑源性OPCs、iOLs和亲本成纤维细胞 之间差异表达基因的聚类分析结果。
[0124] 由图4的结果可以看出，聚类分析显示了 iOPCs和其亲本成纤维细胞的基因表达 谱之间存在显著差异（图4A，表明iOPCs与其亲本成纤维细胞明显不同。表达差异基因聚 类分析显示ROCK抑制剂诱导得到的iOPCs的转录谱与人类脑源性OPCs紧密聚集，而与其 亲本成纤维细胞相距较远（图4A、图4B)。通过分析4倍差异表达基因的微阵列数据，iOPCs 和脑源性OPCs在神经转录因子显示出明显的基因表达重叠。上述结果表明，在诱导转化过 程中，一组成纤维细胞特定基因可能存在永久性降调节。综合上述，表明基因转移-分化消 除了大多数原始细胞的明显表达印记，却特别诱导0PC表型表达。
[0125] 实施例6
[0126] 将实施例1中经ROCK抑制剂Y27632处理得到的iOPCs移植进用环己酮草酰二腙 处理的小鼠的脱髓鞘脑胼胝体，评价iOPCs在体内的功能性和形成髓鞘的潜能，具体如下：
[0127] 给C57BL/6小鼠饲喂0. 2% (w/w)环己酮草酰二腙（一种铜螯合剂）。饲喂12周 环己酮草酰二腙，导致脑胼胝体新的内生OPCs损耗，并最终导致完全脱髓鞘。在饲喂12周 时，将小鼠分为3组，第一组将含有ROCK抑制剂诱导得到的iOPCs的PBS溶液4 μ 1注射入 环己酮草酰二腙小鼠的脑胼胝体的右侧（η = 6,左侧作为未移植的对照组，左侧作为未移 植的对照组，其中，η表示小鼠数量），第二组将PBS溶液4μ 1注射入环己酮草酰二腙小鼠 的脑胼胝体的右侧（η = 3,其中，η表示小鼠数量），第三组将含有亲本成纤维细胞的PBS 溶液4μ 1注射入环己酮草酰二腙小鼠的脑胼胝体的右侧（η = 3,左侧作为未移植的对照 组，其中，η表示小鼠数量），注射细胞的浓度为25, 000个细胞/μ 1，注射位置的立体定向 坐标为 10. 98mm(前后轴），21. 75mm(侧中轴），22. 25mm(垂直轴）（Copray et al.，2006 ; Sher et al.，2009)。移植后，停止对小鼠饲喂环己酮草酰二腙，进行正常饲养，以便避免环 己酮草酰二腙引起移植细胞变性。移植4周后，处死小鼠，并切除大脑。然后，对脑组织切片 进行免疫组织化学检测（MBP染色），检测结果见图5,其中，NF表示神经丝蛋白，图5A为注 射iOPCs位点的同一脑组织切片的免疫荧光结果图和H&E染色结果图，图5B为注射iOPCs 位点脑组织切片的免疫染色结果图，图5C为注射iOPCs位点脑组织切片的共聚焦显微镜照 片。
[0128] 由图5A可以看出，只有约20%的移植iOPCs存活，由图5B可以看出，存活的iOPCs 进一步转化为成熟的表达MBP的OLs，并能够促进脑胼胝体轴突的髓鞘再生。由图5C的共 聚焦显微镜照片可以看见MBP+管状结构和神经丝共同包覆神经纤维的结构，表明移植的 iOPCs促进宿主轴突产生髓鞘。在未移植的部分没有观察到相同的结构。上述结果表明 ROCK抑制剂诱导得到的iOPCs可以在体内转化为能够生成髓鞘的少突胶质细胞。
[0129] 实施例7
[0130] 为了评价ROCK抑制剂直接诱导不同神经细胞的普遍应用价值，对诱导iOPCs 的方案进行了稍微调整，具体如下：用〇. lmg/ml多聚鸟氨酸溶液（sigma, P4957)包被 细胞培养板至少3小时，接着用高压蒸汽处理过的纯水洗板3次，每5分钟一次，然后， 加入每孔加入500μ 1含有2μ g/ml纤连蛋白（sigma，R)556)和10μ g/ml层粘连蛋白 (R0CHE，11243217001)的IX PBS溶液，并置于培养箱中过夜包被，随后移除培养板中的溶 液，并用基础培养基洗板，然后，以2 X 104个细胞/孔的密度接种来自真皮的成人成纤维细 胞系（购自ATCC，PCS-201-012)，用上述基础培养基培养24小时，然后移除基础培养基，并 用PBS溶液洗板一次，接着加入含有ROCK抑制剂Y276325 μ Μ和mTOR抑制剂（P529, 2 μ M) 的神经诱导培养基继续培养，培养3-7天，培养过程中，纤维细胞的形态逐渐转化为类神经 细胞，然后，接着用成熟培养基或0PC培养基对得到的类神经细胞进行培养，得到诱导神经 元细胞（iNCs)和神经胶质细胞。进一步对诱导得到的神经元细胞（iNCs)和神经胶质细胞 进行免疫染色实验和膜片钳实验。经Y27632和mTOR抑制剂诱导得到的iNCs的免疫染色 试验结果见图6,经Y27632和mTOR抑制剂诱导得到的iNCs的膜片钳试验结果见图7,其 中，图7a为从-60mV开始，以10mV的增幅对细胞施加电压至+60mV过程中记录的电流轨迹 (上图）及钠电流和电压之间的关系（下图），图7b为当电压在500ms内从-80mV增加至 +60mV的过程中，记录得到的膜电流的轨迹，图7c为保持电压为-80mV时，记录得到的自发 的突触电流的轨迹，经Y27632和mTOR抑制剂诱导得到的神经胶质细胞的免疫染色试验结 果见图8。
[0131] 从上述实验结果可知，发明人成功将成纤维细胞转化为典型的神经元细胞和神 经胶质细胞，经Y27632和mTOR抑制剂诱导得到的神经元细胞和神经胶质细胞表现出各 自细胞类型典型的细胞形态和生物标记。例如，从图6可以看出，诱导得到的神经元细 胞（iNCs)表达神经细胞特异性标记Tuj (微管相关蛋白）、MAP2 (微管相关蛋白2)以及 Synaptotagnin(突触结合蛋白），从图7的结果可以看出，诱导得到的神经元细胞表现出典 型的神经元细胞的电生理特性，从图8可以看出，诱导得到的神经胶质细胞表达神经胶质 细胞特异性标记GFAP(胶质纤维酸性蛋白）。上述结果表明，蛋白激酶抑制剂能够从非神经 细胞诱导生成各种神经细胞，例如神经元细胞、神经胶质细胞等。
[0132] 在本发明的描述中，需要理解的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能 理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第 一"、"第二"的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中， "多个"的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0133] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0134] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1. 蛋白激酶抑制剂在从非神经细胞制备神经细胞中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少 一种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂， 任选地，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂Y27632、AKT/mTOR 抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉 素， 任选地，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细胞、神经元细胞、神 经胶质细胞的至少一种， 任选地,所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维细胞、上皮细胞、成 人细胞和新生儿细胞的至少一种。
3. -种制备神经细胞的方法，其特征在于，包括： 在存在蛋白激酶抑制剂时，对非神经细胞进行培养。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少 一种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂， 任选地，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂Y27632、AKT/mTOR 抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉 素， 任选地，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细胞、神经元细胞、神 经胶质细胞的至少一种， 任选地,所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维细胞、上皮细胞、成 人细胞和新生儿细胞的至少一种。
5. -种用于制备神经细胞的试剂盒，其特征在于，包含： 第一培养基，所述第一培养基包含： 第一基础培养基， 蛋白激酶抑制剂， 脑原性神经营养因子， 神经营养因子3， 丙戊酸钠， 双丁酰环腺苷酸，以及 视黄酸， 其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、 PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，进一步包含： 第二培养基，所述第二培养基包含： 第二基础培养基， 蛋白激酶抑制剂， N2细胞培养基添加剂， B27细胞培养基添加剂， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 成纤维细胞生长因子， 重组人血小板衍生生长因子，以及 视黄酸； 或/和 第三培养基，所述第三培养基包含： 第三基础培养基， 蛋白激酶抑制剂， N2细胞培养基添加剂， B27细胞培养基添加剂， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 头发生素蛋白， 双丁酰环腺苷酸， 胰岛素样生长因子， 神经营养因子3,以及 视黄酸， 其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、 PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂， 任选地，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细胞、神经元细胞、神 经胶质细胞的至少一种， 任选地，所述第一基础培养基为神经细胞基础培养基，所述第二基础培养基为DMEM/ F12培养基，所述第三基础培养基为DMEM/F12培养基， 任选地，所述蛋白激酶抑制剂为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/mTOR抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉素的至少一种，优 选ROCK抑制剂Y27632， 任选地，所述第一培养基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的脑原性神经营养因子， 20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3， 0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸钠， 25 μ Μ-100 μ Μ的双丁酰环腺苷酸，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸； 所述第二培养基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， lOng/ml -40ng/ml的成纤维细胞生长因子， 10ng/ml - 40ng/ml的重组人血小板衍生生长因子，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸； 所述第三培养基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， 20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3， 50ng/ml - 200ng/ml的头发生素蛋白， 50ng/ml - 200ng/ml双丁酰环腺苷酸， 50ng/ml - 200ng/ml胰岛素样生长因子，以及 0· 5μΜ - ΙμΜ的视黄酸， 任选地，所述第一培养基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， l〇ng/ml的脑原性神经营养因子， 10ng/ml的神经营养因子3， ImM的丙戊酸钠， 50 μ Μ的双丁酰环腺苷酸，以及 0. 5 μ Μ的视黄酸； 所述第二培养基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 20ng/ml的成纤维细胞生长因子， 20ng/ml的重组人血小板衍生生长因子，以及 0. 5 μ Μ的视黄酸； 所述第三培养基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 100ng/ml的头发生素蛋白， 100ng/ml的双丁酰环腺苷酸， 100ng/ml的胰岛素样生长因子， lOng/ml的神经营养因子3,以及 0. 5 μ Μ的视黄酸。
7. 权利要求5或6所述的试剂盒在从非神经细胞制备神经细胞中的用途。
8. -种制备神经细胞的方法，其特征在于，包括： (1) 利用第一培养基，培养非神经细胞， 其中， 所述第一培养基包含： 第一基础培养基， 蛋白激酶抑制剂， 脑原性神经营养因子， 神经营养因子3， 丙戊酸钠， 双丁酰环腺苷酸，以及 视黄酸， 其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、 PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂， 任选地，进一步包括： (2) 利用第二培养基或第三培养基，培养经过第一培养基培养的非神经细胞， 其中， 所述第二培养基包含： 第二基础培养基， 蛋白激酶抑制剂， N2细胞培养基添加剂， B27细胞培养基添加剂， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 成纤维细胞生长因子， 重组人血小板衍生生长因子，以及 视黄酸； 所述第三培养基包含： 第三基础培养基， 蛋白激酶抑制剂， N2细胞培养基添加剂， B27细胞培养基添加剂， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 头发生素蛋白， 双丁酰环腺苷酸， 胰岛素样生长因子， 神经营养因子3,以及 视黄酸， 其中，所述蛋白激酶抑制剂为选自下列的至少一种：ROCK抑制剂、AKT/mTOR抑制剂、 PI3K抑制剂、FAK抑制剂以及免疫抑制剂， 任选地，所述神经细胞为选自少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细胞、神经元细胞、神 经胶质细胞的至少一种， 任选地,所述非神经细胞为人类细胞，所述人类细胞为选自成纤维细胞、上皮细胞、成 人细胞和新生儿细胞的至少一种， 任选地，所述第一基础培养基为神经细胞基础培养基，所述第二基础培养基为DMEM/ F12培养基，所述第三基础培养基为DMEM/F12培养基， 任选地，所述蛋白激酶抑制剂为选自ROCK抑制剂Y27632、AKT/mTOR抑制剂Palomid 529、PI3K抑制剂LY294002、FAK抑制剂PF562271以及免疫抑制剂雷帕霉素的至少一种，优 选ROCK抑制剂Y27632， 任选地， 所述第一培养基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的脑原性神经营养因子， 20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3， 0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸钠， 25 μ Μ-100 μ Μ的双丁酰环腺苷酸，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸； 所述第二培养基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， 10ng/ml -40ng/ml的成纤维细胞生长因子， 10ng/ml - 40ng/ml的重组人血小板衍生生长因子，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的视黄酸； 所述第三培养基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， 20ng/ml - 80ng/ml的神经营养因子3， 50ng/ml - 200ng/ml的头发生素蛋白， 50ng/ml - 200ng/ml双丁酰环腺苷酸， 50ng/ml - 200ng/ml胰岛素样生长因子，以及 0· 5μΜ - ΙμΜ的视黄酸， 任选地，所述第一培养基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， l〇ng/ml的脑原性神经营养因子， 10ng/ml的神经营养因子3， ImM的丙戊酸钠， 50 μ Μ的双丁酰环腺苷酸，以及 0. 5 μ Μ的视黄酸； 所述第二培养基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 20ng/ml的成纤维细胞生长因子， 20ng/ml的重组人血小板衍生生长因子，以及 0. 5 μ Μ的视黄酸； 所述第三培养基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制剂 Υ27632， lx N2细胞培养基添加剂， lx B27细胞培养基添加剂， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 100ng/ml的头发生素蛋白， 100ng/ml的双丁酰环腺苷酸， 100ng/ml的胰岛素样生长因子， l〇ng/ml的神经营养因子3,以及 0. 5 μ Μ的视黄酸。
9. 一种神经细胞或其衍生物，其特征在于，所述神经细胞是根据权利要求3-4和8中任 一项所述的方法获得的。
10. 权利要求9所述的神经细胞或其衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗 中枢神经系统紊乱疾病以及脊髓损伤， 任选地，所述中枢神经系统紊乱疾病为选自阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧 索硬化症、多发性硬化症和脑白质营养不良的至少一种。
【文档编号】A61K35/12GK104195108SQ201410367556
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】鲁晓华, 杨佳银, 杨波 申请人:深圳市三启生物技术有限公司