一种pd-1蛋白胞外段亲和肽l8及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明基因工程医学【技术领域】，具体涉及一种PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8及其应用。该亲和肽L8的氨基酸序列为：Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser，即：S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T-S，分子量为1293.7。该亲和肽L8在制备抗肿瘤相关药物中应用，所述肿瘤为结肠癌瘤或黑色素瘤。该亲和肽L8采用Fomc固相多肽合成法合成。本发明所获得的PD-1蛋白胞外段亲和肽L8，作用目标明确，对肿瘤的抑制效果明显，尤其是对结肠癌或黑色素瘤的抑瘤效果显著，且无明显副作用，能够明显提高实验动物的生存期，因而具有较好的医疗应用前景。
【专利说明】—种PD-1蛋白胞外段亲和肽L8及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程医学【技术领域】，具体涉及一种ro-1蛋白胞外段的亲和肽L8及其应用。
【背景技术】
[0002]近年来，随着全球经济科技的飞速发展，环境问题越来越恶劣，从而使人类的健康受到很大的威胁，尤其是近几十年来癌症患者的数目直线增长，但传统的手术治疗、放疗、化疗的技术已经不能取得很好的疗效或者是预后性较差。因此，寻找新的治疗手段和治疗药物一直是全球范围内的研究热点。与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。
[0003]在肿瘤免疫治疗中，效应T细胞是主要的杀伤肿瘤的细胞,但T细胞的激活需要两个信号的刺激，第一信号是识别信号，即肿瘤抗原等内源性抗原被树突状细胞(DC)等抗原递呈细胞(APC)加工处理后以MHC/表位复合物的形式递呈至APC的表面，该复合物能被T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别，从而形成了激活T细胞的第一信号；与此同时，T细胞和APC表面表达的多对共刺激分子相互作用产生了 T细胞活化的第二信号。
[0004]根据产生的效 应不同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。在正性共刺激分子中，最重要的是⑶28和ICOS等分子；在负性共刺激分子中，最重要的是 CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CD152)和 PD-1 (程序性死亡-1,programmed death-1,⑶279)等分子。在肿瘤免疫治疗过程中，负性共刺激分子主要介导免疫耐受和逃逸。
[0005]ro-1分子最早是通过削减杂交技术从小鼠处于凋亡状态的杂交瘤及造血祖细胞系克隆得到的，它被认为与细胞凋亡相关，因而命名为程序性死亡-1 (programmeddeath-1)，在2004年12月第八届国际人类白细胞分化抗原会议上被命名为⑶279。PD-1共有288个氨基酸组成，相对分子质量是55000，是一种跨膜糖蛋白，其胞外区包含一个IgV样结构域，有4个重要的N连接糖基化位点，并被重度糖基化。PD-1及其配体I3D-Ll是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，并介导了肿瘤免疫耐受和逃逸。
[0006]PD-1是一种免疫球蛋白超家族激活诱导的抑制性受体。前人在肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，研究通过抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的对肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种ro-Ι蛋白胞外段的亲和肽L8，并经过实验证明了该亲和肽L8具有抗肿瘤活性。[0008]本发明采取的技术方案如下:
一种F1D-1蛋白胞外段的亲和肽L8,其氨基酸序列为:Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-SerJP:S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T_S，分子量为 1293.7。
[0009]所述PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8在制备抗肿瘤相关药物中应用，所述肿瘤为结肠癌瘤或黑色素瘤，所述抗肿瘤为抑制肿瘤生长或消除肿瘤。
[0010]所述F1D-1蛋白胞外段的亲和肽L8采用Fomc固相多肽合成法合成,简要步骤如下: (1)选用Rink树脂与待合成肽即I3D-1亲和肽L8的C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键；
(2)然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应，如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕；
(3)最后，将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽；
(4)经脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，得纯度大于95%的本发明Η)_1亲和肽L8。
[0011]本发明所提供的ro-1蛋白胞外段亲和肽L8是通过固相筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作时所获得的；通过对其进一步的动物实验验证，其对肿瘤的抑制效果明显，无明显副作用，能够明显提高实验动物的生存期，具有较好的医疗应用前景。ro-1蛋白胞外段亲和肽L8的制备方法较为成熟、完善，便于制备相应的生物医药制品，因而本发明具有较好的实际应用推广意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为ro-Ι蛋白胞外段亲和肽L8的ES1-MS质谱分析鉴定结果；
图2为ro-Ι蛋白胞外段亲和肽L8对荷CT26的BABL/c小鼠体重变化的影响结果图；图3为ro-Ι蛋白胞外段亲和肽L8对荷CT26的BABL/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；
图4为Η)-1蛋白胞外段亲和肽L8对荷CT26的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影响；
图5为Η)-1蛋白胞外段亲和肽L8对荷B16F10的C57BL/6J小鼠生存期的影响结果图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0014]实施例1
为便于本领域技术人员具体实施本发明，发明人对PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8的筛选过程简要说明如下:
UPD-1胞外段蛋白的表达与纯化，简要步骤如下:
(O首先构建含有ro-Ι胞外段序列的pET-28a(+)-hro-l重组质粒；
(2)将重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中；
(3)IPTG诱导目的蛋白的表达；
(4)利用镍金属螯合亲和层析柱纯化蛋白，透析复性后得到有活性的目的蛋白。
[0015]具体步骤如下:(I)以PHA (植物血凝素)刺激的健康人PBMCs (外周血单核细胞)为材料，使用Trizol试剂盒提取总RNA，经逆转录后得到其cDNA。利用Primer5.0设计人I3D-1胞外段的引物(正向引物为:CCACGCATATGCCAGGATGGTTCTTAGACTC，反向引物为:GGCCGGAATTCTTATTGGAACTGGCCGGCTGG)，然后利用此引物，以PBMCs的cDNA为模板扩增出目的基因，经Nde I和EcoRI酶双酶切目的基因和质粒pET28a(+)后，将双酶切产物在16°C的条件下连接过夜。再将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5ci中，挑取阳性菌落获取重组质粒，对其进行双酶切验证和DNA测序。
[0016](2)将测序正确的重组质粒转化至Transetta (DE3)，用终浓度为0.5mM的IPTG，30 0C，过夜诱导目的蛋白的表达。
[0017](3)将菌体离心(12000rpm，3min)弃上清，PBS(ρΗ7.4)洗一遍后重悬超声破碎，离心后弃上清，用Binding Buffer重悬，离心(12000rpm, IOmin), 0.45 μ m微孔滤膜过滤后利
用镍金属螯合亲和层析柱纯化蛋白。
[0018](4)将纯化后的蛋白进行尿素浓度梯度透析复性，最后得到有活性的目的蛋白PD-1胞外段。
[0019]利用噬菌体展示十二肽库筛选ro-1的亲和肽，简要步骤如下:
(1)采用固相筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作；
(2)经过4飞轮的筛选后，与靶蛋白ro-1胞外段有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集，回收率提高了约100倍。
[0020](3)然后从第四轮和第五轮中挑选阳性克隆进行测序，共得到3个插入十二肽序列，即亲和肽序列，其中L8肽出现的次数最多。
[0021]具体过程如下:
(I)测定噬菌体滴度:接种ER2738单菌落于5~10mL LB培养基中，摇床培养至对数期(OD600~0.5)。
[0022]用LB培养基将噬菌体进行10倍系列稀释。稀释范围:扩增的噬菌体培养物上清:IO8^lO11 ;未扩增的淘选洗脱物:1(T104。
[0023]将已达到对数期的菌体每200μ L装入一微量离心管中，然后每管加入10μ L不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育5min。将感染菌体加入45°C预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37°C预温的LB/IPTG/Xgal平板上，使其均匀铺开。待平板冷却15min后，倒置于37°C培养过夜。第二天检查平板，计数有约IO2个噬菌体的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μ L噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
[0024](2)淘选过程
包被:将150 μ L的100 μ g/mL的靶分子溶液(溶于0.1M ρΗ8.6的NaHCO3)加入96孔微量板中，反复旋转直至表面完全湿润，于4°C密闭湿盒中孵育过夜。
[0025] 封闭:甩出每孔中的包被液(在干净的纸巾上用力拍甩以除尽残余溶液)，每孔加满封阻液，4°C作用至少I小时。
[0026]洗涤:按上述方法除去封阻液，再用TBST (TBS+0.l%[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次。此操作要快以避免板干燥。
[0027]结合:用TBST缓冲液稀释原肽库使100 μ L缓冲液中含有的2 X IO11个噬菌体。然后加到已包被好的板上，室温温和振荡l(T60min。[0028]洗涤:甩去未结合的噬菌体，用TBST缓冲液快速洗板10次。
[0029]洗脱:每孔加入100 μ L 的洗脱液(0.2M Glycine-HCl [pH2.2], lmg/mLBSA), 25°C湿盒中轻微摇动l(T60min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。
[0030]滴度测定:按上述测定滴度的方法对洗脱中和液中噬菌体的滴度进行测定。
[0031]扩增:将ER2738过夜培养菌以1:100的体积比稀释于20mL LB中(用250mL三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物。37°C剧烈摇动培养4.5小时。
[0032]沉淀:将培养物转入一离心管中，4°C 1000Orpm离心10min，上清液转入另一离心管中再离心。将上清的上部80%转入一新鲜管，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4°C沉淀至少60min,最好过夜。4°C 1000Orpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清,再短暂离心,吸去残留上清液。沉淀物重悬于ImLTBS中，悬液转入微量离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15~60min,4°C 1000Orpm离心10min,弃上清。沉淀物重悬于200 μ LTBS中，离心lmin，沉淀任何残余的不溶物，上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物。测定其滴度。
[0033](3)再包被一个孔准备下一轮筛选时用，方法同第一轮筛选。经过3飞轮的筛选挑取阳性噬菌体克隆扩增后进行DNA测序。
[0034](4)噬菌体DNA序列测定:制备扩增噬菌体克隆噬菌体单链DNA模板。取5 μ L用
0.7%琼脂糖凝胶电泳分析DNA提取效果。取20yL DNA测序模板进行全自动测序，测序引物为-96 gill 测序引物，5’ -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。
[0035](5)噬菌体DNA序列同源性分析:根据DNA序列推导其所编码的氨基酸序列，利用DNAMAN软件对获得的氨基酸序列进行同源性分析。共得到3个插入十二肽序列，即亲和肽序列，其中L8肽出现的次数最多。
[0036]实施例2
根据实施例1筛选得到的L8肽，人工合成亲和肽L8。
[0037]PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8采用Fomc固相多肽合成法合成,简要步骤如下:
(1)选用Rink树脂与待合成肽即I3D-1亲和肽L8的C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键；
(2)然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应，如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕；
(3)最后，将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽；
(4)经脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，得纯度大于95%的本发明的PD_1亲和肽L8。
[0038]一个具体的以合成0.434克的亲和肽L8为例，采用Fomc固相多肽合成法合成，具体合成步骤如下:
(1)称取0.5gRink树脂放入DMF (N, N- 二甲基甲酰胺)润洗过的合成仪中，然后加入3-5mLDMF，静置30min，使 树脂充分溶胀，然后用真空泵抽去DMF ;脱保护两次:
所述脱保护是指在合成仪中加入:T5mL脱保护液(哌啶与DMF的体积比为1:3)，250C~28°C下搅拌反应20min，真空泵抽干；
(2)将步骤(1)中脱保护后的树脂按以下顺序及次数进行洗涤，DMF两次一MeOH(甲醇)三次一DCM (二氯甲烷)三次一DMF两次，摇床中震荡洗涤，每次洗涤两分钟，洗涤结束时用真空泵将液体抽干；
(3)第一个氨基酸的添加:按公式I称取丝氨酸、HoBt(1-羟基苯丙三唑)及DIC (N,N-二异丙基碳二亚胺)的量，分别为 479.25mg、168.9125mg、192.455μ L，先用 3~5mL DMF溶解丝氨酸和HoBt加入合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，25°C~28°C下搅拌反应
2.5h ；
所述公式I为:氨基酸的质量=该氨基酸的相对分子质量X2.5 (当量)X树脂的质
量;
然后洗涤，洗涤方法同步骤(2)中的洗涤要求，即按以下顺序及次数进行洗涤，DMF两次一MeOH(甲醇)三次一DCM (二氯甲烷)三次一DMF两次，每次洗涤两分钟，摇床中震荡洗涤,洗涤结束时用真空泵将液体抽干；
用分光光度计测定波长为290nm处树脂和第一个氨基酸的吸光度0D，根据公式计算取代值，加封头液封头两次，每次20min，在摇床中震荡，然后洗涤，洗涤方法同步骤(2)中的洗涤要求；
取代值计算公示为:取代值=OD/ (1.65Xmwsg), Hiwi为树脂的质量；
(4)第二个氨基酸即苏氨酸的添加:合成时是从C端到N端方向进行，对步骤(3)中第一个氨基酸添加后树脂脱保护两次，方法及步骤同步骤(1)中的脱保护；
然后洗涤，洗涤方法及步骤同步骤(2)中洗涤；
然后挑取树脂茚检呈蓝色时，按公式2称取第二个氨基酸苏氨酸、HoBt、DIC的量，分别为298.125mg、101.3475mg、94.65 μ L，先用3~5mL DMF溶解丝氨酸和HoBt加入合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，25°C~28°C下搅拌反应2.5h。反应结束后按步骤(2)的方法洗涤树脂，洗涤结束后挑取树脂茚检呈无色；
所述公式2为:氨基酸的量=该氨基酸的相对分子质量(此处为苏氨酸)X2.5X树脂的质量(此处为0.5) X取代值(此处为步骤(3)中取代值计算结果)；
(5)后续氨基酸的添加:后续氨基酸的添加方法同第二个氨基酸的添加过程，直至加完所有氨基酸；其中茚检样品时，显色要求有所调整，茚检时，若前一个氨基酸是脯氨酸、丝氨酸和组氨酸时则茚检呈红棕色；
(6)切割多肽:从树酯上切割多肽，按步骤(1)中的脱保护方法进行两次；洗涤，洗涤按以下顺序及次数进行洗涤，DMF两次一MeOH三次一DCM三次一DMF 一次一DCM两次，每次两分钟；
所述切割为，将切割试剂加入合成仪中，搅拌柱搅拌三小时，然后将合成仪中的液体抽入球形烧瓶中，并用DCM冲洗3遍，把球形烧瓶装在旋转蒸发仪上蒸发I小时；在旋转蒸发后加2mLTFA冰切30min ;在球形烧瓶中加入乙醚再蒸发4飞次，最后加入冰乙醚在冰上静置30min，白色沉淀即为析出的粗肽；
将含粗肽的乙醚溶液离心2000rpm，2min，得粗肽沉淀，把粗肽在37°C烘箱中烘干，烘干约需3h ；
所述切割 试剂需现配现用，其具体组成配比为:三蒸水0.3mL、苯甲硫醚0.3mL、l，2-二硫醇0.15mL、苯酚0.3mL、三氟乙酸TFA4.95mL ；
(7)粗肽纯化:利用RP-HPLC纯化粗肽，纯化体系为:乙腈，I%。；TFA=309T50% ;流速5min/mL,检测波长是228nm。
[0039]纯化后所得精肽即为本发明ro-Ι蛋白胞外段亲和肽L8，于-80°c保存备用。
[0040]对制备的ro-Ι蛋白胞外段亲和肽L8进行质谱鉴定，结果如图1，符合预期。
[0041]实施例3
为进一步检验亲和肽L8的抗肿瘤活性，发明人以实施例2制备的亲和肽L8进一步做了抗肿瘤相关实验具体实验情况如下:
抑瘤率实验
实验品种:荷结肠癌CT26的BABL/c小鼠，小鼠购买于北京华阜康生物科技股份有限公司。
[0042]实验过程如下:
(O于每只小鼠的右前肢腋下荷IXlO6个瘤细胞，待小鼠的瘤体积达到5(T100mm3时按瘤体积随机分组，分为4组，分别为L8高剂量组、L8低剂量组、5Fu组(阳性对照组)和生理盐水组(阴性对照组)，每组6只。
[0043]所述高剂量是指将ro-Ι亲和肽L8直接溶于生理盐水配成0.25mg/mL的溶液；所述低剂量是指将ro-Ι亲和肽L8直接溶于生理盐水配成0.0625mg/mL的溶液。具体制备时，将ro-1亲和肽L8直接溶于生理盐水后，过滤除菌，_20°C分装保存，备用。
[0044]5Fu用生理盐水稀释到所用剂量(10mg/Kg)后使用，即lmL5Fu原液加19mL生理盐水稀释即可。
[0045](2)皮下给药的方式注射，L8高剂量组按照200(^g/Kg，L8低剂量组按照50(^g/Kg，共给药?天。
[0046]5Fu组(阳性对照组)和生理盐水组(阴性对照组)同样采用皮下注射的给药方式，注射量为0.2mL。各组每天的上午给药。实验期间小鼠自由进食和饮水。
[0047](3)每日测量小鼠体重并记录，绘制曲线，以检验L8毒副作用，结果如图2所示；每日测量肿瘤的长(a)短(b)径，并按公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，结果如图3所示，计算公示为:V=1/2X (aXb2)。
[0048]给药结束的第二天将小鼠脱颈处死取出肿瘤并称重，结果如图4所示。
[0049]从图2可以得知，L8给药组的体重变化在正常范围内，因此，L8肽没有明显的毒副作用。
[0050]从图3、图4我们可知，L8给药组的瘤体积和瘤重比阴性对照生理盐水组都要小，且L8肽的浓度越高，效果越明显，因此L8肽有一定的抗肿瘤活性。
[0051]生存期实验
实验品种:荷B16F10的C57BL/6J小鼠。小鼠购买于北京华阜康生物科技股份有限公司。
[0052]实验过程如下:
(I)于每只小鼠的右前肢腋下荷5X IO5个瘤细胞，待小鼠的瘤体积达到5(T100mm3时按瘤体积随机分组，分为4组，分别为L8高剂量组、L8低剂量组、5Fu组(阳性对照组)和生理盐水组(阴性对照组)，每组6只。
[0053]所述高剂量是指将ro-Ι亲和肽L8直接溶于生理盐水配成0.25mg/mL的溶液；所述低剂量是指将ro-Ι亲和肽L8直接溶于生理盐水配成0.0625mg/mL的溶液。具体制备时，将ro-1亲和肽L8直接溶于生理盐水后，过滤除菌，-20°C分装保存，备用。
[0054]5Fu用生理盐水稀释到所用剂量(10mg/Kg)后使用，即lmL5Fu原液加19mL生理盐水稀释即可。
[0055](2)皮下给药的方式注射，L8高剂量组按照200(^g/Kg，L8低剂量组按照50(^g/Kg，共给药9天。实验期间小鼠自由进食和饮水。
[0056](3)给药9天后停药观察生存期，记录小鼠的死亡时间。
[0057]实验结果如图5所不,从图中可以看出，L8妝闻剂量能明显延长荷瘤小鼠的生存期，直接证明了 L8肽具有抗肿瘤作用。
[0058]现有技术已经表明，PD-1作为一种免疫球蛋白超家族的激活诱导的抑制性受体，PD-1及其配体ro-Ll是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，并介导了肿瘤免疫耐受和逃逸。本发明通过固相筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作时所获得的ro-Ι蛋白胞外段亲和肽L8，作用目标明确，对肿瘤的抑制效果明显，尤其是对结肠癌或黑色素瘤的抑瘤效果显著，且无副作用，能够明显提高实验动物的生存期，因而具有较好的医疗应用前景。PD-1蛋白胞外段亲和肽L8的制备方法较为成熟、完善，便于制备相应的生物医药制品，因而本发明具有较好的实际应用推广意义。
【权利要求】
1.一种ro-1蛋白胞外段的亲和肽L8，其特征在于，该亲和肽L8的氨基酸序列为:Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser,即:S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T-S,分子量为 1293.7。
2.权利要求1所述ro-1蛋白胞外段的亲和肽L8在制备抗肿瘤相关药物中的应用，所述肿瘤为结肠癌瘤或黑色素瘤。
3.权利要求1所述ro-Ι蛋白胞外段的亲和肽L8的制备方法，其特征在于，采用Fomc固相多肽合成法制备。
【文档编号】A61P35/00GK103897036SQ201410110200
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】高艳锋, 李雯雯, 李国栋, 祁元明, 刘蓓媛 申请人:郑州大学