Il-17a/f异二聚体多肽及其治疗用图
【专利说明】IL-17A/F异二聚体多肽及其治疗用途
[0001] 本申请是申请日为2007年11月20日、中国申请号为200780040465. 8、发明名称 为"IL-17A/F异二聚体多肽及其治疗用途"的发明申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明一般涉及本文中称为白介素-17A/F(IL-17A/F)的新的人细胞因子的鉴定 和分离。
[0003] 发明背景
[0004] 胞外蛋白质在多细胞生物体的形成、分化及维持等中发挥重要的作用。许多细胞 个体的命运（例如增殖、迀移、分化、或与其它细胞的相互作用）典型地受自其它细胞和/ 或紧邻环境接受的信息控制。此信息通常由分泌型多肽（例如（促）有丝分裂因子、存活 因子、细胞毒性因子、分化因子、神经肽、及激素）传播，继而所述分泌型多肽被不同的细胞 受体或膜结合蛋白质所接受和诠释。这些分泌型多肽或信号传导分子通常穿过细胞分泌途 径以到达其在胞外环境中的作用位点。
[0005] 分泌型蛋白质具有各种工业应用，包括作为药物、诊断剂（diagnostic)、生物传感 器和生物反应器。目前可获得的大多数蛋白质药物（诸如溶栓剂、干扰素、白介素、红细胞 生成素、集落刺激因子、及各种其它细胞因子）是分泌型蛋白质。它们的受体（其为膜蛋白 质）也具有作为治疗剂或诊断剂的潜力。
[0006] 膜结合的蛋白质和受体能在多细胞生物体的形成、分化及维持等中发挥重要作 用。许多细胞个体的命运（例如增殖、迀移、分化、或与其它细胞的相互作用）典型地受自 其它细胞和/或紧邻环境接受的信息控制。此信息通常由分泌型多肽（例如（促）有丝分 裂因子、存活因子、细胞毒性因子、分化因子、神经肽、及激素）传播，继而所述分泌型多肽 被不同的细胞受体或膜结合蛋白质所接受和诠释。此类膜结合蛋白质和细胞受体包括但不 限于细胞因子受体、受体激酶、受体磷酸酶、细胞-细胞相互作用中牵涉的受体、及细胞粘 附素分子（像选择蛋白和整联蛋白）。例如，调节细胞生长和分化的信号的转导是部分通过 各种细胞蛋白质的磷酸化来调节的。蛋白质酪氨酸激酶（即催化该过程的酶）还可以起生 长因子受体的作用。例子包括成纤维细胞生长因子受体和神经生长因子受体。
[0007] 与分泌型蛋白质类似，膜结合蛋白质和受体分子具有各种工业应用，包括作为药 剂和诊断剂。例如，受体免疫粘附素可用作治疗剂以阻断受体-配体相互作用。膜结合蛋 白质还可以用于筛选相关受体/配体相互作用的潜在肽或小分子抑制剂。
[0008] 工业及学术界都在努力鉴定新的、天然的分泌型蛋白质和天然受体或膜结合 蛋白质。许多努力聚焦于筛选哺乳动物重组DNA文库以鉴定新的分泌型蛋白质的编码 序列。筛选方法和技术的例子记载于文献中[参见例如Klein等，Proc.Natl. Acad. Sci.，93:7108-7113(1996);美国专利 No. 5, 536, 637)]。
[0009] 在这点上，本发明涉及鉴定已经显示与免疫介导的和炎性的疾病有关的白介 素-17 (IL-17)家族的新的分泌型多肽。免疫相关和炎性疾病是相当复杂的、通常是多重 互联的生物学途径的现象或结果，在正常生理学中所述生物学途径对于应答创伤（insult) 或损伤、自创伤或损伤启动修复、及发动针对外来生物体的先天性和获得性防御是至关重 要的。在这些正常生理学途径引起别的创伤或损伤（或是与应答的强度直接相关、或是作 为异常调节或过度刺激的结果、或是作为对自身的反应、或是作为这些的组合）时发生疾 病或病理。
[0010] 虽然这些疾病的发生通常牵涉多步途径且通常牵涉多种不同生物学系统/途径， 但是这些途径的一种或多种中的临界点干涉可具有改善或治疗的效应。治疗性干涉可以通 过拮抗有害过程/途径或刺激有益过程/途径而发生。
[0011] 许多免疫相关疾病是已知的，而且已经被广泛地研宄。此类疾病包括免疫介导的 炎性疾病（诸如类风湿性关节炎、免疫介导的肾病、肝胆病、炎性肠病（IBD)、银肩病、及哮 喘）、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷病、瘤形成等等。
[0012] T淋巴细胞（T细胞）是哺乳动物免疫应答的重要成分。T细胞识别与主要组织相 容性复合体（MHC)内的基因编码的自身分子（self-molecule)结合（associated)的抗原。 该抗原可以与MHC分子一起展示在抗原呈递细胞、受病毒感染的细胞、癌细胞、移植物等的 表面上。T细胞系统清除那些对宿主哺乳动物造成健康威胁的改变的细胞。T细胞包括辅 助性T细胞和细胞毒性T细胞。辅助性T细胞在识别抗原呈递细胞上的抗原-MHC复合物 后大量增殖。辅助性T细胞还分泌多种细胞因子，即淋巴因子，其在B细胞、细胞毒性T细 胞及多种参与免疫应答的其它细胞的活化中发挥中心作用。
[0013] 体液介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答两者中的中心事件是辅助性T细胞 的活化和克隆扩增。辅助性T细胞活化是通过T细胞受体（TCR)-CD3复合物与抗原呈递细 胞表面上的抗原-MHC相互作用而启动的。这种相互作用介导诱导静息辅助性T细胞进入 细胞周期（G0至Gl的转变）的生化事件的级联，而且导致IL-2(有时IL-4)的高亲和力受 体的表达。活化的T细胞行进整个周期，增殖并分化成记忆细胞或效应细胞。
[0014] 在经由TCR介导的信号外，T细胞的活化还牵涉由抗原呈递细胞释放的细胞因子 诱导的或经由与抗原呈递细胞和T细胞上的膜结合分子相互作用而诱导的额外共刺激。已 有显示细胞因子IL-I和IL-6提供共刺激信号。同样，抗原呈递细胞表面上表达的B7分子 与T细胞表面上表达的⑶28和CTLA-4分子之间的相互作用招致（effect) T细胞活化。活 化的T细胞表达数目增加的细胞粘附分子，诸如ICAM-1、整联蛋白、VLA-4、LFA-1、⑶56等 等。
[0015] 某种化合物刺激免疫系统的能力的确立指示是混合淋巴细胞培养或混合淋巴细 胞反应（MLR)中的T细胞增殖。在许多免疫应答中，炎性细胞浸润损伤或感染部位。迀移 细胞可能是嗜中性的、嗜曙红的、单核细胞的或淋巴细胞的，正如可以通过受侵袭组织的组 织学检查来测定的。Current Protocols in Immunology,编 John E. Coligan, 1994, John Wiley&Sons，Inc. 〇
[0016] 免疫相关疾病可以通过抑制免疫应答来治疗。在免疫介导的和炎性的疾病中使用 抑制具有免疫刺激活性的分子的中和性抗体会是有益的。可以利用抑制免疫应答的分子 (直接使用蛋白质或经由使用抗体激动剂）来抑制免疫应答，如此改善免疫相关疾病。
[0017] 白介素-17 (IL-17)是T细胞衍生的促炎性分子，其刺激上皮细胞、 内皮细胞和成纤维细胞生成其它炎性细胞因子和趋化因子，包括IL-6、IL-8、 G-CSF、及 MCP-I [参见 Yao, Z.等，J. Immunol. ,122(12):5483-5486 (1995); Yao, Z.等,Immunity, 3 (6) :811-821 (1995) ；Fossiez, F.等,J. Exp. Med. ,183 (6) :2593-2603 (1996) ;Kennedy，J.等，J. Interferon Cytokine Res. ,16 (8) :611-7 (1996) ;Cai，X.Y.等，Immunol.Lett，62(l) :5 卜 8 (1998); Jovanovic，D.V.等，J. Immunol. ,160 (7) :3513-21 (1998) ;Laan，M.等，J. Immunol. ,162 (4) :2347-52 (1999) ;Linden, A.等，Eur Respir J, 15 (5) :973-7 (2000);及 Aggarwal，S.和 Gurney, A. L·，JLeukoc Biol, 71 (I) :1-8 (2002)]。IL-17 还与其它细胞因 子（包括TNF-α和IL-Ιβ)协同作用以进一步诱导趋化因子表达（Chabaud，M.等，J. Immunol. 161(1) :409-14(1998))。白介素17 (IL-17)对多种类型的细胞展现多效生物学活 性。IL-17还具有诱导ICAM-I表面表达、T细胞增殖、及⑶34+人祖细胞生长并分化为嗜中性 细胞的能力。还已经将IL-17与骨代谢联系起来，而且已有提示其在以存在活化的T细胞和 TNF-α生成为特征的病理性疾患（诸如类风湿性关节炎和骨植入物松弛）中发挥重要作用 (Van Bezooijen等，J. Bone Miner. Res.，14:1513-1521 [1999])。发现自类风湿性关节炎患 者衍生的滑膜组织的活化的T细胞比自正常个体或骨关节炎患者衍生的滑膜组织的活化 的 T细胞分泌更高量的 IL-17 (Chabaud等，Arthritis Rheum.，42:963-970 [1999])。提不该 促炎性细胞因子在类风湿性关节炎中活跃地促成滑膜炎症。除其促炎作用外，IL-17似乎还 通过另一种机制来促成类风湿性关节炎的病理。例如，已有显示IL-17诱导成骨细胞中破 骨细胞分化因子（ODF)mRNA 的表达（Kotake 等，J. Clin. Invest.，103:1345-1352[1999])。 ODF刺激祖细胞分化成破骨细胞，即骨吸收（bone resorption)中牵涉的细胞。因为在类 风湿性关节炎患者的滑液中IL-17水平显著升高，看来IL-17诱导的破骨细胞形成在类 风湿性关节炎中的骨吸收中发挥至关重要的作用。还认为IL-17在某些其它自身免疫病 中发挥关键作用，诸如多发性硬化（Matusevicius等，Mult. Scler.，5:101-104(1999); Kurasawa，K.等，Arthritis Rheu 43(11):2455-63(2000))和银肩病（Teunissen，M. Β·等，J Invest Dermatol 111(4):645-9(1998) ;Albanesi，C.等，J Invest Dermatol 115(1) :81-7(2000);及 Homey, B.等，J. Immunol. 164(12) :6621-32(2000)) 〇
[0018] 已有进一步显示IL-17通过胞内信号传导而刺激人巨噬细胞中Ca2+内向通量 (influx)和[cAMP]丨降低（Jovanovic 等，J. Immunol.，160:3513 [1998])。经 IL-17 处理的 成纤维细胞诱导NF- κ B的活化[Yao等，Immunity, 3:811 (1995) ; Jovanovic等，见上文]， 而经IL-17处理的巨噬细胞活化NF-κ B和由促分裂原活化的蛋白激酶（Shalom-Barek 等，J. Biol. Chem.，273:27467 [1998])。另外，IL-17还与骨及软骨生长中牵涉的哺乳动物 细胞因子样因子7共享序列相似性。与IL-17多肽共享序列相似性的其它蛋白质有人胚胎 衍生的白介素相关因子（EDIRF)和白介素-20。
[0019] 与IL-17广范围的效应一致，已经发现IL-17的细胞表面受体在许多组织和细胞 类型中广泛表达（Yao等，Cytokine，9:794 [1997])。虽然人IL-17受体（IL-R)的氨基酸序 列（866个氨基酸）预测为具有单个跨膜域和一个长的、525个氨基酸的胞内域的蛋白质， 但是受体序列是独特的，而且不与来自细胞因子/生长因子受体家族的任何受体的序列相 似。这与IL-17本身与其它已知蛋白质缺乏相似性结合起来，指明IL-17及其受体可能是 信号传导蛋白及受体的新家族的一部分。已经证明IL-17活性是经由与其独特的细胞表面 受体（本文中称为人IL-17R)结合而介导的，其中先前的研宄显示了 T细胞与可溶形式的 IL-17受体多肽接触抑制了由PHA、伴刀豆球蛋白A及抗TCR单克隆抗体诱导的T细胞增殖 和IL-2生成（Yao等，J. Immunol.，155:5483-5486 [1995])。因此，对鉴定和表征与已知细 胞因子受体，特别是IL-17受体具有同源性的新多肽具有极大的兴趣。
[0020] 目前公认白介素17为细胞因子新出现家族的原型成员。人和其它脊椎动物基因 组的大规模测序揭示了编码明显与IL-17有关的蛋白质的别的基因的存在，如此定义细胞 因子的新家族。在人和小鼠中有IL-17家族的至少6个成员，包括IL-17B、IL-17C、IL-17D、 IL-17E 和 IL-17F 以及新受体 IL-17RH1、IL-17RH2、IL-17RH3 和 IL-17RH4(参见 2001 年 6 月28日公布的W001/46420)。已经证明一个此类IL-17成员（称为IL-17F)结合人IL-17 受体（IL-17R) (Yao 等，Cytokine, 9(11) :794-800(1997))。初始的表征提示，像 IL-17 - 样，数种这些新鉴定的分子具有调控免疫功能的能力。对数种这些因子鉴定出的有力炎性 作用及与主要人类疾病的新出现联系提示这些蛋白质在炎性过程中可具有重要作用，而且 可提供治疗性干预的机会。
[0021] 编码人 IL-17F 的基因位于 IL-17 附近（Hymowitz, S. G.等311113〇· J.，20(19):5332-41(2001))。IL-17 和 IL-17F 共享 44%的氨基酸同一性，而11^-17家族 的其它成员共享更有限的15-27%的氨基酸同一性，这提示IL-17和IL-17F在IL-17家 族内形成独特的亚组（Starnes, T.等，J. Immunol.，167(8) :4137-40(2001) ;Aggarwal, S. 和 Gurney, A. L. , J. Leukoc Biol. , 71 (I) : 1-8 (2002))。IL-17F 表现出具有与 IL-17 相 似的生物学作用，而且能够促进自极其多种细胞生成IL-6、IL-8、和G-CSF。与IL-17类 似，其能够诱导软骨基质释放，并抑制新软骨基质合成（参见2002年11月28日公布的 US-2002-0177188-A1)。如此，像IL-17 -样，IL-17F可潜在地促成炎性病症的病理。最近， 这些作者观察到T细胞中的IL-17和IL-17F两者都是通过白介素23(IL-23)的作用而诱 导的仏883^31，5.等，了.81〇1.〇^111.，278(3):1910-4(2003))。11^-17和11^-17卩共享相似 的染色体定位和显著的序列相似性的观察结果以及IL-17和IL-17F表现出通过相同细胞 群体应答特定刺激而被诱导的观察结果导致新的人细胞因子的鉴定，所述新的人细胞因子 是由IL-17和IL-17F的共价异二聚体组成的（本文中称为IL-17A/F)。人IL-17A/F显然 是新的细胞因子，其与人IL-17和IL-17F在蛋白质结构及基于细胞的活性测定法中都是可 区别的。通过使用纯化的重组人IL-17A/F作为标准品，开发了人IL-17A/F特异性ELISA。 通过使用此特异性ELISA，检测到人IL-17A/F的诱导表达，这证实IL-17A/F是自培养物中 活化的人T细胞天然生成的。因此，IL-17A/F显然是可作为分离的、活化的人T细胞的天然 产物来检测的新的细胞因子，其重组形式在蛋白质结构和基于细胞的测定法中都已经被表 征为与相关细胞因子是不同的且是可区别的。如此，这些研宄提供并鉴定了可加强免疫系 统来应答先前可能不曾具有免疫活性的特定抗原的新免疫刺激物（即IL-17A/F)。因此，新 鉴定的免疫刺激物具有重要的临床应用。该新IL-17A/F细胞因子或其激动剂因此会找到 作为免疫刺激物的实际效用，而抑制IL-17A/F活性的分子（拮抗剂）预期会在期望抑制免 疫应答时（诸如在自身免疫病中）找到实际效用。具体地，此新细胞因子的抗体会拥有治 疗性质，所述抗体模拟（激动性抗体）或抑制（拮抗性抗体）IL_17A/F的免疫学活性。起 抑制该新细胞因子活性的作用的小分子也会具有潜在的治疗用途。
[0022] 发明概述
[0023] A.实施方案
[0024] 本发明涉及对于在哺乳动物（包括人）中诊断和治疗免疫相关疾病有用的组合物 和方法。本发明基于在哺乳动物中刺激或抑制免疫应答的蛋白质（包括激动性和拮抗性抗 体）的鉴定。免疫相关疾病可以通过抑制或增强免疫应答来治疗。增强免疫应答的分子刺 激或加强对抗原的免疫应答。刺激免疫应答的分子可以治疗性用于其中免疫应答的增强会 是有益的情况。或者，抑制免疫应答、减弱或降低对抗原的免疫应答的分子（例如中和性抗 体）可以治疗性用于其中免疫应答的减弱会是有益的情况（例如炎症）。因而，本发明的 IL-17A/F多肽及其激动剂和拮抗剂还可用于制备药品和药物，其用于免疫相关的和炎性的 疾病的治疗。在一个具体的方面中，此类药品和药物包含治疗有效量的IL-17A/F多肽、其 激动剂或拮抗剂及药学可接受载体。优选地，该混合物是无菌的。
[0025] 在进一步的实施方案中，本发明涉及一种鉴定IL-17A/F多肽的激动剂或拮抗剂 的方法，其包括使IL-17A/F多肽与候选分子接触，并监测由所述IL-17A/F多肽介导的生物 学活性。优选地，IL-17A/F多肽是天然序列IL-17A/F多肽。在一个具体的方面中，IL-17A/ F激动剂或拮抗剂是抗IL-17A/F抗体。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明涉及包含与载体或赋形剂混合的IL-17A/F多肽或 能结合所述多肽的激动性或拮抗性抗体的物质组合物。一方面，组合物包含治疗有效量的 多肽或抗体。另一方面，在组合物包含免疫刺激性分子时，该组合物可用于：(a)增强炎性 细胞浸润入有所需要的哺乳动物的组织中，（b)在有所需要的哺乳动物中刺激或增强免疫 应答，（c)在有所需要的哺乳动物中增加 T淋巴细胞应答抗原的增殖，（d)刺激T淋巴细胞 的活性，或（e)增加血管通透性。在进一步的方面中，在组合物包含免疫抑制性分子时，该 组合物可用于：(a)减弱炎性细胞浸润入有所需要的哺乳动物的组织中，（b)在有所需要的 哺乳动物中抑制或降低免疫应答，（c)降低T淋巴细胞的活性，或（d)在有所需要的哺乳动 物中减少T淋巴细胞应答抗原的增殖。另一方面，组合物包含别的活性成分，其可以是例如 别的抗体或细胞毒剂或化疗剂。优选地，所述组合物是无菌的。
[0027] 在另一个实施方案中，本发明涉及在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关 病症的方法，其包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的IL-17A/F多肽、其激动剂、 或其诘抗剂。在一个优选的方面中，免疫相关病症选自：系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosis)、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis)、骨关节炎 (osteoarthritis)、幼年型慢性关节炎（juvenile chronic arthritis)、脊椎关节 病（spondyloarthropathies)、系统性硬化（systemic sclerosis)、特发性炎性肌病 (idiopathic inflammatory myopathies)、斯耶格伦氏综合征（Sjdgren'S syndrome)、 系统性血管炎（systemic vasculitis)、结节病（sarcoidosis)、自身免疫性溶血 性贫血（autoimmune hemolytic anemia)、自身免疫性血小板减少症（autoimmune thrombocytopenia)、甲状腺炎（thyroiditis)、糖尿病（diabetes mellitus)、免 疫介导的肾病（immune-mediated renal disease)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘 病(demyelinating diseases of the central and peripheral nervous systems) (诸如多发性硬化（multiple sclerosis)、特发性脱髓鞘多神经病（idiopathic demyelinating polyneuropathy)或格-巴二氏综合征（Guillain-Barre syndrome)、及 慢性炎性脱髓鞘多神经病（chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy))、 肝胆病（hepatobiliary diseases)(诸如传染性、自身免疫性慢性活动性肝炎 (infectious, autoimmune chronic active hepatitis)、原发性胆汁性月干硬化（primary biliary cirrhosis)、肉芽肿性肝炎（granulomatous hepatitis)、及硬化性胆管炎 (sclerosing cholangitis))、炎性肠病（inflammatory bowel disease)、鼓胶敏感性 肠病（gluten-sensitive enteropathy)、及惠普尔氏病（Whipple's disease)、自身免 疫或免疫介导的皮肤病（autoimmune or immune-mediated skin diseases)(包括大疱 性皮肤病（bullous skin diseases)、多形红斑（erythema multiforme)、及接触性皮炎 (contact dermatitis))、银肩病（psoriasis)、变应性疾病（allergic diseases)(诸如哮 喘（asthma)、变应性鼻炎（allergic rhinitis)、特应性皮炎（atopic dermatitis)、食物超 敏反应（food hypersensitivity)及荨麻疹（urticaria))、肺的免疫学疾病（immunologic diseases of the lung)(诸如嗜曙红细胞性肺炎（eosinophilic pneumonia)、特发 性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis)及超敏感性肺炎（hypersensitivity pneumonitis))、移植相关疾病（transplantation associated diseases)(包括移植物排 斥（graft rejection)和移植物抗宿主病（graft -versus-host-disease)) 〇
[0028] 在另一个实施方案中，本发明提供了能特异性结合任何上文或下文所述多肽的抗 体。任选地，所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段或单链抗体。一方面，本发明涉 及能结合IL-17A/F多肽的分离的抗体。另一方面，所述抗体模拟IL-17A/F多肽的活性（激 动性抗体），或者相反地，所述抗体抑制或中和IL-17A/F多肽的活性（拮抗性抗体）。另一 方面，抗体是单克隆抗体，其优选具有非人的互补决定区（CDR)残基和人框架区（FR)残基。 抗体可以是经过标记的或带标记物的，而且可以是固定化在固体支持物上的。在进一步的 方面中，抗体是抗体片段、单克隆抗体、单链抗体、或抗独特型抗体。另一方面，抗体片段或 单链抗体包含选自图6中所示下组氨基酸序列的Fab片段：SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: KKSEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID N0:20,SEQ ID N0:2USEQ ID N0:22,SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID N0:29,SEQ ID N0:30,SEQ ID N0:3USEQ ID N0:32,SEQ ID N0:33,SEQ ID N0:34,SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、