干扰素α和ω抗体拮抗剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及广泛中和的干扰素-α和干扰素-ω抗体拮抗剂，编码抗体或片段的 多核苷酸、以及制造和使用上述物质的方法。
【背景技术】
[0002]I型IFN是一类细胞因子，该细胞因子均通过遍在表达的异二聚体受体（IFNAR)进 行信号传导，从而产生抗病毒、抗增殖和免疫调节的效应。在人体中，I型IFN由至少12个 IFNa蛋白亚型以及IFN0、IFNε、IFNk和IFNco各一个亚型进一步结合。I型IFN的诱 导响应于无菌和微生物配体而发生。尽管I型IFN的抗病毒和抗增殖效果已经在临床中用 于治疗感染性疾病和肿瘤适应症，但I型IFN的拮抗剂正被开发以用于免疫介导的炎性适 应症。
[0003] 许多免疫介导的炎性疾病，诸如SLE、I型糖尿病、牛皮癣、原发性干燥病、系统性 硬化病和类风湿性关节炎，均证明I型IFN可升高到不同的程度，如通过存在于全血和/或 组织中的通常称为IFN-特征的IFN诱导基因转录物的过量所确定。
[0004]目前用于狼疮的临床开发的I型IFN拮抗剂方法包括使用抗IFN a抗体中和 IFNa亚型而非其他I型IFN(i3，ε，κ，ω)的多种方法，所述抗体诸如在以下专利中所述 的那些：美国专利7, 087, 726、美国专利8, 025, 882和美国专利申请公布US2008/0160030。 临床实验数据表明，用抗IFN a抗体治疗过的患者中I型IFN特征部分减少（Merrill等人， AnnRheumDis70:1905-1913, 2011;Yao等人，ArthritisRheum60:1785-1796,2009)， 并且在干扰素特征度量标准（ISM)-低中到严重活性狼疮受试者的预先指定的生物标记 定义组中，在第24周，SLE的病征和症状、发斑速率和类固醇负担均得以改善。在预定义 为ISM高的患者中没有观察到任何功效（Kalunian等人，2012ACR/ARHPAnnualMeeting; Abstract#2622,2012)〇
[0005] 抗IFNAR1抗体是治疗狼疮的另一个选择（Wang等人，2013;Clinical Pharmacology&Therapeuticsacceptedarticlepreview14February2013 ； doi:10. 1038/clpt.2013.35)。IFNAR1 阻断预计将破坏由所有I型IFN(包括IFN0) 诱导的IFN信号传导。由于编码IFNi3的基因的特异性缺失引发病毒宿主相比于相似 暴露的具有功能性IFNβ的小鼠而目易感性显者，所以IFNβ可在抗病毒防御中发挥 更关键的作用（Lazear等人，JVirol85:7186-7194, 2011;Deonarain等人，JVirol 74:3404-340, 2000;Deonarain等人，Circulation110:3540-3543, 2004;Gerlach等人，J Virol80:3438-3444, 2006)〇
[0006]因此，需要另外的抗体来治疗狼疮和其他免疫介导的炎性疾病。
【附图说明】
[0007] 图1示出了由图lA)100U/ml内源白细胞IFN(病毒诱导）或图lB)250U/ml重组 人IFNco在特定浓度下诱导的对全血中IP-10释放的抑制。
[0008] 图2示出了对I型IFN的抑制，该抑制是由来自系统性红斑狼疮（SLE)患者的免 疫复合物诱导的，该复合物由所示的不同抗体构成。与单独的抗IFNa抗体相比，抗IFNa1 和抗IFNω的组合、抗IFNa2和抗IFNω的组合、或抗IFNa3和抗IFNω的组合提供更显 著的抑制。广泛中和抗IFNa/IFNco抗体（Μ43)显示出对总活性的进一步抑制。
[0009]图3示出了使用抗IFNco、抗IFNa抗体或两者的组合，升高的SLE基因特征的抑 制百分比（％)。将未经抗体处理的情况下基线升高的IFN诱导基因表达归一化为100%。
[0010] 图4示出了IFNco /FabM43复合物的总体分子结构。标记为Η的是VH;标记为L的 是VL，左上方是IFNco。
[0011] 图5示出了图5A)的IFNa4A/Fab357复合物和图5B)的IFNω/Fab357复合物的 总体分子结构。对于Fab仅示出Fv部分。Fab537是C2595的Fab。
[0012] 图6A)示出了IFNa4A/FabM88复合物的总体分子结构。图6B)示出围绕抗原结 合位点的表位区域的一部分的代表性电子密度（2mF〇-DFc为1. 5σ)。标记为Η的是VH;标 记为L的是VL;左上方是IFNα4Α。
[0013] 图7示出了IFNa4Α的结构及其与IFNco和IFNa的比较。图7Α)示出了IFNa4Α。 标记了五个主要的螺旋。还标记了紧挨着短螺旋片段的长连接环AB。图7B)示出了 IFNco(pdb代码 3se4)并且图 7C)示出了IFN0(pdbidlaul)。图 7D)示出了与IFN0 的 结构比对。椭圆框表示AB螺旋片段周围的主要差异。
[0014]图 8.通过M88 中和的模式。IFNco/IFNARl/IFNAR2 结构（pdbid3se4)和M88/ IFNa4在IFN上重叠。
【发明内容】
[0015] 本发明的一个方面是分离的单克隆抗体，该单克隆抗体结合至人干扰素 ω(IFNco)和至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种人干扰素a(IFNa)亚型并中 和其活性。
[0016] 在本发明的其他方面，该分离的抗体竞争结合到人IFNco和人IFNa亚型 IFNaB2、IFNaF、IFNaG和/或IFNaJ1上，其中所述分离的抗体包含：
[0017]SEQIDN0:23的重链可变区（VH)氨基酸序列和SEQIDN0:24的轻链
[0018] 可变区（VL)氨基酸序列；或
[0019]SEQID N0:27的VH氨基酸序列和SEQID N0:28的VL氨基酸序列。
[0020]
[0021] 在本发明的另外方面，该分离的抗体在SEQIDN0:1的一个或多个残基F27、L30 和R33处结合IFNc〇4a;该分离的抗体在SEQIDN0:19的一个或多个残基F27、L30和R33 处结合至IFNa4a;该分离的抗体抑制系统性红斑狼疮（SLE)免疫复合物诱导的IFN的活 性。
[0022] 本发明的另外的方面是编码本发明的抗体的分离的多核苷酸以及药物组合物，该 药物组合物包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。
[0023] 本发明的另一方面是一种治疗或预防与IFNα和IFNco生成增加相关联的疾病的 方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或 预防该疾病的时间。在本发明的一个另外的方面，与IFNa和IFNco生成增加相关联的疾 病是系统性红斑狼疮（SLE)。
[0024] 本发明的另一方面是在对其有需求的患者体内抑制IFNco和IFNa亚型IFNaB2、 IFNaF、IFNaG和/或IFNaJ1与IFNAR的相互作用的方法，该方法包括将本发明的分离 抗体向患者施用足以预防IFNco和IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、IFNaF、IFNaG和/或 IFNaJ1与IFNAR的相互作用的时间。
【具体实施方式】
[0025] 本说明书中所引用的所有出版物（包括但不限于专利和专利申请）均以引用方式 并入本文，如同在本文中完整给出。
[0026] 应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非旨在进行限制。 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术 人员通常所理解的含义相同。
[0027] 虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检 验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使 用以下术语。
[0028] 如本文所用，术语"特异性结合"或"特异性地结合"或"结合"是指抗体以比针对 其他抗原更高的亲和力结合于预定的抗原。通常，抗体以1X10 7M或更小，例如1X10SM或更小、1X10 9M或更小、1X10 或更小、1X10nM或更小、或1X10 12M或更小的解离常 数（KD)结合于预定的抗原，通常KD为其结合至非特异性抗原或表位（例如BSA、酪蛋白） 的KD的至少十倍。可以使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性结合至预定抗原的抗 体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如对于来自其他物种（同源）的相同预定抗 原，诸如人或猴，例如食蟹猕猴（Macacafascicularis) (cynomolgus，cyno)或黑猩猩（Pan troglodytes) (chimpanzee,chimp)具有交叉反应性。特异性结合至预先确定的抗原的抗体 可进一步结合在两个或多个不同抗原诸如干扰素a(IFNa)和干扰素ω(IFNco)之间共享 的表位；即抗体与IFNa和IFNco交叉反应。
[0029] 如本文所用，术语"中和"或"中和抗体"或"抗体拮抗剂"意指通过任意机制部分 抑制或完全抑制干扰素a(IFNa)和/或干扰素ω(IFNco)的生物活性的抗体或抗体片 段。中和抗体可使用如下所述对IFNa和/或IFNco的生物活性的测定来鉴定。IFNa和/ 或正~〇中和抗体可使所测量的正~€1和/或正~〇生物活性抑制20%、30%、40%、50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0030] 如本文所用，术语"干扰素-a "(IFNa)意指人a干扰素的所有天然亚型。天然的 IFNa由多于23种紧密相关的蛋白亚型组成，这些蛋白亚型由具有高度结构同源性的不同 基因编码（Weissmann和Weber，Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol.，33:251，1986 ;Roberts等 人，J. Interferon Cytokine Res. 18:805-816, 1998)。人IFN α亚型为至少IFN a A (IFN a 2) (SEQ ID N0:5)、IFNaB2(IFNa8)(SEQ ID NO:6)、IFNaC(IFNal〇)(SEQ ID N0:7)、 IFNa D (IFNa 1) (SEQ ID NO: 8) ^ IFN a F (IFN a 21) (SEQ ID NO: 9) ^ IFN a G (IFN a 5) (SEQ ID NO :10)和IFNa H (IFN a 14) (SEQ ID NO: 11)、具有P34H取代的IFN a I (IFN a 17) (SEQ ID NO: 12)、IFNa J1 (IFNa 7) (SEQ ID NO: 14)、IFNa K(IFNa 6) (SEQ ID NO: 14)、 IFN a 4b (IFN a 4) (SEQ ID NO: 15)和IFNa WA (IFN a 6) (SEQ ID NO: 16)。人干扰素的命名 详见：http: //www_genenames_org/genefami1ies/_IFN〇
[0031] 如本文所用的，术语IFNco意指具有一定氨基酸序列的人IFNco，该氨基酸序列如 SEQIDNO: 1 和UniProt登录号P05000 所示。
[0032] 术语"I型干扰素"意指人干扰素_α的所有天然亚型以及干扰素、干扰素-ε、 干扰素_ω和干扰素-κ的一个亚型，这些干扰素都结合至通用干扰素受体IFNAR上。
[0033] 如本文所用，术语"IFNAR"意指熟知的异二聚体干扰素受体，S卩IFNAR1和IFNAR2。 IFNAR1和IFNAR2蛋白序列分别如SEQIDN0:31和SEQIDN0:32所示。IFNAR1成熟的胞 外域跨SEQIDN0:31的第28-436位残基，而IFNAR2成熟的胞外域跨SEQIDN0:32的第 27-243位残基。
[0034] 如本文所用，术语"抗体"含义广泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体；单 克隆抗体，包括鼠、人、人适应性、人源化和嵌合单克隆抗体；抗体片段；由至少两个完整抗 体或抗体片段所形成的双特异性或多特异性抗体；二聚体、四聚体或多聚体抗体；以及单 链抗体。
[0035] 免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgApIgArlgGpIgGpIgG；^IgG4。任 何脊椎动物物种的抗体轻链可基于其恒定域的氨基酸序列被指定至两种明显不同类型中 的之一，即κ(κ)和λ(λ)。
[0036] 术语"抗体片段"是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链和/或轻链抗原结合 位点，诸如重链互补决定区（HCDR)1、2和3,轻链互补决定区（IXDR)1、2和3,重链可变区 (VH)或轻链可变区（VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab'）2、Fd和Fv片段以及由一个VH 域组成的域抗体（dAb)JH域和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗 体设计，其中在VH域和VL域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL域在分子内或 分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体（diabody);例如在 国际专利公布W01998/44001，国际专利公布W01988/01649,国际专利公布W01994/13804， 国际专利公布W01992/01047中有所描述。
[0037] 抗体可变区由被3个"抗原结合位点"中断的"构架"区组成。使用多个术语来定 义抗原结合位点：（丨）三个在￥!10?1?1、!《1?2、!《1?3)中且三个在￥1^(1^〇)1?1、1^〇)1?2、1^〇)1?3) 中的互补决定区（CDR)，基于序列变异性（Wu和Kabat，JExpMed132:211-50,1970; Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第 5 版。PublicHealth Service，NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md·，1991)。（ii)三个在VH(HI、H2、 H3)中且三个在VL(Ll、L2、L3)中的"超变区"、"HVR"或"HV"，是指抗体可变域中的在结构 上超变的区域，如Chothia和Lesk所定义（Chothia和Lesk，MolBiol196:901-17,1987)。 其他术语包括"頂GT-CDR"（Lefranc等人，DevComparatImmunol27:55-77, 2003) 和"特异性决定残基用途"（SDRU) (Almagro,MolRecognita: 132-43, 2004)。国际 ImMunoGeneTics(IMGT)数据库（http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编 号和定义。⑶R、HV与IMGT划分之间的对应性描述于Lefranc等人，DevComparatImmunol 27:55-77, 2003〇
[0038] 如本文所用，"Chothia残基"是抗体VL和VH残基，其根据Al-Lazikani来编号 (Al-Lazikani等人，JMolBiol273:927-48,1997)。
[0039]"框架"或"框架序列"是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的 其余序列。因为抗原结合位点可以由如上所述的不同术语定义，所以框架的精确氨基酸序 列取决于如何定义抗原结合位点。
[0040]"人抗体"或"完全人抗体"是指包含来源于人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区 序列的抗体。本发明的人抗体可包括替换，因此其可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基 因序列的精确拷贝。然而，"人抗体"的定义并不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
[0041] "人适应性"抗体或"人框架适应性（HFA) "抗体是指根据美国专利公布 US2009/0118127中所描述的方法适应化的抗体，并且也指将来源于非人物种的抗原结合位 点序列移植到人框架的抗体。
[0042]"人源化抗体"是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免 疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括替换，因此该框架可能不是表达的人 免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。
[0043] 如本文所用，术语"单克隆抗体"是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体 组合物对特定表位呈现出单一的结合特异性和亲和力。
[0044] 如本文所用，术语"基本上相同"意指被比较的两个抗体可变区氨基酸序列是相同 的或具有"非显著性差异"。非显著性差异是指抗体或抗体可变区域序列中有1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10或11个氨基酸被替换，这些替换不会对抗体的性质造成不利影响。与本文所 公开的可变区序列基本上相同的氨基酸序列在本申请范围内。在一些实施例中，所述序列 同一性可为约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。同一性百 分数可以例如通过使用VectorΝΤΙV. 9.0.0 (Invitrogen，Carslbad，CA)的AlignX模块的 默认设置的配对比对而确定。本发明的蛋白质序列可以用作查询序列以针对公共或专利数 据库进行检索，以例如鉴定相关序列。用来进行此类检索的示例性程序是使用默认设置的 XBLAST或BLASTP程序（http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)或GenomeQuest?(GenomeQuest， Westborough，MA)软件包。
[0045] 如本文所用，术语"表位"意指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部 分（moiety)(如氨基酸或多糖侧链）的化学活性（例如，极性、非极性或疏水性）表面定群 (grouping)构成，并且可以具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象 空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列中不同 部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
[0046] 如本文所用的"互补位"意指抗体的与抗原特异性结合的部分。互补位可以是本 质上线性的，或者可以是不连续的，通过抗体的非邻近氨基酸之间的空间关系形成，而非通 过线性系列的氨基酸的空间关系形成。"轻链互补位"和"重链互补位"或"轻链互补位氨基 酸残基"和"重链互补位氨基酸残基"分别指与抗原接触的抗体轻链和重链残基。
[0047] 如本文所用，"双特异性"是指结合两个不同抗原或抗原内的两个不同表位的抗 体。在双特异性抗体与IFNa和IFNco交叉反应的情况下，双特异性抗体可结合两个或更 多个不同抗原。
[0048] 如本文所用，"单特异性"是指结合一个抗原或一个表位的抗体。在单特异性抗体 与IFNa和IFNo交叉反应的情况下，单特异性抗体可结合两个或更多个不同抗原。
[0049] 如本文所用，术语"与...组合"意指所述的各试剂可以在混合物中一起、作为单 一试剂同时地或作为各单一试剂以任何顺序依次地施用至动物。
[0050] 如本文所用，术语"IFNα生物活性"和"IFNω生物活性"是指由于IFNα和IFNω 分别结合至其受体IFNAR而产生的任何活性。一种IFNa和IFNco生物活性是IFNa和 IFNco在HEK293细胞中在诸如ISG54的干扰素诱导启动子作用下诱导分泌型胚胎碱性磷酸 酶（SEAP)表达的能力，该HEK293细胞能运用标准方法稳定地表达信号传导子及转录激活 子2(STAT2)、干扰素调节因子9(IRF9)和SEAP。另一种IFNa和IFNco生物活性是诱导从 外周血单核细胞（PBMC)或如本文所述的全血产生趋化因子IP-IO(CXCLIO)。
[0051]表1·
[0052]
[0053]
[0054] 术语"载体"是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载 体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记的元件，其功能是促进这 些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动物、植 物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分 子或这些分子的杂合分子。
[0055] 术语"表达载体"是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载 体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
[0056] 术语"多核苷酸"是指包含由糖-磷酸主链或其他等同的共价化学方式所共价连 接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型例 子。
[0057] 术语"多肽"或"蛋白质"是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基 的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作"肽"。
[0058] 本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
[0059] 物质的组成
[0060] 本发明提供结合至人干扰素ω(IFNco)和多种人干扰素a(IFNa)亚型（IFNa/ω抗体）并中和其活性的单克隆抗体。本发明至少