Nα4A和IFNω上几乎相同的构象表位，所述表位由AB环（R/ G22和R/H34之间）残基和螺旋Ε的残基V143、M/A146、E147和R/K150构成（表9)。互补 位由六个⑶R中的四个（⑶R-L1、L3、H2和H3)的残基构成。互补位残基主要为疏水性的， 形成一系列袋，与短AB螺旋的残基F27、L30、K31和R33的侧链对接。抗体和抗原的相互作 用显示多为范德华力和疏水性堆积。抗体和抗原之间只存在少数氢键，并且其中大部分涉 及主链-主链或侧链-主链相互作用。多数Ab/Ag相互作用是由AB螺旋的若干残基F27、 L30、K31和R33造成的。因此，IFNco这一区域看来是构成表位的主要部分。
[0304] 表9.抗体C2595的表位和互补位。示出了所有六个复合物的接触残基。枏据 IFN-coSEQIDN0:1 和IFN-α4aSEQIDN0:19 的残基编号。
[0305]
[0306] 结合配偶体中所有3.9A以内的残基考虑为接触残基。对抗体VL和VH残基按顺 序编号。
[0307]抗体中和的樽式
[0308]C2595通过阻断IFNAR2/IFN相互作用进行中和。
[0309] 实例7衍生自具有IFNα4A的复合物中的抗-IFNα抗体M88的晶体结构的M88 表位
[0310] 具有IFNa4Α的复合物中的抗-IFN抗体Μ88的晶体结构测定为2.5人&主要表位 是IFN的AB环中的螺旋单体A19-D35。M88的结合会阻止IFNAR2相互作用。因此，M88是 一种IFNAR2阻断剂。该结构阐明了M88结合的交叉反应性。
[0311] IFWM88(其mAb和Fab在下文中分别称为M88和FabM88)是一种中和人IFN α的 抗体。M88mAb显示可结合至数种IFNa亚型，但很少结合至人IFNco。
[0312]材料和方法
[0313]蛋白质
[0314] 在HEK293F细胞中克隆并表达His-标记的FabM88 (IgGl/kappa同型），并使用亲 和色谱和体积排阻色谱进行纯化。Fab溶于20mMTris(pH7. 4)、50mMNaCl中。IFNa4A购 于CrownBioscienceInc.(溶于 20mMTris(pH7· 4)、50mMNaCl中）。
[0315]IFNa4A/FabM88 复合物的结晶
[0316] 将IFNa4A与FabM88以摩尔比1. 05:1. 0(过量IFNa4A)混合制备复合物， 4°C下温育一小时，使用20mMTris(pH8. 0)、10%甘油、0. 1MNaCl稀释20倍，然后使用 Amicon-UltralOkDa截留值将其浓缩至 9.25mg/ml。使用IH1、IH2 和PEG套件（Qiagen) 建立初步结晶。复合物的结晶使用0ryx4机器人（DouglasInstruments)通过蒸气扩散法 在20°C下进行。晶体从IH2#E12-25%PEG3K、0. 2M柠檬酸铵中析出。使用这些初始晶体 制备结晶晶种。为了改善晶体质量，在使用20mmMES(pH6. 5)、0. 1ΜNaCl、10%甘油平衡的 Superdex200 柱（GEHealthcare)上纯化IFNa4A/FabM88 复合物，并将其浓缩至 8. 16mg/ ml。根据（Obmolova等人，ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66:927-935,2010)所 述，从丽S接种的28%PEG3K、0. 2M柠檬酸铵中得到适用于X衍射的晶体。
[0317]X射线数据采集和结构测宙
[0318] 对于X射线数据采集，将一种晶体在补充有20%甘油的母液中浸泡几秒并以95Κ 氮流快速冷冻。使用配备有Osmic?VariMax?共聚焦光学器件、Saturn944CXD检测器和 X-stream? 2000cryo冷却系统（Rigaku，TX)的RigakuMicroMax?-〇07HF微焦X射线发生 器采集X射线衍射数据。通过235°晶体旋转在半度图像中检测衍射强度。使用程序XDS 处理X射线数据。表10中给出了X射线数据统计。
[0319] 使用Phaser通过分子置换法（MR)解析结构。MR的搜索模型是Fabl5的晶体结 构（PDBID3NCJ)和IFNa2的晶体结构（PDBID1RH2)，其Ca模型可在PDB中获取。若 要用于MR，通过MR使用Phaser以及Ca坐标和TOB中的反射数据，得到IFNa2的完整分 子模型，并使用PHENIX进行精修。使用PHENIX对IFNa4A/FabM88结构进行精修，并使用 C00T进行模型调整。所有其他晶体计算均使用CCP4套件程序执行。使用程序RB0W计算可 变域和恒定域之间的肘角。使用PyMol生成所有分子图形。表10中给出了结构精修统计。
[0320]表10.晶体数据和精修统计。
[0321]
[0323] a括号中为高分辨率层的值。
[0324] b完整度低是因为最高分辨率层仅包含检测器拐角处的反射。
[0325] MM.
[0326]整体结构
[0327] 图6中示出了IFNa4A/FabM88复合物的整体分子结构。在不对称单元中存在这些 复合物中的两种。两个独立IFNa4A分子的分子模型中一个包含第7-102位和第113-160 位残基，另一个包含第12-102位和第113-160位残基。两个分子中第103位和第112位残 基之间的连接环都是无序的。两个Fab分子的轻链包含从第1位至第212位的残基，重链 包含从第1位至第221位的残基。C-端6xHis标签和链间二硫键是无序的。
[0328] 两个IFNa4A分子具有基本相同的构象，122Ca原子的平均rmsd为〇,丨32/\。两 个Fab分子还具有相同的结构，整个Fab的平均rmsd小于0.5A有趣的是，根据RB0W显示， 两个Fab具有几乎相同的肘角（172度和174度）。
[0329] IFNa结构
[0330] IFNa4A的分子结构（图7A)与IFNa2非常相似，平均Carmsd为0· 5至 与IFNco(图 7B，112 个残基的Carmsd为 〇.6?Α)和IFN0 (图 7C，94个残基的Carmsd为0.85A)也十分相似。由于IFNβΑΒ环中的一个较短残基，IFNa/ω和IFNβ之间存在 一些显著差异（图7D)。
[0331]表位、互补位及Ab/Ag相互作用
[0332]M88识别了由AB环（A19和D35之间）残基和螺旋E的残基V143、A146、E147和 R150构成的构象表位（表11)。互补位由所有六个CDR的残基构成。互补位残基主要为疏 水性的，形成一系列袋，与短AB螺旋的残基F27、L30、K31和R33的侧链对接。抗体和抗原 的相互作用显示多为范德华力和疏水性堆积。抗体和抗原之间只存在少数氢键，并且其中 大部分涉及主链-主链或侧链-主链相互作用。多数Ab/Ag相互作用是由AB螺旋的若干 残基F27、L30、K31和R33造成的。因此，IFNa4A这一区域是构成表位的主要部分。VL的 F50与结构中的抗原未直接接触。但是其侧链在Y32(VL)和P105(VH)附近，参与结合。可 能是由于其支持CDR-H3局部结构进行有利结合，而选择这一残基。
[0333] 表11.抗体M88的表位和互补位。
[0334]
[0335] 结合配偶体中所有3.9A以内的残基考虑为接触残基。对抗体VL和VH残基按顺 序编号。LHI和ABJ代表两种复合物。
[0336] 基于结构的f库设计，以改善夺叉反应件和亲和力
[0337] M88强力结合数种IFNa亚型，但与IFNco结合较弱。基于当前复合物结构以及使 用IFNco结构进行的分子建模，有两种可能的策略。一种策略是通过建立另外的Ab/Ag相 互作用并同时保持IFNa4A/M88结构中的所有当前接触，延伸CDR-L1 (extLl文库）。结构 和序列对比表明，在所有IFNa亚型中，有5个残基表面块?32、!134、035、￥130和1(134)是 100%保守的（表12)。
[0338] 表12.
[0339]
[0340] 在IFNco中，除代替H34的R34外，这5个残基中的四个也是保守的。⑶R-L1与 这一高度保守的表面块距离较远。因此假设，较长的CDR-L1，例如在3-1-1典型结构中含 有另外6个残基的种系IGKV4-1 (B3)，将足够长以接触此块。较长的CDR-L1将提供与所有 IFNa亚型和IFNco的另外的相互作用，从而改善亲和力并扩大特异性。延伸的⑶R-L1的 序列可通过噬菌体展示文库进行优化。表13示出了噬菌体展示文库的设计。背向抗原的 extLl位置不是随机化的。VL的位置F50是唯一一个非人种系残基。其在结构上看来是为 ⑶R-L3提供支持。因此，这一位置也是随机化的，以优化其对延伸的⑶R-L1的支持。
[0341]表 13.
[0342]
[0343]X为任何氨基酸
[0344] 抗体中和的樽式
[0345] 最近报道了具有IFNAR1和/或IFNAR2的复合物中IFNa/ω的晶体结构 (Thomas等人，Cell 146:621-632,2011)。图8示出了M88/IFNa 4在IFNco/IFNARl/ IFNA 2复合物上的重叠。很明显HC和IFNA R2也将重叠。因此，M88通过阻断IFNA R2/ IFN相互作用进行中和。
[0346] 实例8IFNa和IFNco卜.的最小表位提供广泛的IFNa/IFNco中和活件
[0347]IFNωT80E/FabM43、IFNa4A/FabM88、IFNa4A/Fab357 (c2595)和IFNω/Fab357 的晶体结构限定了广泛中和IFNco和多个IFNa亚型所需的最小共同表位（表14)。对四 种晶体结构中抗体/抗原相互作用的分析表明，IFNa4a(SEQIDN0:19)和IFNco(SEQID NO: 1)中AB环的三个残基F27、L30和R33与抗体形成广泛接触。这些残基可能为抗体结 合提供主要贡献。因此，F27、L30和R33是IFNco/IFNa交叉中和表位的关键元素。
[0348] 构象表位由具有短螺旋片段（27-29)的AB环残基（SEQIDNO: 1的IFNco及SEQ IDNO: 19的IFNa4a中的第22-34位残基）和螺旋E中的残基（第134-154位是螺旋E与 IFNco和除IFNa2(其为第133-153位）外的所有IFNa亚型相同的残基）构成。具体地， SEQIDN0:l的IFNω中位置P26、F27、L30、K31、R33和H34，与SEQIDN0:19的IFNa4a 中残基H26、F27、L30、K31、R33和H34被中和抗体所识别。这些残基在不同IFNa亚型和 IFNco之间是高度保守的，因此造成这些抗体的交叉反应性和差分特异性，尽管它们来自不 同来源。另外的表位残基为IFNco的R22、R23、124、S25、D32、D35、M149、K150 或L154 和 IFNa4a的残基A19、G22、R23、124、S25、H26、F27、C29、L30、K31、D32、R33、H34、D35、V143、 A146、E147、M149、R150 或S153。
[0349]表 14.
[0350]
[0351]
【主权项】
1. 一种分离的单克隆抗体，其结合至（a)人干扰素ω(IFNco)和（b)至少四种、五种、 六种、七种、八种、九种或十种人干扰素a(IFNa)亚型并且中和其活性。2. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNαB2、IFNaF、 IFNaG和IFNaJ1并且中和其活性。3. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNα亚型IFNaB2、IFNaC、 IFNaF、IFNaG和IFNaJ1并且中和其活性。4. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、 IFNaF、IFNaG、IFNaJ1和IFNaA并且中和其活性。5. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、 IFNaF、IFNaG、IFNaJl、IFNaA和IFNaH2 并且中和其活性。6. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、 IFNaF、IFNaG、IFNaJl、IFNaA、IFNaH2 和IFNaK并且中和其活性。7. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、 IFNaF、IFNaG、IFNaJl、IFNaA、IFNaH2、IFNaK和IFNaM并且中和其活性。8. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合至人IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、 IFNaF、IFNaG、IFNaJl、IFNaA、IFNaH2、IFNaK、IFNaWA和IFNa4a并且中和其活性。9. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述人IFNco和所述人IFNa亚型的所述活性 是在稳定表达信号传导子和转录激活子2(STAT2)、干扰素调节因子9(IRF9)和SEAP的 HEK293细胞中，在所述干扰素诱导型ISG54启动子作用下抑制分泌型胚胎碱性磷酸酶 (SEAP)表达。10. 根据权利要求9所述的抗体，其中在实例3中"亲和力测量"部分下定义的条件 下，所述抗体抑制IC5。值为约5X10SM或更小、约1X10SM或更小、约1X109M或更小、 约1X10 或更小、约1X10nM或更小、或约1X1012M或更小的人IFNco的活性，并抑制 IC5。值为约5X10SM或更小、约1X10SM或更小、约1X109M或更小、约1X10 或更小、 约1X10nM或更小、或约1X1012M或更小的人IFNa亚型IFNaB2、IFNaF、IFNaG、或IFNaJ1的活性。11. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合所述人IFNco，解离常数（KD)为约 5X10 9M或更小、约1X10 9M或更小、约5X10WM或更小、约1X10WM或更小、约5X10nM或更小、约1X10nM或更小、约5X10 12M或更小、或约5X10 12M或更小，并结合所述人 IFNa亚型IFNaB2、IFNaF、IFNaG或IFNaJl，KD为约 5X109M或更小、约 1X109M或 更小、约5X10WM或更小、约1X10 或更小、约5X10nM或更小、约1X10nM或更小、约 5X10 12M或更小、或约5X10 12M或更小，其中使用实例3中在"亲和力测量"部分下示例的 条件测量KD。12. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体竞争结合到所述人IFNco和所述人 IFNa亚型IFNaB2、IFNaF、IFNaG和/或IFNaJ1，其中分离的抗体包含： a)SEQIDN0:23的重链可变区（VH)氨基酸序列和SEQIDN0:24的轻链可变区（VL) 氨基酸序列；或 b)SEQIDN0:27的VH氨基酸序列和SEQIDN0:28的VL氨基酸序列。13. 根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体在SEQIDNO: 1的残基F27、L30和R33 中的一个或多个处结合IFNco。14. 根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体在SEQIDNO: 1的残基F27、L30和R33 处结合IFNco。15. 根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQIDNO: 1的残 基P26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNco残基。16. 根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQIDNO: 1的残 基R22、R23、124、S25、P26、K31、D32、R34、D35、Q40、K134、M146、E147、M149、K150、F153 和 L154组成的组中的至少一个IFNco残基。17. 根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体在SEQIDNO: 19的残基F27、L30和 R33中的一个或多个处结合IFNa4a。18. 根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体在SEQIDNO: 19的残基F27、L30和 R33 处结合IFNa4a。19. 根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQIDNO: 19的残 基H26、K31和R34组成的组中的至少一个IFNa4a残基。20. 根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体进一步结合选自由SEQIDNO: 19的 A19、G22、R23、I24、S25、H26、C29、K31、D32、H34、D35、V143、A146、E147、M149、R150 和S153 组成的组中的至少一个IFNa4a残基。21. 根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体抑制病毒诱导的白细胞干扰素的活 性。 2 2.根据权利要求21所述的抗体，其中所述病毒诱导的白细胞干扰素的活性是由 100U/ml干扰素诱导的IP-10在全血中的释放。23. 根据权利要求22所述的抗体，其中在50μg/ml抗体存在下，所述活性被抑制超过 50%〇24. 根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体抑制系统性红斑狼疮（SLE)免疫复合 物诱导的IFN的活性。25. 根据权利要求24所述的抗体，其中所述活性被抑制超过约50%。26. 根据权利要求12所述的抗体，其包含： a)SEQIDN0:23的重链可变区（VH)氨基酸序列和SEQIDN0:24的轻链可变区（VL) 氨基酸序列；或 b)SEQIDN0:27的重链可变区（VH)氨基酸序列和SEQIDN0:28的轻链可变区（VL) 氨基酸序列。27. 根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体不结合或中和人干扰素-β(IFNi3)。28. 根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体不结合或中和人IFNaD。29. 根据权利要求12所述的抗体，其中所述抗体为人、人源化或人适应性的。30. 根据权利要求29所述的抗体，其中所述抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。31. 根据权利要求29所述的抗体，其中所述抗体为双特异性的。32. 根据权利要求31所述的抗体，其中所述抗体结合BLyS、CD40L、IL-6、CD27、BDCA2、 或者IL-12或IL-23的p40亚基。33. -种药物组合物，其包含根据权利要求1或12所述的抗体以及药学上可接受的载 体。34. -种治疗或预防与IFNa和IFNco生成增加相关联的疾病的方法，所述方法包括将 治疗有效量的根据权利要求12所述的分离的抗体施用至对其有需求的患者足以治疗或预 防所述疾病的时间。35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述疾病为免疫介导的炎性疾病。36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述免疫介导的炎性疾病为系统性红斑狼疮 (SLE)、I型糖尿病、牛皮癣、原发性干燥病、系统性硬化病或类风湿性关节炎。37. 根据权利要求34所述的方法，其中所述患者表现出I型干扰素特征。38. 根据权利要求34所述的方法，其中根据权利要求12所述的抗体为双特异性抗体。39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述双特异性抗体结合BLyS、⑶40L、IL-6、 CD27、BDCA2、或者IL-12 或IL-23 的p40 亚基。40. -种在对其有需求的患者体内抑制IFNco和IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、IFNaF、 IFNaG和/或IFNaJ1与IFNAR的相互作用的方法，所述方法包括将根据权利要求12所述 的分离的抗体向患者施用足以预防IFNco和IFNa亚型IFNaB2、IFNaC、IFNaF、IFNaG 和/或IFNaJ1与IFNAR的相互作用的时间。41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述患者患有免疫介导的炎性疾病。42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述免疫介导的炎性疾病为SLE、I型糖尿病、 牛皮癣、原发性干燥病、系统性硬化病或类风湿性关节炎。43. 根据权利要求40所述的方法，其中所述患者表现出I型干扰素特征。44. 根据权利要求40所述的方法，其中所述抗体为双特异性抗体。45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述双特异性抗体结合BLyS、⑶40L、IL-6、 CD27、BDCA2、IL-12 或IL-23 的p40 亚基、或BDCA2。
【专利摘要】本发明提供了广泛中和的干扰素-α和干扰素-ω抗体拮抗剂、编码所述抗体或片段的多核苷酸以及制备和使用上述物质的方法，所述物质和方法可用于治疗与IFNα和IFNω的生成增加相关联的疾病。I型IFN是一类细胞因子，所述细胞因子均通过遍在表达的异二聚体受体(IFNAR)进行信号传导，从而产生抗病毒、抗增殖和免疫调节的效应。
【IPC分类】C07K16/24
【公开号】CN105358575
【申请号】CN201480015798
【发明人】E.基, J.康诺尔, C.黄, J.乔丹, X.林-施米德特, J.罗, L.卢, C.马丁内斯, G.奥布莫洛娃, R.斯万森
【申请人】詹森生物科技公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】CA2906526A1, EP2970461A1, US20140271648, WO2014151422A1