方法

方法
【专利说明】方法
[0001] 本发明涉及用于纯化IgG的改进的方法。特别是所述改进的方法提供了比早前的 方法更高的收率。
[0002] 发明背景
[0003] 公知的是，免疫球蛋白在哺乳动物的免疫系统中具有重要作用。它们通过B-淋巴 细胞产生，被发现存在于血浆、淋巴和其它分泌体中。免疫球蛋白占人体中血浆蛋白质的 大约20%。免疫球蛋白的基本单元为异四聚体，包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻 链。这些链的每一个都具有形成抗原结合位点的在它们的N端的可变区和负责免疫球蛋白 的效应子功能的恒定区。
[0004] 存在具有不同的生化和生理性质的五种主要类型的免疫球蛋白：IgG( □重链）、 IgA(a)、IgM(y)、IgD(S)和IgE(e)。人IgG代表血浆中最大丰度的免疫球蛋白，而IgA 代表在外部分泌物如呼吸道和肠道的唾液、泪液和粘液中的主要抗体类型。IgM是目前在人 类循环系统中物理上最大的抗体，通常作为基本免疫球蛋白单元的五聚体存在，并且在感 染过程早期出现。
[0005] 最初，从人血浆制备IgG被成功地用于预防和治疗各种传染性疾病。早期的产品 通过相对粗放的方法（乙醇分级）生产并且包含杂质和聚集体至仅能够肌内施用它们的程 度。纯化方法方面的改进由于IgG制剂的改进的纯度和质量已产生适合于静脉内施用的 IgG制剂（称为IVIG)，并且还已开发出用于皮下施用的制剂（称为SCIG)。
[0006] 通常用于从血浆纯化IgG的工业方法基于由Cohn设计的原始方法（Cohn E·，等人，（1946)，JAmChemSoc, 68, 459-475,Oncley等人，（1949)，JAmChem Soc，71，541-550)，其追溯到20世纪40年代并且依赖于血浆蛋白质的冷分级沉淀。在离 子强度、pH和温度的受控条件下逐渐添加乙醇之后，该血浆分级法获得了治疗学上有用 的血浆蛋白质（凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白、抗凝血酶III)的经富集或经浓缩的级 分。根据开发出经改变的乙醇分级方法的Kistler和Nitschmann，应用Cohn分级从级分 II+III、I+II+III或相当的沉淀A(称为NA沉淀）获得了IgG(KistlerPandNitschmann HS，（1952)，VoxSang, 7,414-424)〇
[0007] 在20世纪60年代已显示短链脂肪酸（C6-C12)与a-和β-球蛋白形成不溶的络 合物，而 球蛋白则不易沉淀（Chanutin等人，（1960)Arch.Biochem.Biophys.89;218)〇
[0008] Steinbuch和Audran((1969)Arch.Biochem.Biophys. 134, 279-294)描述 了米用 辛酸盐（即辛酸盐，一种C8饱和脂肪酸）作为沉淀剂的IgG纯化方法。在用乙酸盐缓冲液 稀释以达到4. 8的最终pH之后，从人血浆中沉淀非免疫球蛋白。在强烈搅拌下添加辛酸盐 之后，获得富集IgG的溶液。纯度和收率取决于辛酸盐的量、pH、缓冲液的摩尔浓度和稀释 系数。
[0009] 在弱酸性pH而不是低于pH4. 5时最佳地获得大量非免疫球蛋白沉淀。将血浆用 0. 06M乙酸盐缓冲液（pH4. 8)稀释（2:1)，然后用2. 5重量％辛酸盐处理，以开始沉淀。将 DEAE-纤维素上的上清液的分批吸附用于从经分离的IgG级分清除另外的杂质。Steinbuch 等人的后期工作显示了辛酸沉淀存在于Cohn乙醇级分III中的大多数蛋白质和脂蛋白 (而不是免疫球蛋白）的用途（Steinbuch等人，（1973)，Prep.Biochem. 3, 363-373)。
[0010] 将相同的方法应用至使用2. 16重量％辛酸盐稀释的人血浆（Habeeb等人，（1984) Prep.Biochem. 14, 1-17)。Habeeb等人遵循采用在DEAE纤维素上分级的辛酸沉淀法。所产 生的来源于血浆的IgG基本上不含聚集体、纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原。此外，所获得 的IgG的抗补体活性低且在储存期间相对稳定。因此将辛酸盐沉淀步骤公认为非常有用， 并且引入从血浆生产IgG的许多现代方法中。
[0011] 除了醇、PEG和辛酸分级法以外，还将若干色谱法方法与基础分级法结合用于纯化 IVIG〇
[0012] 最经常使用的色谱方法是离子交换色谱法，其利用了蛋白质和离子交换介质上的 表面分布和电荷密度。阴离子交换树脂呈现带正电的表面。电荷密度对树脂是特异性的， 并且通常独立于pH(在树脂的工作范围之内）。典型的阴离子交换剂将会结合具有净负电 荷的蛋白质（即当溶液的pH高于蛋白质的等电点时）。在现实中，蛋白质的表面并不呈现 单一的电荷；而是正电荷和负电荷以及中性区域的嵌合。表面结构对给定蛋白质是特异性 的，并且将会受溶液条件如离子强度和pH影响。可以开发该独特性以确立单个蛋白质将结 合阴离子交换树脂或从其释放的特定条件。通过确立这些条件，可以以高收率（>95%)有 效地分离具有仅稍微不同的表面或电荷性质的蛋白质。
[0013] 色谱法树脂载体结构方面的改进使得大型规模色谱法成为更常规的纯化方法的 实践上的替代方案。刚性树脂允许快速（〈5小时）处理大的体积，并且高的配体密度产生 了对大体积处理所必需的加强的能力。与高的收率、产品纯度和处理简化结合的这些因素 支持色谱法在大规模制造中的用途。
[0014] 尤其是，已将阳离子和/或阴离子交换色谱法（有时在单独的步骤中或串联结合） 用于血浆或其级分中纯化IgG(如W0 99/64462中所描述）。在大多数方法中，以阴离子模 式使用阴离子交换色谱法，即使用条件使得污染物蛋白质即IgA、IgM、白蛋白、纤维蛋白原、 转铁蛋白能够结合，而在非吸附的级分中回收所述IgG。
[0015] 辛酸盐沉淀法与之后的用于纯化IgG的离子交换色谱法的组合描述于许多出版 物中。Steinbuch和Audran((1969)ArchBiochemBiophys134, 279-284)描述了在用DEAE 纤维素沉淀辛酸盐之后进一步纯化IgG。Lebing等人（US5, 886, 157)描述了串联使用用 于除去IgM、IgA、白蛋白和其它杂质的两种阴离子交换柱。Lebing等人结合了辛酸盐介导 的效应二者，即通过沉淀实质上减少非IgG蛋白质，由此使用病毒分配（partition)以及在 单独的温育步骤中的脂肪酸的包裹的病毒灭活性质。从含IgG的糊状物/沉淀物在pH4. 2 的重构开始并且在将所述pH调节为5. 2时随后添加辛酸盐的所谓的"pH波动"的重要性被 强调为对于IgG富集程序而言是重要的，因此需要有效减少非IgG蛋白质。然后通过所提 及的离子交换色谱法步骤减少一些其它杂质如IgA和IgM以及所述辛酸盐。
[0016] 美国专利第5, 164, 487号涉及辛酸用于制造静脉内耐受的IgG制剂的用途，所述 制剂不含聚集体、血管活性物质和蛋白水解酶。方法包括使含IgG的起始原料与0. 4%至 1. 5 %辛酸接触，然后用离子交换或疏水性基质色谱纯化。
[0017] 由于纯化方法的连续改进，多年来存在IgG产品的演变。如上文所提及，第一类 IgG产品仅适合于肌内使用，因为它们在静脉内施用时导致过多的不良事件。适合于静脉内 使用的第一代IgG产品（IVIG)通过起始原料（Cohn级分II)的胃蛋白酶裂解制备，所述裂 解的目的在于除去免疫球蛋白聚集体，所述聚集体导致严重的不良事件如补体激活，并且 使得不可能静脉内施用早期的产品。所述方法中不包括柱色谱步骤。不得不冷冻干燥所述 产品，从而在合理的时间期间保持稳定并在使用前立即溶解。
[0018] 在八十年代中期引入了具有低抗补体活性和较高稳定性的基于未裂解和未修饰 的免疫球蛋白分子的第二代IVIG，但其仍然呈冷冻干燥的产品的形式。该IVIG通过包括若 干色谱法步骤的方法来纯化。避免了胃蛋白酶裂解，通过沉淀法除去了聚集体和颗粒，并且 通过柱色谱离子交换法实现了进一步纯化。
[0019] 对于第三代IVIG而言，方法中包括了专门的病毒灭活步骤。虽然纯化方法中的沉 淀步骤特别除去了许多病毒，然而用血液产品治疗的一些患者仍被HIV感染，因此进一步 需要采取专门的步骤来从这些产品中使病毒灭活并除去病毒。
[0020] 所述方法被继续改善以进一步实现蛋白质的更佳的纯度和质量，从而使得可获得 待制备的稳定的液体产品成为可能，并且改进这些产品对患者而言的安全性和耐受性。此 外开发了皮下制剂。
[0021] 现