一种预测大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞对特定药物的敏感性测定方法，尤其涉及一种预测大肠癌细 胞对P38MAPK激酶抑制剂敏感性的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化，大肠癌在我国的发病率呈增高趋 势，由于大肠癌发生发展的机制尚不明确，故缺乏有效的防治靶点及手段。尤其是中晚期大 肠癌，其治疗手段只能以化疗为主，疗效以及患者预后均较差。靶向治疗是在细胞分子水平 上，针对已经明确的致癌位点（肿瘤细胞内的蛋白分子或基因片段)设计相应的治疗药物， 药物进入体内会特异地结合致癌位点，使肿瘤细胞特异性死亡，而不波及正常组织细胞，代 表了肿瘤治疗的新方向。
[0003] p38MAPK(p38丝裂原活化蛋白激酶)磷酸化包括转录因子和激酶在内的大量底物 (MK2，HSP27等），在细胞的转录、蛋白合成、信号转导和细胞表面受体表达等方面发挥重要 作用，被作为肿瘤靶向治疗的靶点而广为研究，部分P38MAPK激酶抑制剂(p38in)已进入早 期临床试验。临床前研究表明：在大肠癌的治疗中，p38in可提高部分大肠癌对5-氟尿嘧啶 的敏感性、降低伊立替康的耐药。但是，也存在部分肿瘤对p38in耐药。
[0004] 肿瘤的发生是多因素、多步骤的，加之细胞的异质性、细胞信号通路的复杂性和高 概率的基因突变，现有技术并不能达到精准治疗的目的。因此，找到一种预测大肠癌对 p38in敏感性的方法显得尤为重要。目前尚未见文献报道有方法可预测大肠癌对p38in的敏 感性。
[0005] PP2A是广泛存在真核生物体内的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，是由催化亚基C亚基 (PP2AC)、结构亚基A亚基(PP2AA)和调节亚基B亚基(PP2AB)组成的异三聚体。PP2AC物种间 具有高度的保守性，通过可逆磷酸化使已磷酸化激活的蛋白质脱磷酸化，参与体内众多生 物学事件。
【发明内容】
[0006] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种预测大肠癌细胞对P38MAPK激酶 抑制剂敏感性的方法，有效地填补了预测大肠癌细胞对p38in的敏感性手段的技术空白。
[0007] 申请人通过大量的研究和实验意外地发现，PP2AC通过参与调控P38/ERK/TSC2/ mTOR信号通路活性，决定大肠癌对p38in的敏感性;PP2AC低表达的大肠癌细胞对p38in敏 感，PP2AC高表达的大肠癌细胞对p38in耐药。应用免疫组化联合免疫荧光技术（IHC/IF)或 者单独地检测大肠癌组织的PP2AC表达水平，可预测大肠癌对p38in敏感或耐药。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明所采取的技术措施为：
[0009] -种预测大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感性的方法，包括应用免疫组化或 免疫荧光技术检测大肠癌细胞的PP2AC表达水平，并测算H-score的步骤;其中，若H-score 数值小于100，则判定大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂敏感，若H-score数值大于200，则判 定大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂耐药。
[0010]为了优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
[0011]优选地，免疫组化操作具体为：
[0012]步骤一，切片脱蜡至水：
[0013]二甲苯Ι、Π 脱蜡5-10min，充分脱去石蜡;梯度酒精脱二甲苯:水洗，然后将片子插 到抗原修复盒内，用蒸馏水洗2遍；
[0014] 步骤二，灭活内源性过氧化物酶：
[0015] 将步骤一所得切片加入3%过氧化氢使液面覆盖组织lOmin，用蒸馏水洗2次，每次 3min；
[0016] 步骤三，抗原修复：
[0017] 将步骤二所得切片置于柠檬酸缓冲液中微波加热修复，待自然冷却至室温后先用 蒸馏水洗2次，再用PBS洗3次，每次5min;
[0018] 步骤四，用非免疫血清封闭，孵育：
[0019] 将步骤三所得切片用吸水纸将组织周围的水分尽量吸尽，用免疫组化笔在组织周 围画一个圈，然后加入血清覆盖组织，放入湿盒室温孵育10-30min，湿盒底部加入少量的 水；
[0020] 步骤五，一抗孵育：
[0021] 弃去血清，滴加一抗4°C过夜孵育，第二天复温45min后，用ros将切片洗3次，每次 5min；
[0022] 步骤六，二抗孵育：
[0023] 滴加二抗室温孵育30min，PBS洗3次每次5min;
[0024] 步骤七，显色反应：
[0025] 加 DAB显色5 - lOmin，浸入纯水终止显色；
[0026] 步骤八，复染：
[0027] 苏木素染色，然后使用水冲洗，1 %盐酸酒精分化组织颜色变红立即取出放入水 中，水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，I、Π 二甲苯脱酒精各两分钟，晾干或吹干，滴加少量的中性 树脂取一盖玻片进行封片；
[0028] 步骤九，H-score测算。
[0029]优选地，免疫荧光操作具体为：
[0030]步骤一，包埋好的标本用切片机切石蜡切片，经60°C烘片2小时，二甲苯脱蜡，梯度 酒精复水；
[0031 ]步骤二，抗原修复，使用修复液，微波蒸汽2分钟，98度水浴25分钟，冷却25分钟； [0032] 步骤三，PBS洗3次，每次5min;
[0033] 步骤四，使用10%羊血清封闭60min;
[0034] 步骤五，一抗4°C孵育过夜；
[0035] 步骤六，二抗25°C孵育lh;
[0036] 步骤七，封片及检测，滴加一滴内含DAPI的封片剂封片；
[0037] 步骤八，H-score测算。
[0038] 本发明的方法还可以是联合利用免疫组化和免疫荧光技术预测大肠癌细胞对 P38MAPK激酶抑制剂敏感性，即结合免疫组化和免疫荧光的H-score数值进行判定。其中，H-score数值可以通过常规的算法确定，也可以通过Aperio Sc_an:Scope? Systems (Vista，CA, USA)测算。
[0039] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：申请人开创性地 发现了 一种准确预测大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂敏感性的方法，通过一般实验室均 具备的免疫组化或免疫荧光技术，检测大肠癌细胞的PP2AC表达水平并测算H-score，通过 H-score数值，即可准确地判定大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感还是耐药，预测方法 简单方便，填补了大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂敏感性预测手段的空白。
【附图说明】
[0040] 图1为实施例一中Western blot实验结果。显示的PP2AA、PP2AB及PP2AC在不同大 肠癌细胞系的表达量情况。
[0041 ]图2为实施例二中SRB实验结果。显示了不同PP2AC表达水平的大肠癌细胞增殖对 p38in的敏感性不同。上图为SB202190对大肠癌细胞生长的影响；下图为LY2228820和 BIRB796对大肠癌细胞生长的影响。
[0042]图3为实施例三中平板克隆形成实验结果。显示了不同PP2AC表达水平的大肠癌细 胞克隆形成能力对p38in的敏感性不同。左图为SB202190对大肠癌细胞克隆形成的影响。柱 状图为平板克隆形成实验结果的定量。
[0043]图4为实施例四种软琼脂集落形成实验结果。显示了不同PP2AC表达水平的大肠癌 细胞软琼脂集落形成能力对p38in的敏感性不同。左图为SB202190对大肠癌细胞软琼脂集 落形成能力的影响。柱状图为软琼脂集落形成实验结果的定量。
[0044]图5为实施例五中大肠癌细胞裸鼠移植瘤药敏试验结果。显示了不同PP2AC表达水 平的大肠癌细胞裸鼠移植瘤对p38in的敏感性不同。PP2AC低表达大肠癌对p38in敏感， PP2AC高表达大肠癌对p38in耐药。
[0045]图6为实施例六中免疫组化检测结果。显示了不同PP2AC表达水平的大肠癌细胞裸 鼠移植瘤组织P_S6、Ki67对p38in的敏感性不同。
[0046] 图7为实施例七的Western blot检测结果。显示了p38in在大肠癌细胞移植瘤组织 的on-target effect JC:对照组；SB20: SB202190处理组。
[0047]图8为实施例八的应用免疫组化检测组织芯片的结果。显示了 PP2AC在人大肠癌的 表达量存在较大变异。左图为不同PP2AC表达水平的大肠癌照片，棕色为PP2AC蛋白；右图为 PP2AC表达水平定量(H-score)。
[0048]图9为实施例九建立的40例PD)(模型病理检测的结果(HE染色）。
[0049] 图10为实施例十应用免疫组化联合免疫荧光技术(