H-score，应用IHC/IF在40例PDX中筛选获得9例PP2AC高表达 PDX(病例编号2,3,8，11，19,28,30,31，40)和9例？？24(：低表达？0乂（病例编号1，12，13，14， 17，25，26，33，34)。预测病例 1，12，13，14，17，25，26，33，34对MAPK激酶抑制剂敏感;预测病 例2，3，8，11，19，28，30，31，40 对 MAPK 激酶抑制剂耐药。
[0122] 实施例^ ?应用人大肠癌原代移植瘤模型（Patient derived xenograftJDX) 进行SB202190药敏试验，验证本发明的方法
[0123] 1 ·扩增9例PP2AC高表达PDX(病例编号2，3，8，11，19，28，30，31，40)和9例PP2AC低 表达PDX(病例编号1，12，13，14，17，25，26，33，34)至P2-P4进行药敏试验。
[0124] 2 · PDX生长至100-200mm3时，随机分为2组，每组6只。SB202190作用组：SB202190溶 于DMS0+生理盐水，5mg/kg，0 . lml/只，每天一次，腹腔注射；对照组：DMS0溶于生理盐水， 0. lml/只，每天一次，腹腔注射;共15-21天。
[0125] 3.游标卡尺每3天测量肿瘤最大直径(a)与最小直径(b)，根据公式F=+a/):计算 肿瘤体积。至实验终点，计算τ/c值。τ/c值为实验组最后一次测量与第一次测量肿瘤体积之 差（即ΛΤ)，比上对照组最后一次测量与第一次测量肿瘤体积之差（即AChT/CiO,完全生 长抑制;T/C〈0肿瘤消退;T/C=100,无生长抑制;T/0100促进生长。实验人员对病人肿瘤标 本病例号及所对应的PP2AC表达量均未知(盲法）。
[0126] 如图11所示，p38in( SB202190)明显抑制PP2AC低表达Η)Χ生长，并使部分PP2AC低 表达PDX肿瘤消退;p38in(SB202190)不能抑制PP2AC高表达Η)Χ生长，反而促进部分PP2AC高 表达Η)Χ肿瘤生长。即PP2AC低表达大肠癌对p38in敏感，PP2AC高表达大肠癌对p38in不敏感 (或耐药），与本发明方法所预测的结果一致。VC:对照组；SB20:SB202190处理组。数据代表 均值土标准差。散点图为Τ/C值定量，PP2AC低表达组vs. PP2AC高表达组，P〈0.0001。
[0127] 实施例十二.应用免疫组化(IHC)检测PDX的P-S6，P-MK2，Ki67表达量
[0128] 所用抗体：灯67(#9449)少-]\0(2(了334)(#3007)，？-56(5235/236)(#4858)。？0乂 药敏 实验至终点，处死实验动物，肿瘤取材，福尔马林固定，进一步行免疫组化检测。免疫组化具 体操作同实施例六。
[0129] P-MK2代表P38MAPK信号通路活性，P-S6代表mTOR信号通路活性(mTOR信号通路活 性增强将促进肿瘤细胞增殖），Ki67代表肿瘤细胞增殖能力。如图12所示，p38in(SB202190) 完全抑制PP2AC低表达Η)Χ和PP2AC高表达Η)Χ的P38MAPK信号通路活性;p38in(SB202190)可 明显抑制PP2AC低表达Η)Χ的mTOR信号通路活性和细胞增殖，对PP2AC高表达Η)Χ的mTOR信号 通路活性和细胞增殖无抑制作用，或呈现促进作用。即PP2AC低表达大肠癌对p38in敏感， PP2AC高表达大肠癌对p38in不敏感(或耐药）。
[0130] 实施例十三·应用人大肠癌原代移植瘤模型（Patient derived xenograftJDX) 进行LY2228820药敏试验，验证本发明的方法
[0131] 随机扩增2例PP2AC低表达PDX(病例编号13,33)和2例PP2AC高表达PDX(病例编号 3，40)至P2-P4，进行LY2228820药敏试验，验证本发明的方法。具体操作同实施例^^一。
[0132] LY2228820是已进入早期临床试验的ρβδΜΑΙ^Κ激酶抑制剂。如图13所示，p38in (LY2228820)明显抑制PP2AC低表达Η)Χ生长;p38in(LY2228820)不能抑制PP2AC高表达Η)Χ 生长(在病例40反而促进肿瘤生长）。即PP2AC低表达大肠癌对p38in敏感，PP2AC高表达大肠 癌对p38in不敏感（或耐药），与本发明方法所预测的结果一致。VC:对照组；LY222: LY2228820处理组，10mg/kg/day。数据代表均值土标准差。
[0133] 通过上述的实施例和验证实验，说明本发明的预测方法可以准确预测大肠癌细胞 对P38MAPK激酶抑制剂敏感性，通过一般实验室均具备的免疫组化或免疫荧光技术，检测大 肠癌细胞的PP2AC表达水平并测算H-score，通过H-score数值，即可准确地判定大肠癌细胞 对P38MAPK激酶抑制剂敏感还是耐药，预测方法简单方便，填补了大肠癌细胞对p38MAPK激 酶抑制剂敏感性预测手段的空白。
[0134] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种预测大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂敏感性的方法，其特征在于，包括应用免 疫组化或免疫荧光技术检测大肠癌细胞的PP2AC表达水平，并测算H-score的步骤;其中，若 H-score数值小于100,则判定大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感，若H-score数值大于 200，则判定大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂耐药。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，免疫组化操作具体为： 步骤一，切片脱蜡至水： 二甲苯Ι、Π脱蜡5-10min，充分脱去石蜡;梯度酒精脱二甲苯:水洗，然后将片子插到抗 原修复盒内，用蒸馏水洗2遍； 步骤二，灭活内源性过氧化物酶： 将步骤一所得切片加入3%过氧化氢使液面覆盖组织lOmin，用蒸馏水洗2次，每次 3min； 步骤三，抗原修复： 将步骤二所得切片置于柠檬酸缓冲液中微波加热修复，待自然冷却至室温后先用蒸馏 水洗2次，再用PBS洗3次，每次5min; 步骤四，用非免疫血清封闭，孵育： 将步骤三所得切片用吸水纸将组织周围的水分尽量吸尽，用免疫组化笔在组织周围画 一个圈，然后加入血清覆盖组织，放入湿盒室温孵育10_30min，湿盒底部加入少量的水； 步骤五，一抗孵育： 弃去血清，滴加一抗4°C过夜孵育，第二天复温45min后，用PBS将切片洗3次，每次5min; 步骤六，二抗孵育： 滴加二抗室温孵育30min，PBS洗3次每次5min; 步骤七，显色反应： 加DAB显色5 -lOmin，浸入纯水终止显色； 步骤八，复染： 苏木素染色，然后使用水冲洗，1 %盐酸酒精分化组织颜色变红立即取出放入水中，水 冲洗返蓝，梯度酒精脱水，I、Π二甲苯脱酒精各两分钟，晾干或吹干，滴加少量的中性树脂 取一盖玻片进行封片； 步骤九，H-score测算。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，免疫荧光操作具体为： 步骤一，包埋好的标本用切片机切石蜡切片，经60°C烘片2小时，二甲苯脱蜡，梯度酒精 复水； 步骤二，抗原修复，使用修复液，微波蒸汽2分钟，98度水浴25分钟，冷却25分钟； 步骤三，PBS洗3次，每次5min; 步骤四，使用1〇%羊血清封闭6〇111；[11; 步骤五，一抗4°C孵育过夜； 步骤六，二抗25°C孵育lh; 步骤七，封片及检测，滴加一滴内含DAPI的封片剂封片； 步骤八，H-score测算。
【专利摘要】一种预测大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感性的方法，包括应用免疫组化或免疫荧光技术检测大肠癌细胞的PP2AC表达水平，并测算H-score的步骤；其中，若H-score数值小于100，则判定大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感，若H-score数值大于200，则判定大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂耐药；本发明通过一般实验室均具备的免疫组化或免疫荧光技术，检测大肠癌细胞的PP2AC表达水平并测算H-score，通过H-score数值，即可准确地判定大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感还是耐药，填补了大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感性预测手段的空白。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105467119
【申请号】CN201510854669
【发明人】张燕捷, 秦晓雨, 王欣欣, 刘峰, 姜斌
【申请人】上海交通大学医学院附属第三人民医院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年11月28日