IHC/IF)检测的结果。
[0050] 图11为实施例十一中应用人大肠癌原代移植瘤模型进行药敏试验，检测不同 PP2AC表达水平的PDX对p38in(SB202190)的敏感性的结果。VC:对照组；SB20: SB202190处理 组。数据代表均值土标准差。散点图为T/C值定量，PP2AC低表达组vs . PP2AC高表达组，P〈 0.0001ο
[0051 ] 图12为实施例十二中应用免疫组化（IHC)检测PDX的P-S6、P-MK2、Ki67对p38in的 敏感性的结果。PP2AC低表达大肠癌对p38in敏感，PP2AC高表达大肠癌对p38in不敏感(或耐 药）JC:对照组；SB20: SB202190处理组。
[0052]图13为实施例十三中应用人大肠癌原代移植瘤模型进行药敏试验，检测不同 PP2AC表达水平的PDX对p38in(LY2228820)的敏感性的结果。VC:对照组;LY:LY2228820处理 组。数据代表均值土标准差。
【具体实施方式】
[0053]本发明提供了一种预测大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂敏感性的方法，包括应 用免疫组化或免疫荧光技术检测大肠癌细胞的PP2AC表达水平，并测算H-score的步骤;其 中，若H-score数值小于100，则判定大肠癌细胞对p38MAPK激酶抑制剂敏感，若H-score数值 大于200，则判定大肠癌细胞对P38MAPK激酶抑制剂耐药。
[0054]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0055] 本发明的以下各个实施例中，人大肠癌细胞系CAC0-2，HCT116，RK0，SW1116，SW480 和SW620均购自ATCC，RPMI 1640培养基购自美国Sigma公司；实验动物为BALB/c裸鼠，雄性，4 周龄，近交系，购自中科院松江动物实验基地(SCXK(沪）2003-0003 )，饲养于上海交通大学 医学院IVC动物实验室(SYXK(沪)2003-0007)。
[0056]实施例一.免疫印迹法分析大肠癌细胞PP2AC蛋白水平
[0057] 所用抗体（Cell Signaling Technology) :PP2AA(#2041)，PP2AB(#2290)，PP2AC(# 2059)，Tubulin(#3873)。具体操作如下：
[0058] 1.配制HEPES电泳缓冲液：HEPES 23.8g，Tris 12.1g，SDS l.Og，加入去离子水溶 解，定容至1000ml。
[0059] 2.配制Tris-甘氨酸电转移缓冲液（PH8.3) :Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇 200ml，加入去离子水溶解，定容至1000ml。
[0060] 3.配制封闭液：小牛血清与TBS溶液（Tris 12.1g，NaCl 9g，去离子水定容至 1000ml，调节pH至7.5)以1:9比例配成含10 %小牛血清的封闭液。
[0061 ] 4.大肠癌细胞系 CAC0-2，HCT116，RK0，SW1116，SW480 和 SW620 以 RIPA 裂解法抽提细 胞总蛋白。将定量后的蛋白样品与5 X loading buffer混合，于100°C加热变性3-5min，简单 离心后顺序加入加样孔中（10%SDS-PAGE)。以150V电压电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部。
[0062] 5.取出凝胶，其中一块用于考马斯亮蓝染色以观察样品的加样量及电泳情况，另 一块用于转膜，于甘氨酸电转移缓冲液中平衡l〇_15min。剪裁大小与凝胶相同的6张滤纸和 1张 PVDF膜。PVDF膜浸以甲醇预处理15s，与滤纸共同浸泡于Tris-甘氨酸电转移缓冲液。将 凝胶的一面与滤膜相接触，夹于6张滤纸之间，整齐叠放于电转移装置中，PVDF膜靠近阳极 一侧。加入Tr i s-甘氨酸电转移缓冲液，于冰上以0.65mA/cm2的电流强度恒流电转移2~3h。
[0063] 6 · PVDF膜于封闭液中4°C过夜。弃去封闭液，TTBS(999mlTBS，Tween-20 1ml)振荡 洗膜5分钟，孵一抗(室温孵育2-3h。TTBS震荡洗膜3次，每次15min。与辣根过氧化物酶(HRP) 标记的二抗室温孵育1 _2h。TTBS震荡洗膜3次，每次15min。
[0064] 7.以ECL试剂盒进行化学发光，暗室内将A、B发光液等比例稀释混合。膜用去离子 水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液上，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖 上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。标定Marker，进行分析。
[0065] 如图1所示，在人大肠癌细胞系中，PP2AC表达水平有明显差异，而PP2AA和PP2AB表 达水平差异不明显。在CA⑶-2，RK0和SW480中，PP2AC低表达；在HCT116，SW1116和SW620中， PP2AC高表达。
[0066] 实施例二·横酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法
[0067] 取刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取 两滴细胞悬液台盼蓝染色，于显微镜下计数活细胞数目（死细胞数目不得超过5 % )，用完全 培养液调整细胞数目至1 X 1〇5个细胞/毫升。
[0068]于96孔细胞培养板中每孔加入100μΙ细胞悬液，将培养板置于C02培养箱中培养24 小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的p38in(SB202190，LY2228820，BIRB796)的完 全培养液，每个浓度设5个平行孔，另设A行细胞加入不含药完全培养液作正常对照孔(C)。
[0069] 加药完成后，吸出空白孔中培养液，去离子水洗5遍。培养板于微孔板振荡器上振 荡混匀，置于C02培养箱中继续培养24-72小时。
[0070] 取出培养板，在培养液表面每孔轻轻加入50μ1预冷的50%的三氯醋酸(TCA)固定， 静置5分钟后，再将培养板移至4°C放置1小时。
[0071] 倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μΙ SRB液，在室 温放置10分钟，未与蛋白质结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μ1 1 Ommo 1 /L非缓冲Tr i s碱液(pHl 0.5)振荡溶解。
[0072] 于ΒΙ0-ΤΕΚ酶标仪测定各孔光吸收，测定波长为540nm。根据各孔0D值计算p38in对 细胞增殖的影响。每组复测5孔，重复试验三次后取平均值。
[0073] 如图 2 所示，p38in(SB202190，LY2228820，BIRB796)可明显抑制 PP2AC 低表达大肠 癌细胞的生长(CAC0-2，RK0，SW480)，对PP2AC高表达大肠癌细胞的生长无抑制作用，或反而 呈现促进作用(HCT116，SW1116和SW620)。即PP2AC低表达大肠癌细胞对p38in敏感，PP2AC高 表达大肠癌细胞对p38in不敏感(或耐药）。
[0074]实施例三.平板克隆形成实验
[0075] 完全培养液稀释单细胞悬液，以200个/孔接种至12孔细胞培养板，SB202190处理 后，培养1-2周，用亚基蓝染色，观察克隆形成并计数。每组设3个复孔，重复试验三次后取平 均值。
[0076] 如图3所示，p38in可显著抑制PP2AC低表达大肠癌细胞的克隆形成能力（CA⑶-2， 狀0,31480)，对？？24(：高表达大肠癌细胞的克隆形成无抑制作用，或反而呈现促进作用 (HCT116，SW1116和SW620)。即PP2AC低表达大肠癌细胞对p38in敏感，PP2AC高表达大肠癌细 胞对p38in不敏感(或耐药）。柱状图为平板克隆形成实验结果的定量。数据代表均值±标准 差。
[0077] 实施例四.软琼脂集落形成实验
[0078] 取对数生长期细胞，用0.25 %胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细 胞计数，用含20 %胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度至IX 106细胞/L。根据实验要 求作梯度倍数稀释。用蒸馏水分别制备出1.4%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压 灭菌后，维持在40°C中不凝固。按1:1比例混合1.4%的琼脂糖和2 XRPMI1640培养基(含有2 X抗生素和20%的小牛血清），注入培养板中，冷却凝固，作底层琼脂置C02温箱中备用。按 1:1比例混合0.7%的琼脂糖和2 X RPMI1640培养基，再加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注 入铺有1.4%琼脂糖底层培养板中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37°C5 %⑶2温 箱中培养10~14天。将SB202190以DMSO溶解，并以RPMI1640培养基稀释至所需浓度，加于琼 脂表面，隔天换液。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计算克隆形成率。