治愈伤口的组合物及其应用的制作方法

专利名称：治愈伤口的组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于加速伤口愈合的方法和组合物。
背景技术：
血管生成与血栓调节蛋白虽然已知现有技术中有几种分子可用做治疗重要血管异常凝血性疾病和紊乱的治疗剂，但仍需要提供用于治疗这些疾病和血管生成活性异常症状的疾病和功能紊乱的组成物及方法。这样的疾病包括例如低血压、高血压和动脉硬化等心血管病；中风、心脏病发作及血管成形术后的血栓形成；血管生成性疾病；肺组织纤维化和哮喘等呼吸道病症；肿瘤细胞侵入、血管生成和转移等肿瘤相关疾病；伤口愈合和凝血障碍以及子宫过早收缩和阳萎等生殖功能障碍。
目前已经鉴定出许多用于诱导或促进组织中血管生成的生物分子。其中最重要的是血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGFs)和转化生长因子(TGFs)。凝血调节蛋白的缺乏会使小鼠胚胎在功能性心血管系统发育前死亡(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995；92850-854.；and J P Cooke et al，Circulation 105(2002)2133)。相关领域的研究显示，目前可将促进血管生成的方法概括为三大类(i)使用于人工合成和自然聚合的支架输送血管生长因子；(ii)输送含有编码血管生成蛋白的DNA的质粒；以及(iii)输送血管生成因子并结合内皮细胞移植。
在相关领域中，另一篇报道[Shi CS et al.，Evidence of HumanThrombomodulin Domain as a Novel Angiogenic Factor，Circulation.2005Apr.5；111(13)1627-36]提出用重组人血栓调节蛋白分子代替生长因子加载到传输系统中。它提出这些加载的人类重组血栓调节蛋白能够在一些生理条件下释放，从而促进局部定位的快速血管生成。
血栓调节蛋白是一种作为抗凝血剂的内皮细胞膜糖蛋白。重组血栓调节蛋白，TMD2(含有六个表皮生长因子类结构)和TMD23(含TMD2和一个丝氨酸-苏氨酸富集区域)呈现有细胞有丝分裂活性。
先前使用体内和体外模型所作的研究(Shi CS et al.，Evidence ofHuman Thrombomodulin Domain as a Novel Angiogenic Factor.Circulation.2005 Apr 5；111(13)1627-36)已经揭示了重组结构域在的血管生成效果。已表明，在培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中，TMD23比TMD2有更高的刺激DNA合成活性。另外，在HUVECs中，TMD23通过细胞外信号调节激酶1/2和p38丝裂原活化的蛋白激酶以及磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/细胞内皮型一氧化氮合酶的磷酸化途径刺激细胞趋化和毛细血管形成。TMD23也促进基质金属蛋白酶家族以及纤溶酶原活化因子的的内皮细胞表达，其介导血管生成期间导致内皮细胞侵润和迁移的细胞外的蛋白质水解。此外，大鼠角膜中含TMD23的植入物能诱导新的血管从外围组织生长。小鼠血管生成试验显示，在裸鼠体内，TMD23不仅诱导Matrigel和肝素共注射的新血管生成作用，而且可增强含Matrigel的黑色素瘤A2058细胞的血管生成。总之，重组血栓调节蛋白结构域TMD23能增强体内和体外的血管生成反应。
伤口愈合伤口愈合过程分三个阶段，即为发炎期、增生期和成熟期。
发炎期的特征是止血和发炎。在伤口形成时，胶原蛋白激活凝血级联反应(内部和外部途径)，开始发炎期。组织损伤发生后，伤口形成所损伤的细胞膜释放凝血恶烷A2和前列腺素2-α(强血管收缩因子)。这一初始的反应有助于限制出血。短时期后，毛细血管舒张使得局部的组胺释放，发性细胞即可迁移至创伤部位。
血小板作为第一反应细胞，可释放包括表皮生长因子(EGF)、纤连蛋白、纤维蛋白原、组胺、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血清素和病毒胞吞因子(von Willebrand factor)在内的多种趋化因子。这些因子能够借助血液凝块的形成稳定伤口、控制出血及限制损伤的扩展。血小板脱粒也能激活补体级联反应(特别是通过嗜中性粒细胞趋化剂C5a)。
发炎期延续，更多的免疫应答细胞迁移到伤口处。迁移到伤口处的第二应答细胞，即嗜中性粒细胞，负责清除细胞碎片、补体介导细菌调理作用以及通过氧化损伤机制(即形成超氧化物和过氧化氢)杀灭细菌。嗜中性粒细胞杀死细菌并清除异物对伤口的污染。
接下来出现在伤口处的细胞为白细胞和巨噬细胞(单核细胞)。巨噬细胞是伤口愈合所必须的。巨噬细胞分泌多种酶和细胞因子。其中包括清除伤口的胶原酶、刺激纤维母细胞(产生胶原蛋白)并促进血管生成的白介素和肿瘤坏死因子(TNF)，以及刺激角化细胞的转化生长因子(TGF)。该步骤标志着伤口愈合进入了组织重建过程，即增生期。
伤口愈合的第二阶段是增生期。上皮形成、血管生成、肉芽组织形成和胶原蛋白沉积是伤口愈合合成代谢的主要步骤。上皮形成发生在伤口修复的早期。如果基底膜仍然完整，上皮细胞即以正常方式向上迁移。这相当于一级皮肤烧伤。在皮肤下的上皮祖细胞保持完整的情况下，正常的表皮层将在2-3天后恢复。如果基底膜已经遭到破坏，则类似于二度或三度烧伤，伤口将重新从外周正常细胞和完好的皮肤附属物(例如发囊和汗腺)形成上皮。
TNF-α激活的血管生成是以内皮细胞迁移和毛细血管形成为特点。新的毛细血管输送营养物质到伤口处帮助以维持肉芽组织床。迁移到伤口的毛细管对于正确的伤口愈合是重要的。肉芽形成期和组织沉淀需要通过毛细血管供应营养，如果得不到供应，会导致伤口长期不能愈合。修饰血管生成的机制正在研究中并且有很大的潜力来改善愈合过程。
增生期的最后部分是肉芽组织形成。成纤维细胞分化并产生基底物质进而形成胶原蛋白。基底物质沉积到伤口；然后胶原蛋白沉积，伤口即开始最后的修复阶段。许多细胞因子参与伤口修复的增生期。精确的控制机制和步骤还没有被阐明。这些细胞因子包括PDGF、胰岛素样生长因子(IGF)和EGF。所有这些对于胶原蛋白形成都是必须的。
伤口愈合最后的阶段是成熟期。伤口收缩，最终产生少量明显的疤痕组织。整个过程是动态的连续的，各阶段交迭在一起并连续重建整个过程。一年后伤口达到最大强度，其抗张强度达到正常皮肤的30％。胶原蛋白沉积可持续较长时期，但净增长在21天后达到平台。
目前，细胞因子在临床实践中的作用还是有限的。目前仅有的商品是在随机双盲实验中被证实有效的PDGF，即重组人PDGF-BB。多项研究已经证实，重组人PDGF-BB能缩短伤口愈合时间并提高III和IV期溃疡的伤口完全愈合率。许多目前正在进行体外研究的其它细胞因子包括TGF-β、EGF和IGF-1。
伤口愈合过程应包括多种细胞和细胞因子的复杂协同作用。最近几年，已经鉴定了参予此过程的多种化学介质。尚未完全弄清连续步骤和特殊过程。当检查伤口愈合过程时，应鉴别某些主要步骤并知道重要介质。
烧伤和伤口愈合烧伤是由于暴露于热、电、辐射(例如太阳光照射和激光外科)或者腐蚀性化学品下所造成的损伤。
一般认为有三种程度的烧伤。在一度烧伤中，称为表皮的皮肤外层变红，对触摸敏感，并常常见有肿胀。一般无需治疗，涂抹药膏即可减轻疼痛。
二度烧伤以不定量的表皮毁损和水泡形成为特征，并可能有神经末梢暴露。更严重的情况应该就医并小心护理以避免感染。局部的治疗包括应用化学药品例如硝酸银产生软痂，以减少感染机会并减轻疼痛。三度烧伤包括全层皮肤和下面结缔组织的损毁。在更严重的情况下，下面的骨头也被烧焦。所涉及的表面面积比烧伤的深度更显着。必须预防或消除休克，可能需要输血代替流失的体液。必须防止各种细菌的侵入或者用抗生素或其它药物进行将其消除。可以利用吗啡减轻疼痛。长期的治疗可以包括移植自然或人造皮肤。
糖尿病与伤口愈合糖尿病是一类以高血糖(葡萄糖)为特征的新陈代谢疾病，是由于胰岛素分泌或功能欠缺或者兼而有之引起的。糖尿病通常是指以“甜尿”为特征的糖尿病。高水平的血液葡萄糖(高血糖症)导致葡萄糖溢入尿液中，因此有糖尿这个术语。通常，血液葡萄糖水平是被胰岛素这种胰岛产生的激素严格控制的。胰岛素降低血液葡萄糖水平。当血液葡萄糖升高时(例如饭后)，胰腺分泌胰岛素保持葡萄糖水平正常。糖尿病病人由于胰岛素缺乏或不足而引起高血糖症。糖尿病是一种慢性病症，意即可能会持续终生。
糖尿病可能会引起几种并发症，包括心血管疾病、失明、肾衰竭和足部溃疡。
糖尿病人由于神经损伤(糖尿病神经痛)和腿和脚部血流速度低所引起的麻木而存在足部受损伤的危险。更严重的损伤是足部溃疡。糖尿病足部溃疡很容易被感染，以致有时不能被治愈。糖尿病人不能被治愈的足部溃疡常常要截肢。
FDA已经批准了一种用来治疗糖尿病足部溃疡的凝胶产品(Becaplermin或Regranex Gel)。该产品含有遗传工程得到的血小板衍生的生长因子——一种生物体产生的促进新组织生长的蛋白质。该产品的临床研究表明，当使用Becaplermin治疗达20周后，溃疡可能完全闭合。
另一种有利于糖尿病人慢性溃疡伤口愈合的产品是商品名为DERMAGRAFT的皮肤替代物。该产品从成纤维细胞中制得，并被置于可溶解的网状材料上。当将这种材料置于溃疡上时，被逐渐地吸收，人细胞生长并取代溃疡上受损的组织。

发明内容
发明概要本发明涉及一种包含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其保守性变异体用于治愈伤口的用途。本发明还涉及用于加速伤口愈合的组合物，该组合物中包含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其中保守性变异体。
发明详述血栓调节蛋白是一种抗凝血的内皮细胞膜糖蛋白。含有六个表皮生长因子样结构和丝氨酸-苏氨酸富集区域的重组血栓调节蛋白结构域呈现又有促进有丝分裂活性。
以前的报道(申请号US11/149,378)证明，TMD23能够诱导内皮细胞(HUVEC)迁移和增殖。
本发明揭示，TMD23能有效的增强角化细胞(HaCaT)迁移，而主要表皮细胞和抗TMD23抗体则能特异性地抑制角化细胞迁移。因此，本发明第一次证明，TMD23能够通过刺激角化细胞迁移促进伤口愈合过程。
此外，动物实验表明，TMD23能增强表皮迁移并扩展到伤口区域，因而加速了伤口闭合。另一方面，伤口开口的水分蒸发速率也会有效的减少。
总之，TM能有效的提高伤口愈合的速率。
本发明涉及一种包含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其保守性变异体用于治愈伤口的用途。在优选实施例中，上述多肽还包括可连接的含有血栓调节蛋白之丝氨酸-苏氨酸富集区的氨基酸序列或保守变异体的多肽。
本发明的用途能用于加速伤口治愈，其中所说的伤口选自切割伤、裂伤、擦伤、刺伤、水泡、皮肤撕裂、供体和移植物部位、痤疮、挫伤、血肿、压伤以及表皮平整或激光修复引起的损伤。
本发明的用途可用于糖尿病病人。在一优选实施方案中，病人患有糖尿病溃疡。
本发明的用途也可用于由火、热、辐射、电或皮肤手术造成的创伤。
本用途也能用于重建外科。
在一优选实施方案中，所说的多肽或其保守性变异体应用于一组选自凝胶、膏状物、洗液、喷雾剂、悬浮液、溶液、分散膏、水凝胶和软膏的皮肤附着产品。在一更优选实施方案中，通过涂敷、注射或电穿孔将这些皮肤附着产品施于需要治疗的病人。
本发明还涉及一种携带多肽编码DNA的质粒用于治愈伤口的用途，所说的多肽含有血栓调节蛋白EGF样区域的氨基酸序列或其保守可变体。在一优选实施方案中，其系透过给予需要治疗的病人有效量的携带多肽编码DNA的质粒，或借助质粒疫苗给药。在一更优选的实施方案中，通过静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内途径给药。
本发明还涉及一种用于加速伤口治愈的组合物，包括含有血栓调节蛋白EGF样区域的氨基酸序列或其保守可变体的多肽。在优选实施方案中，上述多肽还包括可连接的含有血栓调节蛋白之丝氨酸-苏氨酸富集区域的氨基酸序列的多肽或其保守变异体。
本发明的组合物可应用于加速伤口治合，其中所说的伤口选自切割伤、裂伤、擦伤、刺伤、水泡、皮肤撕裂、供体和移植物部位、痤疮、挫伤、血肿、压伤以及表皮平整或激光修复引起的损伤。
本发明的组合物能用于糖尿病病人。在一优选实施方案中，病人患有糖尿病溃疡。
本发明的组合物也能用于由火、热、辐射、电或皮肤外科手术导致的伤口。
在一优选实施方案中，该组合物能用于重建外科。
在一优选实施方案中，本方法可应用于一组选自凝胶、膏状物、洗液、喷雾剂、悬浮液、溶液、分散膏、水凝胶和软膏的皮肤附着产品。在一更优选实施方案中，通过涂敷、注射或电穿孔将这些皮肤附着产品施于需要治疗的病人。
术语解释下列定义是出于说明的而不是限制目的，是为了帮助理解继后的讨论。
依照本发明，所属技术领域的技术人员可以实施常规的分子生物学、微生物学和DNA重组技术。这些技术在文献中已有了充分的阐述。
“伤口”可以是开放伤口和闭合伤口。开放伤口可以分为许多类型，包括割伤(由干净的锋利的物体如刀或剃刀引起)、裂口(由压力或撕扯引起的粗糙不规则的伤口)、擦伤(通常是由于滑过粗糙表面所引起的很表面的伤，其最上层的皮肤被擦掉)和刺伤(被一个物体例如钉或针刺破皮肤引起)。闭合伤口的分类少得多，但是同开放伤口一样危险。它们是挫伤或打伤(由硬力引起的皮肤下组织的伤害)、血肿(由血管受损使得血液在皮肤下聚集引起)以及压伤(由于长期施加的很大或极大的外力引起)。
“伤口愈合”过程分三个阶段。即为发炎期、增生期和成熟期。
发炎期的特征是止血和发炎。在伤口形成时，暴露的胶原蛋白激活血液凝结级联(内部和外部途径)，开始发炎期。组织损伤发生后，形成伤口所损伤的细胞膜释放出有效的血管收缩剂凝血恶烷A2和前列腺素2-α。此初始反应有助于限制出血。经过一个较短的时期后，毛细血管舒张继而导致局部组织胺释放，使炎性细胞能够迁移到伤口部位。炎性期延续，更多的免疫应答细胞迁移到伤口处。迁移到伤口处的第二应答细胞，即嗜中性粒细胞，负责清除细胞碎片、引发细菌的补偿介导的调理作用并通过氧化机制(即形成超氧化物和过氧化氢)破坏细菌。嗜中性粒细胞杀死细菌并清除异物对伤口的污染。
伤口愈合的第二阶段是增生期。上皮形成、血管生成、肉芽组织形成和胶原蛋白沉积是伤口愈合合成代谢的主要步骤。上皮形成在伤口修复中先发生。如果基底膜仍然完整，上皮细胞以常规模式中向上迁移。这相当于一度皮肤烧伤。伤口下的上皮祖细胞仍然完整，正常的表皮层将在2-3天后恢复。如果基底膜已经遭到破坏，则类似于二或三度烧伤，那么伤口便由外周正常细胞及完好的皮肤附属物(例如发囊和汗腺)重新形成表皮。增生期的最后部分是肉芽组织生成。成纤维细胞分化并产生基底物质和胶原蛋白。基底物质沉积到伤口；随之，伤口经受最后的修复时期——胶原蛋白沉积。许多细胞因子参与伤口修复的增生期。精确的控制机制和步骤还没有被阐明。这些细胞因子包括PDGF、胰岛素样生长因子(IGF)和EGF。所有这些生长因子对胶原蛋白形成都是必须的。
伤口愈合最后的阶段是成熟期。伤口收缩，最终产生较小量显在的疤痕组织。整个过程是动态的连续的，各阶段交迭在一起并连续重建整个过程。一年后，伤口达到最大强度，抗张强度可达正常皮肤的30％。胶原蛋白沉积可持续一个延长阶段，但胶原蛋白沉积的增加在21天后达到平台。
一般认为，“血管生成”在很大程度上受到生长因子和其它配体的调节。血管生成以及协同的组织发育和再生依靠内皮细胞增殖、迁移、分化和存活等被严格控制的过程。在这些过程中，刺激因子和抑制因子配体似乎直接或间接地与细胞受体相互作用。随着基底膜被内皮细胞和自细胞释放的酶所破坏，血管生成开始。然后，血管内腔呈线形排列的内皮细胞突出于基底膜。血管生成刺激因子诱导内皮细胞迁移通过受损的基底膜迁移。然后，这些迁移细胞萌生出亲代血管，其中内皮细胞经历有丝分裂和增殖。内皮细胞芽互相融合在一起形成毛细血管环，从而产生新的血管。
本文中提到的“烧伤”是指由于暴露于热、电、辐射(比如太阳光辐射和激光外科)或者腐蚀性化学品所造成的损伤。
糖尿病是一类以高血糖(葡萄糖)为特征的新陈代谢疾病，是由于胰岛素分泌或功能欠缺或者兼而有之引起的。糖尿病通常是指以“甜尿”为特征的糖尿病。高水平的血液葡萄糖(高血糖症)导致葡萄糖溢入尿液中，因此有糖尿这个术语。通常，血液葡萄糖水平是被胰岛素这种胰岛产生的激素严格控制的。胰岛素降低血液葡萄糖水平。当血液葡萄糖升高时(例如饭后)，胰腺分泌胰岛素保持葡萄糖水平正常。糖尿病病人由于胰岛素缺乏或不足而引起高血糖症。糖尿病是一种慢性病症，意即可能会持续终生。
糖尿病有时会引起末梢神经病变，尤其是当伴随血管受损时，可导致足部溃疡，并可能发展为坏死、感染和坏疽，有时需要截肢。
“核酸”或“核苷酸序列”是指呈单链或双链螺旋状的磷酸酯聚合形式的核糖核苷(腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷，“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺嘌呤核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧尿嘧啶核苷或脱氧胞嘧啶核苷，“DNA分子”)。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋都是可能的。术语核酸，尤其DNA或RNA分子，仅指分子的一级和二级结构，而不限制于任何特殊的三级或四级结构。因此，该术语包含发现的双链DNA，尤其是，线性或环形DNA分子(例如限制性片段)、质粒以及染色体。在特殊的双链DNA分子的结构讨论中，其序列可以依照常规习惯仅给出非转录链DNA的5′到3′方向的序列(即该链具有与mRNA同源的序列)。“重组DNA”是经过生物学处理的DNA分子。
当针对DNA片段时，术语“可连接的”表示该片段被操作以行使相应的功能，例如通过结合到启动子片段的RNA聚合酶发生转录步骤，转录沿编码片段继续进行直到聚合酶遇到转录终止子片段而停止。
本文使用的术语“核酸片段”是指cDNA核酸分子、基因组DNA、合成的DNA或初始RNA。术语“片段”是指可基于编码有用多肽的天然核苷酸序列的，完整或部分的单链或双链核苷酸片段。该片段可以随意的包含其它核苷酸小片段。
编码本发明多肽的核苷酸片段可以是基因组或cDNA来源的，例如可以按标准技术制备基因组或cDNA文库，并利用合成的寡核苷酸探针进行杂交以筛选编码整个或部分的多肽的DNA序列。
可以使用本领域已知的方法检测多肽。这些检测方法可包括使用特异性抗体，或根据酶产物的生成，或者根据酶底物的消失。例如，可使用酶学方法检测多肽的活性。
本发明的多肽可以通过所属技术领域的多种公知方法进行纯化，包括但不限定为层析法(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻层析)，电泳法(例如预备性等电聚焦(IEF))，差异溶解(硫酸铵沉淀)或者萃取法。
本文使用的术语“质粒疫苗”被定义为含有用于产生疫苗抗原的基因，以及含有能掺入构建物中允许在适当的寄主系统内生产的基因的纯化的质粒DNA制剂。


图1显示TMD23对HaCaT表皮细胞迁移的作用。
图2显示用DMAp或CGS-21680(溶液态)局部治疗的CD-1小鼠伤口愈合的时间过程。每天一次局部应用实验物质和载体，连用10天。同时局部使用CGS-21680(10μg/小鼠)作为阴性对照。于第3、5、7、9和11天，检测伤口愈合率(％)和伤口半愈合时间(CT50)并按照Dunnett’s测验的一元方差分析法比较处理组和其相应载体组的检测结果。
图3显示用DMAc或Regranex(凝胶)局部治疗的CD-1小鼠伤口愈合的时间过程。每天一次局部应用实验物质，连用10天。于第3、5、7、9和11天，检测伤口愈合率(％)和伤口半愈合时间(CT50)并按照Dunnett’s测验的一元方差分析法比较处理组和其相应载体组的检测结果。
图4显示用DMAp或CGS-21680(溶液态)局部治疗的糖尿病小鼠(Lepr db)的伤口愈合的时间过程。每天一次局部应用实验物质和载体，连用14天。同时局部使用CGS-21680(10μg/小鼠)作为阴性对照。于第3、5、7、9和11天，检测伤口愈合率(％)和伤口半愈合时间(CT50)并按照Dunnett’s测验的一元方差分析法比较处理组和其相应载体组的检测结果。
图5显示用DMAc或Regranex(凝胶形式)局部治疗的糖尿病小鼠(Lepr db)的伤口愈合的时间过程。每天一次局部应用实验物质和载体，连用14天。于第3、5、7、9和11天，检测伤口愈合率(％)和伤口半愈合时间(CT50)并按照Dunnett’s测验的一元方差分析法比较处理组和其相应载体组的检测结果。
图6显示TMD23缩减伤口开口处的水分蒸发速率。
具体实施例方式
下面的例子不是进行限制，仅是本发明的各个方面和特征的代表。
实施例1TMD23对HaCaT表皮细胞迁移的影响利用具有6.5毫米直径聚碳酸酯滤膜(8-μm孔径)的Boyden小室检测TMD23对HaCaT细胞迁移的影响。低层滤膜表面上涂覆IV型胶原蛋白。在下孔内的DMEM中加入TMD23(100ng/ml)或TMD23(100ng/ml)和抗TM抗体(1μg/ml)。各上孔中加入含有1×104个细胞的细胞悬浮液(50μL)。八小时后，用甲醇固定并用10％GIEMSA染色，在显微镜下计数通过膜迁移的细胞数目。如图1所示，TMD23显着的诱导了HaCaT细胞的趋化迁移。
实施例2材料DMAp是溶于20μl 0.5％CMC/PBS溶液中的100μg重组TMD23纯化蛋白(SEQ ID NO.1)。使用0.5％CMC(羧甲纤维素)/PBS(磷酸盐缓冲液)(pH7.4)作为DMAp和CGS-21680溶液的载体。盐酸CGS-21680(2-对-[2-羧甲基]苯氨基-5′-N-ethylcarboxamidoadenosine)是一种G蛋白激活剂，购自Sigma-Aldrich。
DMAc凝胶是溶于20mg基本凝胶中的100μg重组TMD23纯化蛋白(SEQ ID NO.1)。上述基本凝胶作为DMAc凝胶和Regranex凝胶的阴性对照物。上述基本凝胶由羧甲纤维素钠、氯化钠、三水醋酸钠、冰醋酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、间甲酚1-赖氨酸盐酸、苯甲醇、甲基氯异噻唑啉(methylchloroisothiazoline)、甲基异噻唑啉(methylisothiazolinine)、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(ammoniumacryloyldimethyltaurate/VP copolymer)和注射用水组成。Regranex凝胶购自Johnson&Johnson。
实施例中所用到的化学药品有10％中性甲醛缓冲溶液(Shiyak Kogyo，日本)、羧甲纤维素(Sigma-Aldrich，美国)、盐酸GCS-21680(Tocris，美国)、环己烯巴比妥(Sigma-Aldrich，美国)、磷酸盐缓冲液(PBS pH7.4，Sigma-Aldrich，美国)和氯化钠(Wako，日本)。
实施例中使用的设备有动物笼(Allentown，美国)、Image-ProPlus图像分析仪(Media Cybernetics，Version 4.5.29)、移液器(Gilson，德国)和12毫米内径的利刃打孔器(Sinter，台湾)。
实施例3动物体重24±2g的CD-1(Crl.)雄性小鼠由台湾BioLasco提供(经CharlesRiver实验室技术许可)。为10只小鼠分割为29×18×13cm的空间。所有小鼠是饲养在MDS医药服务公司(台湾实验室优先使用)至少一周，保持12小时光暗周期并控制温(22℃-24℃)湿(50％-60％)环境。可以自由使用标准实验室鼠食[MF-18(Oriental Yeast有限公司，日本)]和RO水。工作包括营建住处、实验以及动物处理均依照《照料和使用实验室动物指南》(国家科学院出版社，华盛顿D.C.，1996)进行。
使用动物繁殖研究所(IAR，日本)提供的体重50±5g(9周龄)非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)雄性小鼠(C57BLKS/J-m+/+Lepr db)。这些小鼠均表现有高胰岛素血症、高血糖症和胰岛萎缩。这些小鼠被关单个的通风笼架内(IVC架，36个小隔间)，整个实验都在无特异病原体条件下进行。各APEC笼(26.7cm(长)×20.7cm(宽)×14.0cm(高))经高压灭菌，容纳7只小鼠，这些动物处在保持12小时光暗周期并控制温(22℃-24℃)湿(50％-60％)的卫生环境中。这些动物可以自由获取灭菌的实验室食物和灭菌水。营建住所、实验以及处理动物等工作，均依《照料和使用实验室动物指南》(国家科学院出版社，华盛顿D.C.，1996)常规进行。
实施例4TMD23加速小鼠伤口愈合使用5只为一组的多组体重为24±2g的CD-1(Crl.)雄性小鼠。实验期间，每个动物单独的放入独立的笼中。在环己烯巴比妥(90mg/kg，IP)麻醉下，在每个小鼠的肩部和背部区域剃毛。用利刃打孔器除去包括肌膜(panniculus carnosus)和粘附组织的皮肤。皮肤损伤后，立即局部(TOP)使用DMAc、Regranex和基本凝胶20mg/小鼠，DMAp100μg/小鼠，以及载体(0.5％CMC/PBS pH7.4，20μl/小鼠)和CGS-21680 10μg/小鼠作为阳性对照，每天一次连续10天。于第1、3、5、7、9和11天，在干净的塑料纸片上示踪伤口面积，使用Image-ProPlus图像分析仪(Media Cybernetics，Version 4.5.29)进行伤口面积测量。计算伤口愈合百分率，利用Graph-Prism(Graph软件，美国)以线性回归法分析伤口半愈合时间(CT50)。按照Dunnett’s试验的一元方差分析法比较各个时间点上治疗组与其相应对照组的差异性。当P＜0.05时认为统计学上差别性显着。与相应的载体对照值相比，作为阳性标准品的CGS-21680(10μg/小鼠×10)显示提高伤口愈合(第3，5，7，9和11天)率(P＜0.05)，并使CT50下降。结果总结于图2(溶液阶段)、图3(凝胶阶段)和下面表1中。
表1试验物质对CD-1小鼠的伤口愈合和半愈合时间的影响

测定伤口愈合百分率和伤口半愈合时间(CT50)，按照Dunnett’s测验的一元方差分析法比较处理的每个时点上的处理组与其相应载体组的差异。*P＜0.05，对载体对照组。
结论整个研究中可见DMAp(100μg/小鼠)对伤口愈合具有最持久的作用，同时使CT50显着减少；DMAc和Regranex趋向于促进伤口愈合，但是对CT50没有显着影响；基本凝胶则对小鼠的皮肤伤口模型没有任何作用。
实施例5TMD23加速糖尿病小鼠的伤口愈合使用多组5只为一组的体重为50±5g的C57BLKS/J-m+/+Lepr db雄性小鼠。实验期间，每个动物单独的放入独立的笼中(IVC架，36个小隔间)。在环己烯巴比妥(90mg/kg，IP)麻醉下，在每只小鼠的肩部和背部区域剃毛。使用利刃打孔器(内径12mm)除去包括肌膜(panniculus carnosus)和粘附组织的皮肤。于第1、3、5、7、9和11天，在干净的塑料纸片上示踪伤口面积，使用Image-ProPlus图像分析仪(Media Cybernetics，Version4.5.29)进行伤口面积测量。创伤后第1天开始立即局部使用溶液形式或凝胶形式的实验物质、阳性对照物CGS-21680或Regranex，每天一次连续14天。实验物质DMAp(100μg/小鼠)，介质(0.5％CMC/PBS pH7.4)和CGS-21680(10μg/小鼠)以溶液形式和20μl/小鼠的剂量使用。DMAc、Regranex和基本凝胶(为介质对照组)以凝胶形式以20mg/小鼠的量使用。利用Graph-Prism(Graph软件，美国)，以线性回归法分析伤口半愈合时间(CT50)。遵循Dunnett’s测验的一元方差分析法比较每个处理时间点上处理组与相应对照组的差异性。当P＜0.05时，即认为统计学上差异性显着。与相应的载体对照值相比，作为阳性对照的物质CGS-21680(10μg/小鼠×14)和Regranex(20μg/小鼠×14)可使伤口愈合百分率(第3、5、7、9、11、13和15天)显着升高(P＜0.05)，并使CT50显着减少。结果总结于图4(溶液阶段)、图5(凝胶阶段)和下面表2中。
表2试验物质对Lepr db小鼠的伤口愈合和半愈合时间的影响

测定伤口愈合百分率和伤口半愈合时间(CT50)，按照Dunnett’s测验的一元方差分析法比较处理的每个时点上的处理组与其相应载体组的差异。*P＜0.05，对载体对照组。
结论在整个研究中，可见DMAp(100μg/小鼠)、DMAC和Regranex(各20mg/小鼠)以及CGS-21680(10μg/小鼠)对伤口愈合有持久的促进作用并使CT50显着减少；在早期阶段，与0.5％CMC/PBS(pH7.4)载体相比，基本凝胶载体似乎可使伤口愈合稍有延迟。
实施例6TMD23缩减伤口开口处的水分蒸发速率为了检测上皮形成速率，使用TM210 Tewameter(COURAGE+KHAZAKA电子公司，德国科隆)测定伤口区域的水分蒸发速率。较低的水分蒸发速率代表较高的上皮生成或角质化水平。结果(图6)表明，TMD23可有效地增加伤口的上皮形成速率。
所属技术领域技术人员可以容易的认识到，本发明很适于完成所提到的目的，并获得相应的结果和益处。细胞系、动物以及其生产方法只是代表最佳实施例，是可以仿效的，并不是对本发明范围的限制。其改进和其它用途是所属领域技术人员能够想到的。这些改进包含于本发明的精神内，受到权利要求范围的限定。
显而易见，所属领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以对本文公开的内容进行更动和改进。
本说明书中提及的所有专利和出版物对所属领域普通技术人员是指示性的。如同个别出版物被特殊和单独地引用作为参考文献一样，所有的专利和出版物均在本文中被引用作为参考文献。
可在缺少一种或多种成分、没有一种或多种限制的情况下实践本文举例描述的发明，这里不作特定地公开。所用到的术语和符号是说明性的而不是限定性的，而且在使用这些术语和符号时并不拒绝接受与所述特征等同或部分等同的用语。但是应该认识到，在本发明的权利要求的范围内作各种改进都是可能的。因此，应该理解的是，尽管本发明已经通过优选实施例和可选特征进行特定的公开，但是所属领域技术人员可以对其中披露的概念进行改进和更动，并且这样的改进和更动将落入权利要求所限定的本发明范围之内。
其它实施方案在权利要求中给出。
权利要求
1.一种包含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其保守性变异体用于治愈伤口的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中多肽还包括可连接的含有血栓调节蛋白之丝氨酸-苏氨酸富集区域的氨基酸序列的多肽或其保守性变异体。
3.根据权利要求1所述的用途，其中伤口选自切割伤、裂伤、擦伤、刺伤、水泡、皮肤撕裂、供体和移植物部位、痤疮、挫伤、血肿、压伤以及表皮平整或激光修复引起的损伤。
4.根据权利要求1所述的用途，其用于糖尿病病人。
5.根据权利要求4所述的用途，其中病人患有糖尿病溃疡。
6.根据权利要求1所述的用途，其中伤口是由火、热、辐射、电或皮肤外科手术导致的烧伤。
7.根据权利要求1所述的用途，其适用于重建外科。
8.根据权利要求1所述的用途，其中多肽或其保守性变异体应用于一组选自凝胶、膏状物、洗液、喷雾剂、悬浮液、溶液、分散膏、水凝胶和软膏的皮肤附着产品。
9.根据权利要求8所述的用途，其中皮肤附着产品是通过涂敷、注射或电穿孔施用于需要治疗的病人的。
10.一种携带多肽编码DNA的质粒用于治愈伤口的用途，所说的多肽含有血栓调节蛋白EGF样区域的氨基酸序列或其保守可变体。
11.根据权利要求10所述的用途，其为通过给予需要治疗的病人有效量的携带多肽编码DNA的质粒。
12.根据权利要求11所述的用途，其中给药是借助质粒疫苗。
13.根据权利要求11所述的用途，其中给药是通过静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内途径。
14.一种治愈伤口的组合物，其包括含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其保守性变异体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中多肽还包括可连接的含有血栓调节蛋白之丝氨酸-苏氨酸富集区域的氨基酸序列的多肽或其保守性变异体。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中伤口选自切割伤、裂伤、擦伤、刺伤、水泡、皮肤撕裂、供体和移植物部位、痤疮、挫伤、血肿、压伤以及表皮平整或激光修复引起的损伤。
17.根据权利要求14所述的组合物，其用于糖尿病病人。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中病人患有糖尿病溃疡。
19.根据权利要求14所述的组合物，其中伤口是由火、热、辐射、电或皮肤外科手术导致的烧伤。
20.根据权利要求14所述的组合物，其应用于外科重建。
21.根据权利要求14所述的组合物，其应用于一组选自凝胶、膏状物、洗液、喷雾剂、悬浮液、溶液、分散膏、水凝胶和软膏的皮肤附着产品。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中皮肤附着产品是通过涂敷、注射或电穿孔施用于需要治疗的病人的。
全文摘要
本发明涉及一种包含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其保守性变异体用于治愈伤口的用途。本发明还涉及用于加速伤口愈合的组合物，该组合物中包含有血栓调节蛋白的EGF样区域之氨基酸序列的多肽或其中保守性变异体。
文档编号A61K48/00GK101024072SQ200610112159
公开日2007年8月29日 申请日期2006年8月15日 优先权日2005年6月9日
发明者江传箕, 苏辉斌, 吴华林, 施桂月 申请人:江传箕, 苏辉斌, 吴华林, 施桂月