专利名称：：非蛋白水解起源的新型可溶性epcr蛋白质及其用途的制作方法非蛋白水解起源的新型可溶性EPCR蛋白质及其用途
背景技术：
：所述C蛋白系统(PC)的最后蛋白是内皮C蛋白/激活C蛋白受体(EPCR)(1,2)。EPCR表达在内皮细胞膜上并以高亲和力(Kd~30nM)结合PC和激活C蛋白(APC)。它的生理学使命是使PC集中在内皮表面上并将其呈递给凝血酶-血栓调节蛋白复合物，从而促进PC的有效激活(3)。在对非人灵长类进行的研究中，已证实用单克隆抗体阻断EPCR使APC的生理学生产减少90%，并且近期研究提出EPCR的遗传缺陷可能易于罹患静脉和动脉血栓形成(4-7)。这些事实证实EPCR可能在凝固调节和血栓形成中起重要作用。此外，EPCR似乎是负责PC的有效抗炎作用的分子之一。PC/APC与EPCR的相互作用可能在由革兰氏阴性菌感染的过程中发展的凝血病和炎症应答调节中起关键作用(8)。近来，已证实APC对内皮细胞具有抗炎和抗细胞凋亡作用，并且EPCR的存在是这种作用变得明显所必需的(9，10)。EPCR是大约46kDa的糖蛋白。成熟蛋白在除去信号肽后包括221个氨基酸，所述信号肽由17个残基组成(11)。它由位于染色体20的长臂(20qll.2)中的基因编码，由3个内含子打断的4个外显子形成(12)。外显子I编码5'非翻译区和信号肽，外显子IV编码跨膜结构域、3个残基的胞质内尾以及3'非翻译区。外显子ii和m编码EPCR的大部分胞外区，其与属于I类主要组织相容性复合物的CD1超家族的蛋白质的结构域ocl和a2具有同源性。近来，显示EPCR如何具有由折叠的P折叠形成的平台的三维结构已设法被结晶和分析，在所述平台上2个具有a螺旋构象，其形成稳定分子的其中容纳磷脂的口袋U3)。同样地，通过丙氨酸扫描，涉及与PC/APC结合的主要残基已被鉴别，在钙和镁离子的存在下它经由它的GLA结构域与所述主要残基结合(14)。但是，除了内皮细胞膜上锚定的EPCR之外，还存在血浆可溶形式(sEPCR)，其至少部分地来自EPCR通过经由刺激物例如;疑血酶诱导的金属蛋白酶的消化U5，16)。文章(15)J.Clin.Invest.第100巻,no.2July1997,411-418,涉及在血浆中发现的可溶形式的EPCR。它说明血浆中的EPCR似乎是独特的种类，并且纯化蛋白质的氨基末端片段测序给出血浆EPCR的独特序列，其与重组sEPCR的氨基末端序列一致。它说明在其他受体的情况下，所述可溶性EPCR的起源可能是蛋白水解破裂，或可变切割-剪接机制，并且具体地牛EPCR的基因组结构包含可变切割位点，其编码其中跨膜结构域由内含子编码的序列代替的蛋白质，所述内含子位于外显子III后(17)。这个文件指出将需要更多的研究以证明来源于可变切割的EPCR形式的可能性。此外，申请WO-9900673涉及人血浆中的sEPCR的分离和表征，并且它说明sEPCR可能来自蛋白水解，其中EPCR的胞外结构域被释放并且使蛋白其余部分结合膜，或来自mRNA的可变切割-剪接机制，这产生altsEPCR的序列。本申请的图l显示图解，其中观察到蛋白水解起源的可溶性EPCR(psEPCR)、通过可变切割-剪接获得的申请WO-9900673中公开的EPCR(altsEPCR)、以及本发明的新EPCR对象(sEPCRvar)之间的差异。本申请因此指出至少人EPCR可以经历可变切割-剪接过程，从而产生可溶性截短的EPCR，其包括只在来源于所述可变切割-剪接机制的可溶性EPCR(sEPCRvar)中存在的独特插入片段。所述sEPCRvar可以充当大血管和癌症中的疾病过程标记。当APC结合sEPCR时，它失去它的抗凝血性但维持它的酶促能力，由于这个原因认为sEPCR改变APC特异性，可能将其导向目前未知的底物，其可以连接至归因于APC的抗炎性质(18)。sEPCR与膜上存在的EPCR竟争C蛋白并以这种方式抑制APC产生。还已描述sEPCR通过蛋白酶-3(PR3)(19)和Mac-1(CDllb/CD18)能够与活化的嗜中性粒细胞相互作用，所述蛋白酶-3是存在于嗜中性粒细胞颗粒中的蛋白酶，且Mac-1是存在于嗜中性粒细胞和单核细胞表面上的诱导型表达的整联蛋白。PR3可能涉及作用于膜结合的TNF-a和IL-l卩前体的组织破坏机制。Mac-l干涉细胞信号传导和胞间粘附现象，与粘附分子例如内皮ICAM-1相互作用，由于这个原因它在炎症过程的嗜中性粒细胞募集中起作用。推测起来，sEPCR与PR3和Mac-1的结合将减少它们的活性。由人基因组DNA(cDNA)开始，本发明人已能够克隆并表达新蛋白质。它的序列与其他已知序列的分析和比较，以及其功能表征已证实所述蛋白质是通过可变剪接过程产生的未知形式的可溶性EPCR蛋白质。另一方面，所述蛋白质具有作为鉴别特征的由最初视为EPCR基因3'非翻译区的区域编码的多肽区，其在目前已知的EPCR形式中不存在。发明描述本发明首先涉及新型可溶形式的EPCR，我们称其为可溶性EPCR变体(sEPCRvar)，更具体而言涉及来源于内皮C蛋白受体的多肽，其包括序列SEQIDNO:l的残基201-256，或所述残基序列的片段。在具体实施方案中，所述片段具有至少9个氨基酸。根据本发明的具体实施方案，所述片段选自包括SEQIDNO:l的残基213-227、229-242、212-226、227-241、242-256的片^殳。特异性抗体^操作中是特別有用的。U;、、"'本发明进一步涉及分离或重组蛋白质，其包括由序列SEQIDNO:l的残基201-256形成的多肽，所述蛋白质是EPCR蛋白质。根据本发明的优选实施方案，所述分离或重组EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:1。本发明的另外目的是包括由序列SEQIDNO:l的残基201-256、或所述残基序列的片段形成的多肽的重组蛋白质。本发明的另外目的是包括编码由序列SEQIDNO:l的残基201-256或所述残基序列的片段形成的多肽的序列的多核苷酸。在具体实施方案中，所述多核苷酸来自对应于SEQIDNO:2的cDNA序列。这种cDNA涉及由mRNA逆转录的DNA。在具体实施方案中，本发明的多核苷酸可以包含在DNA构建体中。因此，本发明的另外目的是编码包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列的片段的蛋白质或多肽的DNA构建体。优选地，所述片段具有至少9个氨基酸。在所述构建体的具体实施方案中，它包括来自对应于SEQIDNO:2的cDNA序列的多核苷酸。所述DNA构建体可以整合可操作地结合所述蛋白质或多肽的控制序列。关于核酸或多核苷酸，"可操作地结合"意指一个核苷酸区域置于与另一个核苷酸序列的功能关系中。"控制序列"是由某一宿主细胞特异识别的表达信号，其调节功能，例如某一编码序列的转录和翻译。启动子、表达增强子、转录终止子、核糖体结合位点等是控制序列。剪接所需序列以形成DNA构建体可以通过在合适的限制位点切割和剪接来进行。如果这些结合位点不存在，那么可能通过常规基因工程方法使用合成寡核苷酸作为衔接头或间隔区来产生它们。本发明的多核苷酸或DNA构建体可以通过通常在实验室手册中记录的常规基因工程方法来获得。本发明的多核苷酸或构建体可以被插入合适的表达载体中。因此，本发明的另外目的是包括所述多核苷酸或DNA构建体的表达载体。在本发明不同实施方案中表达载体的选择将取决于所述表达载体准备插入其中的宿主细胞。例如，本发明的多核苷酸或DNA构建体插入其中的载体可以是质粒或病毒，其一旦引入宿主细胞中，就可以整合或不整合到细胞基因组中。这种表达载体还可以通过常规方法获付。本发明的另外目的是转化的宿主细胞，其包括编码多肽的多核苷酸或DNA构建体，所述多肽包括序列SEQIDNO:l的残基201-256，或所述残基序列具有至少9个氨基酸的片段。根据本发明，转化的宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌(五"/7en'c/n'aco//)，或真核细胞，例如酵母(尤其是巴斯德毕赤氏酵母(尸/c/zz'a尸o^on^)和啤酒斗唐酵母(5Vcc/zanm_ycescerevz.s/ae)),昆虫纟田月包或p甫l'L动4勿纟田月包系、。在本发明的具体实施方案中，具有SEQIDNO:2的本发明的多核苷酸被引入巴斯德毕赤氏酵母中以产生SEQIDNO:l的重组sEPCR蛋白质，对应于本发明中公开的通过可变切割和剪接产生的新型sEPCR形式(sEPCRvar)。用于产生DNA构建体、表达载体以及生产重组蛋白质所需的转化的宿主细胞的方法稍后详细描述，包括关于其纯化的方法。在本发明的具体实施方案中，包括本发明的多核苷酸或DNA构建体的表达载体被设计用于其在体内基因转移或治疗的组合物和方法中使用。在更具体的实施方案中，这种表达载体是病毒载体。用于这个目的的合适病毒载体包括腺病毒、腺伴随、逆转录病毒、慢病毒、曱病毒、疱渗病毒、冠状病毒衍生的载体等。本发明的另外目的是包括包含多核苷酸的表达载体的表达系统，所述多核苷酸编码包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列的片段的多肽，以及用所述多核苷酸或所述构建体转化的宿主细胞。优选地，所述片段包括至少9个氨基酸。本发明的另外目的是生产蛋白质或多肽的方法，所述蛋白质或多肽包括SEQIDNO:l的残基201-256，或所述残基序列的片段，优选具有至少9个氨基酸，所述方法的特征在于它包括在允许所述蛋白质、多肽或片段表达的条件下培养包括本发明的多核普酸或DNA构建体的宿主细胞。最优化培养的条件将取决于使用的宿主细胞。需要时，这种方法还可包括分离和纯化表达的蛋白质或多肽的某些步骤。可替代地，本发明的蛋白质或多肽可以通过其他常规方法获得，例如通过使用固相技术的化学合成；通过高效液相层析(HPLC)纯化；以及需要时它们还可通过常规，技术进行分析，例如通过测序和质谱法、氨基酸分析、核磁共振等。本发明的另外目的是编码蛋白质的mRNA，所述蛋白质包括序列SEQIDNO:l，或所述残基序列的片段。本发明的另外目的是对于包括SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列具有免疫原性质的片段的多肽的特异分离的抗体。在具体实施方案中，所述片段具有至少9个氨基酸。在具体实施方案中，所述抗体对于多肽或片段是特异的，所述多肽或片段的序列选自残基201-256、213-227、229-242、212-226、227-241和242-256,所述残基都参照SEQIDNO:l。在另一具体实施方案中，所述抗体对于SEQIDNO:l是特异的，并且当它不结合区域201-256时不识别区域1-200。根据优选实施方案，所述抗体是单克隆抗体。本发明的另外目的是用于体外选择性检测生物学样品中的EPCR蛋白质的方法，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基20]-256,例如SEQIDNO:l的新EPCR蛋白质，或所述残基序列的片段，所述方法包括-获得生物学样品，-分析EPCR蛋白质的量，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256，或所述残基序列的片段。所述生物学样品可以是包括生物学材料的任何样品。在优选实施方案中，所述生物学样品是尿、血浆、血清、组织或组织液样品。所述方法可以是4壬<可已知方法，包4舌例如质:^普法、免疫测定、化学测定、液相层析和不同的间接和直接光度法。例如，某些分析型方法可以应用于使用质语法定量标记。一般来说，标记可以从生物学样品中分离，例如通过液相层析或二维凝月交电泳。标记通过质i普法定量，例如与液相层析关联的串联质谱法(LC-MS)、MALDI-TOF-MS("基质辅助激光解吸/电离质谱法飞行时间MS")等。靶标记可以通过与已知量的纯化标记标准比较，或通过与从健康对照获得的相同类型生物学样品中存在的所述标记的量比较进行定量。在本发明的另一实施方案中，方法可以是免疫测定。一般地说，在免疫测定中使用一种或多种标记配体。如本发明中使用的，"配体"是能够特异性结合靶标记的任何化合物或分子。这些配体可以分开或组合使用(例如，抗体可以与适体组合使用)。在本发明的实施方案中，免疫测定可以是均相测定、非均相测定、酶免疫测定(EIA、ELISA)、竟争测定、免疫测定(夹层)、浊度测定、比浊测定或其他类似测定。同样地，免疫测定可以手动或用自动分析仪进行。在本发明的方法中，所述蛋白质的量与疾病相关，所述疾病选自与血管损伤相关的炎性疾病、炎症、与异常凝固相关的疾病和癌症。所述疾病还可以是自身免疫性疾病，例如狼疮、脓毒症、休克、先兆子痫、糖尿病、不稳定心绞痛、移植物的监控、再狭窄、血管成形术和肝或肾疾病。根据本发明的方法，检测的EPCR蛋白质的量还可以与校准标准进行比较。本发明的另外目的是用于检测和定量EPCR蛋白质的试剂盒，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,例如SEQIDNO:l的新EPCR蛋白质，或所述残基序列的片段，优选具有至少9个氨基酸，所述试剂盒包括a)对于包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列的片段的多肽特异的抗体，或对于SEQIDNO:l蛋白质特异的抗体，当所述抗体不结合区域201-256时不识别区域1-200。b)检测抗体a)和生物学样品中存在的EPCR蛋白质之间的反应的试剂，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256，或所述残基序列的片段。优选地，试剂盒还包括使产生的反应的量与EPCR蛋白质的正常和异常水平关联的标准，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256。本发明的另外目的是编码包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列的片段的的多肽的多核苷酸用于检测和定量对应于EPCR蛋白质的mRNA的用途，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,例如SEQIDNO:1的新EPCR蛋白质，或所述残基序列的片段，优选地所述片段具有至少9个氨基酸。所述EPCR蛋白质以与疾病相关的量存在，所述疾病选自与血管损伤相关的炎性疾病、炎症、癌症和与异常^^固相关的疾病。此外，非蛋白水解起源的新可溶形式的EPCR可以用于开发选择性单独且专有地;险测这种形式的可溶性EPCR(sEPCRvar)的存在的分析方法，优点是它可以引入特定疾病的检测，所述方法与其中检测其他形式的可溶性EPCR或膜EPCR的那些不重叠。附图简述图1:它显示不同类型的EPCR,取决于其中RNA被加工以产生成熟的信使RNA(mRNA)的方式，可以产生3种可变形式的mRNA,其依次将产生3种不同形式的蛋白质1:与将翻译为膜EPCR(mEPCR)的蛋白质有4个外显子不同的mRNA。2.只包括外显子ExI、ExII和ExIII随后为内含子3以及这个内含子后的全部序列，并且将翻译为由Esmon在WO-9900673中公开的可溶形式的EPCR(altsEPCRs)的mRNA。3.通过本发明中公开的新形式的可变切割和剪接将产生包括外显子Exl、ExII和ExIII的mRNA，但在加工中，外显子ExIV丟失，由于这个原因，跨膜结构域和胞质尾都不转录，并且在其位置中，在外显子III后，位于3'非翻译区中的隐蔽外显子的序列出现，在这种情况下mRNA将翻"i斧为本发明的新可溶性EPCR形式(sEPCRvar)。可溶性EPCR还可以通过可能来自金属蛋白酶(仍未表征)的蛋白水解活性产生，所述金属蛋白酶在膜高度切割EPCR，从而使得它产生新可溶形式的EPCR(sEPCR),其由细胞外受体级分组成并缺乏跨膜结构域和胞质内尾。图2:用特异性EPCR基因引物扩增HUVECcDNA后获得的带型除了对应于野生型EPCRcDNA的条带(1221bp,箭标1)夕卜，还观察到新的扩增片段，对应于通过可变切割-剪接产生的新变体同种型的cDNA(箭标2)。图3.用野生型EPCR(图A)或用同种型(图B)转染的COS-7细胞，两种EPCR都与绿色荧光蛋白融合。图A显示野生型蛋白质趋向在细胞膜上积聚(箭标)，同时对于同种型3，没有观察到这种定位模式(图B)。图4.举例说明了在巴斯德毕赤氏酵母中的sEPCRvar表达。如说明书中指出的，sEPCRvar从稳定转化的巴斯德毕赤氏酵母细胞的上清液中纯化。图A:显示通过SDS-PAGE分离并使用GELCODEBlue染料检测的不同蛋白质；道St:分子量标记，指出以kDa表示的每个条带的分子量；道l:重组sEPCR。观察到大约42kDa的扩散带(由于强烈的蛋白质糖基化(glycosilation));道2:sEPCRvar。观察到47kDa的扩散带(由于强烈的蛋白质糖基化)。图B:蛋白质通过蛋白质印迹使用单克隆抗-EPCR抗体进行检测；道St:分子量标记，指出以kDa表示的每个条带的分子量；道l:空白；道2:sEPCRvar。观察到大约47kDa的扩散带(由于可变的蛋白质糖基化其在35-60kDa之间)。图5.由来自不同组织和肿瘤的cDNA扩增EPCR基因。图A)1:分子量标记，2:心脏，3:肝，4:肾，5:胰，6:肺，7:胎盘。图B)1:分子量标记，2:骨骼肌，3:脑，4:胸腺，5:小肠，6:脾。图C)1:标记，2:前列腺；3:睾丸，4:卵巢，5:结肠。图D)是来自肺肿瘤的肿瘤系的样品2:H446,3:H510,4:H1264,5:H549,6:H4化7:HTB51，8:H676，9:H727,10:H720,11:H385,12:H1299。包含分子量标记的道在图中用缩写St(来自标准)指出。标记下方的条带对应于100bp的大小；每个新条带表示相对于先前条带的100bp增量(100bp，200bp，300bp……)。本发明的实施方案由内皮细胞cDNA扩增EPCRcDNAHUVEC细胞从人脐带静脉中获得，根据标准程序(JaffeEA，NachmanRL,BeckerCG，MinickCR.Cultureofhumanendothelial!cellsderivedfromumbilicalveins.Identificationbymorphologicandimmunologiccriteria.JClinInves.1973Nov;52(11):2745-56)进行i咅养，并才艮才居如(Perez-RuizA，MontesR,VelascoF,Lopez-PedreraC,AntonioParamoJ，OrbeJ,HermidaJ,RochaE.Regulationbynitricoxideofendotoxin-inducedtissuefactorandplasminogenactivatorinhibitor-1inendothelialcells.ThrombHaemost.2002Dec;88(6):1060-5)中描述的标准技术提取总RNA。将所得到的RNA逆转录为cDNA，将其与转录酶于37。C温育60分钟，随后于65°C5分钟用于灭活酶。为了^:到这点，向最终体积为10|liL的1)iigRNA中加入120单位(U)M-MuLV逆转录酶(GibcoBRL)，其包含4逆转录酶緩冲液、2mmol/L脱氧核普酸(dNTPs,Invitrogen)、0.3昭/mL随才几六聚体(GibcoBRL)、0.5mmol/L二石克苏净唐醇(diothiotreitol)和35URNA酶抑制剂(48,000U/mL来自人胎盘的RNAsin,RNAguard,GEHealthcareBio-Science)。EPCR基因的表达通过聚合酶链反应(PCR)进行分析。使用的引物(Genset,法国)是对应于序列SEQIDNO:3的5'引物和对应于序列SEQIDNO:4的3'引物。PCR以25pL的体积进行。使用先前通过逆转录1pgRNA获得的cDNA等分试样，向其中加入1UtaqDNA聚合酶(Roche)、2.5反应緩冲液(Roche)、0.5laL每种引物(来自10pmol/L溶液)、0.25At氧才亥苷酸(dNTPs,GEHealthcareBio-Science)和0.25|al1mg/mLBSA。反应混合物用水调整至25pL。扩增循环由94°C30秒的变性阶段、以及72。C3.5分钟的另一个退火和延伸阶段组成。该循环重复5次，这之后进行32个循环，使用相同的变性阶段以及68°C3分钟的另一个退火和延伸阶段。终止扩增，使混合物于68。C维持5分钟作为最终延伸阶段。PCR扩增的区段具有1221碱基对(bp)的长度。当EPCR基因在这些条件下扩增时，另外的条带出现在大约850bp的高度处(图2)。扩增的EPCR的另外条带的测序将条带2使用相同扩增条件再扩增，但从图2的850bp条带作为模板开始。在琼脂糖凝胶电泳后使用商业试剂盒-QIAquickGelExtractionKit根据制造商的说明书纯化扩增产物。如此纯化的产物用作才莫斗反用于序列反应(ABIPrismBigDyeTMTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit)。使用对应于序列SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物进行2次序列反应，一次在5，-3，方向并且另一次在相反方向。反应的结果在ABIPrism377DNAS叫uencers自动测序4义中分析。结论是新条带对应于由序列SEQIDNO:7限定的片段。这个片段的中央部分以及SEQIDN0:2的序列对应于缺乏外显子4和部分3'非翻译区的新EPCR的cDNA。这种cDNA的起源可能是EPCRRNA的可变切割-剪接现象。这种新cDNA种类编码氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽。所述序列的残基1-17对应于信号肽；残基18-200对应于EPCR的共有胞外结构域；残基201-256对应于这种新形式的EPCR的新差别结构域并代替EPCR的跨膜结构域。这种新结构域不符合成为跨膜结构域的标准。与绿色荧光蛋白融合的EPCR和sEPCRvar在哺乳动物细胞中的表达为了研究EPCR同种型的亚细胞定位，将它的cDNA在pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体中克隆以将其表达为与绿色焚光蛋白的融合蛋白。^口it匕制备的载体^f吏用Lipofectamine2000(Invitrogen)用于瞬时转化培养中的哺乳动物COS-7细胞；使用其中野生型EPCR的cDNA已克隆、与绿色荧光蛋白融合的相同载体作为对照。野生型EPCR和同种型的亚细胞定位通过焚光显微镜术检测。如图3中所示，野生型EPCR主要定位于细胞膜上，在其中观察到绿色荧光；然而，依照本发明人的々支设sEPCRvar同种型不定位于细胞膜上。EPCR同种型的克隆、表达、纯化和表征。克隆和表达为了表达鉴别的EPCR变体(EPCRvar),已通过聚合酶链反应(PCR)使用下列起始物扩增不含其信号肽的sEPCRvar序列(残基17-256):5'-agcttggcatatcgattagccaagacgcctcagatg-3'和5'-agctatcgtagcggccgcctaccctattatatcagc-3'使用内皮细胞作为cDNA模板，其在5，和3'末端分别加入Clal和另一个Notl限制位点。这些修饰允许EPCR变体序列结合啤酒糖酵母的因子cc分泌信号后的pPICZocC(Invitrogen)质粒的Clal和Notl位点，这允许许多蛋白质从酵母中有效分泌至细胞外培养基。由于克隆过程，在sEPCRvar的氨基末端添加丝氨酸残基和另一个异亮氨酸(isoleukin)残基。使用直接测序检查插入序列和载体是正确的。使用先前制备的表达载体并用Pmel限制性内切酶使其线性化后，将巴斯德毕赤氏酵母细胞^吏用化学法(EasyComp,Invitrogen)转化，结果产生在曱醇应答内源启动子中通过同源重组的sEPCRvar编码序列化的巴斯德毕赤氏酵母菌落，所述载体包;:EPCRvar编码序列，所述sEPCRvar编码序列依次包含zeocin抗性基因。简言之，将转化的酵母在4ml补加了1%(v/v)甘油的BMY培养基[1%(w/v)酵母提取物、2%(w/v)蛋白胨、100mM磷酸钾(pH6.0)、1.34%(w/v)含石危酸铵的酵母氮源、4x10-5%(w/v)生物素](BMGY)中培养并在28-30。C下伴随搅拌温育大约18小时。通过在2,000g在室温下离心5分钟收集细胞。弃去上清液并由1%甲醇诱导sEPCRvar表达18小时。为了做到这点，将细胞重悬浮于3ml补加了0.5%(w/v)甲醇的BMY中并在大约28-30。C下伴随剧烈搅拌温育18小时。温育后，将来自条件培养基的样品装载到12%NuPAGEBis-Tris凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)上并通过蛋白质印迹使用RCR-2单克隆抗体(由Dr.KenjiFukodome友情赠予，SagaUniversity,日本)检测sEPCRvar(图4)。对于大规模生产，选择分泌最高浓度的sEPCRvar的菌落。在由于其高sEPCRvar生产能力选择的菌落中，研究其曱醇代谢(快或慢代谢者(metaboliser)),这允许确立对于大多数合适菌落的最佳表达条件。一旦培养条件和曱醇诱导被最优化，就增加规模以生产大量的sEPCRvar。纯化巴斯德毕赤氏酵母培养上清液浓缩并针对不含NaCl的20mMTris-HC1(pH7.6)透析后，执行2个连续的纯化步骤离子交换层析和凝胶过滤。在离子交换纯化中，使用ResourceQ柱(GEHealthcareBio-Science)并使用等于20柱体积的0.0-300mM梯度的NaCl进行洗脱。包含sEPCRvar的洗脱级分被合并且通过离心超滤浓缩，并且P逭后施力口到Superdex75-HR10/30牙主(GEHealthcareBio-Science)以执行凝胶过滤。纯化蛋白质的浓度使用BCA总蛋白测定(Pierre,Rockford，IL)和BSA标准进行测定。为了检测纯化的sEPCRvar,将样品装载到12%NuPAGEBis-Tris凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，并在还原条件下进行电泳，随后用考马斯蓝染色。对电泳凝胶实施电印迹并使用RCR-2单克隆抗体检测sEPCRvar。为了估计sEPCRvar的分子量，在每次凝胶电泳中都包括分子量标准。表征新型可溶性EPCR变体的活性的生物化学分析sEPCRvar对PC的亲和力APC在培养的内皮细胞中的产生。使用的细胞系是EA.hy926-转化的人内皮细胞系，其已保留表达血栓调节蛋白和EPCR的能力(Steams-KurosawaDJ,KurosawaS，MollicaJS,FerrellGL，EsmonCT.TheendothelialcellproteinCreceptoraugmentsproteinCactivationbythethrombin-thrombomodulincomplex.ProcNatlAcadSciUSA.1996;93:10212-6)。将96孔板上每孔5xl04细胞与0.02U/ml凝血酶(0.17nM)(ERL，Swansea,英国)以及溶于20mMTris緩沖液，pH7.4的50-1,000nM浓度渐增的PC(Baxter,Deerfield,IL.美国)温育，所述Tris緩冲液补加了150mMNaCl，5mMCaCl2,0.6mMMgCl2,1%BSA,0.001%Tween-20和0.02%NaN3。在室温下45分钟后，加入最终浓度为0.2ial的来匹卢定(ScheringAG,Berlin,德国)以抑制凝血酶，并在3-4分钟后加入最终浓度为0.4mM的显色底物S-2366(Chromogenix，Milan,意大利)以监控其经由APC的蛋白水解。在孩i量培养板阅读器(正MSReader,Labsystems,芬兰)中动态记录405nm处吸光度的增加。使用计算在这些条件下的PC激活Km值的Enzfitter程序(Biosoft,Cambridge,英国)进行针对米画曼方程的曲线数据调整。为了研究sEPCRvar的抑制作用，与凝血酶和PC同时加入2|imol/L。因此，可以分析sEPCRvar对PC激活的作用并与sEPCR对激活的作用进行比较，这反映其对PC的亲和力。表1显示在sEPCR和sEPCRvar的存在或不存在下在培养的内皮细胞表面上经由凝血酶的C蛋白激活的生物化学表征。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>sEPCR和sEPCRvar对PC的亲和力活化部分凝血激酶时间的测定。活化部分凝血激酶时间(APTT)使用DiagnosticaStagoBoehringerMannheimSTACompact设备(Roche)和Pathromtin试齐'j(DadeBehring，美国)使用来自健康受试者的5份血浆混合物进行测定。如众所周知的，正常血浆混合物中APC的存在导致APTT延长。在使用的实验条件下，在APC不存在下的APTT是33.1士0.4秒(平均值士SD),同时当APC以1nmol/L的最终浓度加入时，APTT延长至43.9±0.4秒。当加入sEPCR时，APC的作用被减少，从而卩吏得在1mmol/LsEPCR的存在下APTT为37.2±0.2秒。sEPCR对APC抗凝作用的这种抑制作用是剂量依赖性的。加入正常血浆混合物中的sEPCR对APTT没有直4^作用(不存在下的33.1士0.4秒与sEPCR存在下的33.9土0.4秒比较)。所有实一睑重复4次。当代替sEPCR加入相同浓度的sEPCRvar时，结果与使用sEPCR观察到的那种结果可重叠，这证实sEPCRvar如sEPCR—样结合APC。表2显示sEPCR和sEPCRvar对APC抗凝功能的作用。向其中加入1nmol/LAPC和不同浓度sEPCR的正常血浆混合物的凝血时间(APTT)。表示了4次实验的平均值士SD。在APC不存在下的APTT是33.1±0.4秒。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在不同组织和肿瘤系中的sEPCRvar表达分析为了鉴别其中表达sEPCRvar的组织，通过PCR使用允许同时扩增对应于EPCR和sEPCRvar的cDNA的引物研究不同人组织的cDNA文库(多组织cDNA(MTC)组I和II，Bioscience,美国)。使用的引物(Genset,法国)是引物5，5，-GCAGTATGTGCAGAAACATATTTCCGC画3,和引物3，:5'-CATCCCAAGTCTGACACACCTGGAAGT-3，PCR以25)iL的体积进行。使用cDNA等分试样，向其中加入1UtaqDNA聚合酶(Roche)、2.5iuL反应緩冲液(Roche)、0.5|aL每种引物(来自10pmol/L溶液)、0.25脱氧核苷酸(dNTPs，GEHealthcareBio-Science)和0.25|dl1mg/mLBSA。反应混合物用水调整至25pL。扩增循环由94。C30秒的变性阶段、以及56°C1分钟的另一个退火阶段和72。C1.5分钟的延伸组成。该循环重复35次。终止扩增，使混合物于72。C维持5分钟作为最终延伸阶段。扩增的EPCR的cDNA区段具有578bp的长度，同时sEPCRvar的那种是189bp(图5)。sEPCRvar形式在胰、心脏、肝、肾、肺、胎盘、胸腺、小肠、脾和结肠中丰富表达。sEPCRvar形式在某些肿瘤系特别是H549、H441和H720中丰富表达。某些肺瘤系特别是H446和H676进一步表达另一种仍未鉴别的形式，其依照其电泳迁移率具有1000bp。抗体产生免疫接种至少1个月大的BALB/C雄性依照下列模式使用sEPCRvar进行免疫3次皮下、皮内或腹膜内免疫接种或其组合，免疫原的量为在弗氏佐剂或另一种佐剂中的10-200昭，隔开至少2周；第三次免疫接种后2周，施用2次新的加强剂量，隔开2天并使用相同量的免疫原但这次溶于盐水血清中。其他动物同样用SEQIDNO:l的肽213-227、229-242、212-226、227-241和242-256的混合物进行免疫接种。选择这些肽是因为根据KyteJ.,DoolittleR.F.(J.Mol.Biol.,1982;157:105-132)的算法依照Protscale程序它们是高度亲水的。融合。最后一次加强剂量后2天,生产杂交瘤；这是在聚乙二醇1500或4000的存在下由动物脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0-Agl4;P3X63-Ag8.6.5.3;P3-NS-l-Ag4-l;等)融合组成的技术。这种试剂使得膜融合，从而使得杂交体将在各种细胞类型之间产生动物B淋巴细胞和骨髓瘤细胞之间的杂交体将形成新细胞类型-杂交瘤，它将产生抗体并且在培养中还将是无限增殖的。向细胞培养物中加入HAT培养基以选择这些杂交瘤并除去其余杂交体HAT包含氨基蝶呤-鸟苦从头合成途径(从头途径)的抑制剂。因为骨髓瘤细胞缺乏核酸合成补救途径所需的功能性HPRT酶，所以当唯一可用的途径从头途径被氨基蝶呤阻断时，它们不能合成核酸；因此，培养2周后，培养物中存活的唯一细胞将是脾细胞-骨髓瘤杂交体脾细胞将给予杂交体通过可替代途径合成鸟苷的能力，并且骨髓瘤细胞给予在体外培养中无限培养的能力。产生抗-sEPCRvar和抗-sEPCR抗体的杂交瘤的检测。HAT培养基中的细胞将分布在至少10个96孔微量培养板中。融合后9-14天，集落的大小将足以分析上清液中抗体的存在。为了选择分泌目的抗体，即针对sEPCRvar的抗体的杂交瘤，上清液样品将取自包含克隆的5个微量培养板的所有孔，以对其实施免疫测定执行ELISA和蛋白质印迹测定。对于ELISA，板用sEPCRvar包被，0.3吗/孔；在4。C下温育15小时并用合适蛋白质相应封闭后，将加入培养上清液，进行相应洗涤并随后加入第二小鼠抗免疫球蛋白抗体。以这种方式，洗涤并用过氧化物酶和邻苯二胺(o-phenylendiamine)使孔显色后，其中检测到颜色或吸光度(492nm)增加的那些孔可能包含分泌sEPCRvar抗体的杂交瘤克隆。对于蛋白质印迹，使用重组蛋白质和/或表达sEPCRvar蛋白质的组织或细胞提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。将它转移至经由格子类型装置分为独立区带的硝酸纤维素或PVDF膜以证实上清液中特异性抗体的存在。封闭并与特异性抗体温育后，将它洗涤3次并与缀合至过氧化物酶的第二抗体温育。使用通过酶转化后在它已结合特异性抗体的位置中产生光的底物进行显色。如果发光带对应于具有预期分子量的蛋白质，那么上清液来自于其的孔的抗体生产性细月包将生长并冷冻于液氮中。因为sEPCRvar包含完整的sEPCR部分，所以将分析sEPCRvar阳性杂交瘤的重组EPCR的胞外区的反应性。以这种方式可以选择产生针对sEPCRvar特定区域的抗体的那些杂交瘤。杂交瘤的单克隆性(monoclonality)。为了确保分泌抗-sEPCRvar抗体的每种细胞培养物都是单克隆的，应用克隆或限度稀释技术来自原始培养或来自在第一次蛋白质印迹或ELISA测试中阳性的干细胞的分离细胞将在新微量培养板上生长。一旦由一种或多种细胞产生的新集落获得足够大小，那么将再次从这些中获取上清液以对其实施新ELISA或蛋白质印迹。对再次阳性的集落实施限度稀释并重复该过程直至第3次限度稀释后分析的上清液的100%包含针对sEPCRvar的抗体。抗体纯化。在特定条件下培养杂交瘤以获得更大的抗体浓度得率后(培养并瓦^f吏用来自IntegraBiosciences的CELline系统或来自BectonDickinson的CELline系统)，将通过液相层析4吏用一种或几种下列方法对包含IgGs的上清液实施纯化免疫亲和层析、亲和层析(在A蛋白/G蛋白/L蛋白中，固定的金属，生物亲和性)、阳离子交换、羟磷灰石、疏水相互作用、凝胶过滤等，其中使用AKTAFPLC设备，GEHealthcareBio-Science)。参考文献1.BangaloreIT,Drohan丽,Orthner.CL.'HighaffinitybindingsitesforactivatedproteinCandproteinConculturedhumanumbilicalveinendothelialcells.IndependentofproteinSanddistinctfromknownligands,ThrombHaemost199472:465-74.2.FukudomeK,EsmonCT.Identification,cloning,andregulationofanovelendothelialcellproteinC/activatedproteinCreceptor.JBiolChem1994;269:26486-91.3.Stearns-KufosawaDJ,KurosawaS,MollicaJS,FerrellGIj,EsmonCT.TheendothelialcellproteinCxeceptoraugmentsproteinCactivationbythetkrombin-thrombomodulincomplex.ProcKTatlAcadSciUSA1996;93rl0212-6,4.TaylorFBJr,PeerGT,Loc:khartMS,FerrellG,EsmonCT.EndothelialcellproteinCreceptorplaysanimportantrolein■proteinCactivationinvivo.Blood2001,.97:1685-8,5.Bigu:zziE,MeratiG,Liaw.PC,BucciarelliP,OganesyanQuD,GuJM,FetiveauR,EsmonCT,MannucciPM,FaioniEM.A23bpinsertionintheendothelialproteinCreceptor'(EPCR)geneimpairsEPCRfunction.ThrombHaetnost2001,.86:945-8.6.SaposnikB,RenyJL,GaussemP,EmmerichJ,AlachM,GandrilleS.AhaplotypeoftheEPCRgeneisassociatedwithincreasedplasmalevelsofsEPCRandisacandidateriskfactorforthrombosis,B:Lood2004,.103:1311-1318.7.UittedeWilligeS,VanMarionV,RosendaalFR,VosHL,deVisserMC,Bert.inaRM,HaplotypesoftheEPCRgene,plasmasEPCRlevelsandtheriskofdeepvenousthrombosis.JThrombHaemost.2004,'2:1305-10.8.TaylorFB<Jr,Stearns-KurossawaDO",KurosawaS,FerrellG,ChangAC,LaszikZ,KosankeS,PeerG,EsmonCT.TheendothelialcellproteinCreceptoraidsinhostdefenseagainstEscherichia,colisepsis.Blood2000/95:16130-6.9.JoyceDE,GelbertL,CiacciaA,DeHoffB,GrinnellBW.Geneexpressionprofileofantithromboticproteincdefinesnewmechanismsmodulatinginflammationandapoptosis.JBiolChem.2001/276:11199-203.10.RiewaldM,PetrovanRJ,DormerA,MuellerBM,RufW.Activationofendothelialcellproteaseactivatedreceptor1bytheproteinCpathway.Science2002'.296:1880-2.11.FukudomeK,KurosawaS,Stearns-KurosawaDJ,HeX,RezaieAR,EsmonCT.TheendothelialcellproteinCreceptor.Cellsurfaceexpressionanddirectligandbindingbythesolublereceptor.JBio:lChem1996;271:17491-8.12.SimmondsRE,LaneDA.Structuralandfunctionalimpl丄cat:ionsoftheintrcm/exonorganisationofthehumanendotelialcellproteinC/activatedproteinCreceptor.gene.ComparationwiththestructureofCDl/majorhistocompatibility■■complexa1anda2domains.Blood1999,-94:632-41.13.■OganesyanV,OganesyanN,TerzyanS,QuD,DauterZ,Esmon肌,EsmonCT.Thecrystalstructureoftheeiidothel丄alproteinCreceptorandaboundphospholipid.JBiolChem2002;277:24851-4.14.LiawPC,MatherT,OganesyanN,FerrellGL,EsmonCT.IdentificationoftheproteinC/activatedproteinCbindingsitesontheendothelialcellproteinCreceptor.Implicationsforanovelmodeofligandrecognitionbyamajorhistoco.mpatibilitycomplexclass1-typereceptor.CTBiolChem2001/276:8364-70.15.KurosawaS,Stearns-KurosawaDJ,HidariN,EsmonCT.Identification,offunctionalendothelialproteinCreceptorin'humanplasma.JClinInvest1997;100:411-8.16.XuJ,QuD,EsmonNL,EsmonCT.MetalloproteolyticreleaseofendothelialcellproteinCreceptor.JBiolChem2000;275:S038-44.17.FuJcudomeK,EsmonCT.MolecularcloningandexpressionofmurineandbovineendothelialcellproteinC/activatedproteinCreceptor(EPCR).Thestructuralandfunctionalconse;cvationinhuman,bovine,andmurineEPCR.JBiolChem1995,'270:5571-7.18.LiawPCY,NeuenschwanderPF,SmirnovMD,EsmonCT，MechanismsbywhichsolubleendothelialcellproteinCrecepto]:modulatesproteinCandactivatedproteinC.JBiolChem2000,-275:5447-52.19.KurosawaS,EsmonCT,Stearns-KurosawaDJ.ThesolubleendothelialproteinCreceptcirbindstoactivatedneutrophils:involvementofproteinase-3andCD1:1±>/CD18.JImmunol2000;165:4697-703.权利要求1.一种来自内皮C蛋白受体的多肽，其作为关于主要血管和癌症中的疾病过程的标记有用，其特征在于它包括序列SEQIDNO1的残基201-256，或所述201和256之间的残基序列的片段。2.根据权利要求1的多肽，其特征在于它是包括SEQIDNO:l的残基213-227、229-242、212-226、227-241、242-256的片^殳。3.—种分离的EPCR蛋白质，其特征在于它包括由序列SEQIDNO:l的残基201-256形成的多肽。4.根据权利要求3的分离的EPCR蛋白质，其特征在于它包括序列SEQIDN0:1。5.—种重组蛋白质，其特征在于它包括如权利要求l-4任何一项中限定的多肽。6.—种分离或重组多核苷酸，其特征在于它包括编码由序列SEQIDNO:1的残基201-256形成的多肽、或所述多肽的片段的序列。7.根据权利要求6的多核普酸，其特征在于它来自对应于SEQIDNO:2的cDNA序列。8.根据权利要求6或7之一的多核苷酸，其特征在于它进一步包括可操作地结合的控制序列，所述控制序列调节由所述多核苷酸编码的蛋白质或多肽的表达。9.一种DNA构建体，其特征在于它包括编码由序列SEQIDNO:l的残基201-256形成的多肽、或所述多肽的片段的序列。10.根据权利要求9的DNA构建体，其特征在于它包括来自对应于SEQIDNO:2的cDNA序列的多核苦酸。11.根据权利要求9或IO之一的DNA构建体，其特征在于它进一步包括可操作地结合的控制序列，所述控制序列调节由所述多核苷酸编码的蛋白质或多肽的表达。12.—种表达载体，其特征在于它包括权利要求6-8之一中限定的多核普酸，或权利要求9-11之一中限定的DNA构建体，其编码如权利要求1中限定、包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述序列的片段的多肽。13.—种宿主细胞，其特征在于它包括权利要求6-8之一中限定的多核普酸，或权利要求9-11之一中限定的DNA构建体或根据权利要求12的表达载体。14.根据权利要求13的宿主细胞，其特征在于所述多核苷酸或DNA构建体可操作地结合合适的控制序列。15.根据权利要求13或14之一的宿主细胞，其特征在于所述细胞是原核细胞或真核细胞。16.根据权利要求15的宿主细胞，其特征在于所述细胞是细菌大肠杆菌或酵母巴斯德毕赤氏酵母。17.—种表达系统，其特征在于它包括如权利要求12中限定的表达载体和如权利要求13-16之一中限定的宿主细胞。18.—种生产权利要求1-5之一中限定的蛋白质、多肽或所述多肽的片段的方法，其特征在于它包括在允许所述蛋白质、多肽或片段表达的条件下培养权利要求13-16之一中限定的宿主细胞。19.一种mRNA,其特征在于它编码包括序列SEQIDNO:l的残基201-256、或所述残基序列具有至少9个氨基酸的片段的蛋白质。20.—种抗体，其对于包括序列SEQIDNO:l的残基201-256，或所述残基序列具有免疫原性质的片段的多肽特异。21.根据权利要求20的抗体，其特征在于所述SEQIDNO:l的残基201-256的序列片段具有至少9个氨基酸。22.根据权利要求20的抗体，其特征在于它对于多肽或所述多肽的片段是特异的，所述多肽或片段的序列已选自残基201-256、残基213-227、229-242、212-226、227-241、242-256，所述残基都参照SEQIDNO:l。23.根据权利要求20的抗体，其特征在于它对于SEQIDNO:l是特异的，并且当它不结合区域201-256时不识别区域1-200。24.根据权利要求20-23之一的抗体，其特征在于它是单克隆抗体。25.—种用于体外选择性检测生物学样品中的EPCR蛋白质的方法，所述EPCR蛋白质包括如权利要求1中限定的序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列的片段，其特征在于所述方法包括-获得生物学样品，-分析所述EPCR蛋白质的量，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列的片段。26.根据权利要求25的方法，其特征在于所述生物学样品选自尿、血浆、血清、组织和组织液。27.根据权利要求25-26之一的方法，其特征在于所述方法选自免疫学方法、层析方法和分光光度方法。28.根据权利要求25-27之一的方法，其特征在于所述蛋白质的量与疾病相关，所述疾病选自与血管损伤相关的炎性过程、炎症、癌症以及与异常凝固相关的疾病。29.根据权利要求25-27之一的方法，其特征在于它包括通过与校准标准比较来比较检测到的所述EPCR蛋白质的量。30.—种用于检测和定量EPCR蛋白质的试剂盒，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256,或所述残基序列的片段，其特征在于它包括a)如权利要求20-24之一中限定的特异性抗体，b)检测抗体a)和生物学样品中存在的所述EPCR蛋白质之间的反应的试剂，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDNO:l的残基201-256。31.根据权利要求30的试剂盒，其特征在于它还包括使产生的反应的量与EPCR蛋白质的正常和异常水平关联的标准，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDN0:1的残基201-256。32.编码包括序列SEQIDN0:1的残基201-256的多肽的多核苷酸用于检测和定量对应于EPCR蛋白质的mRNA的用途，所述EPCR蛋白质包括序列SEQIDN0:1的残基201-256，或所述残基序列的片段。33.根据权利要求32的多核苷酸的用途，其特征在于所述EPCR蛋白质以与疾病相关的量存在，所述疾病选自与血管损伤相关的炎性疾病、炎症、癌症以及与异常卩疑固相关的疾病。全文摘要本发明涉及起源于可变剪接机制的新型可溶形式的EPCR，并且更具体而言，涉及包括序列SEQIDNO1的残基201-256或所述序列的片段的多肽。本发明还涉及包括所述多肽的重组或分离的EPCR蛋白质，编码所述多肽的分离的多核苷酸，编码包括所述多肽的蛋白质的mRNA，及其在疾病检测中的用途。本发明进一步涉及包括所述多核苷酸的表达载体或宿主细胞，包括表达载体和所述细胞的表达系统，对于所述多肽特异的分离抗体，以及用于体外选择性检测生物学样品中包括序列SEQIDNO1的EPCR蛋白质的方法和试剂盒。文档编号C07K14/705GK101189260SQ200680016945公开日2008年5月28日申请日期2006年3月17日优先权日2005年3月17日发明者E·莫利纳布伊,E·马蒂纳茨安索,J·赫米达桑托斯,R·蒙特斯迪阿茨申请人:西马生物医学计划公司