体外诊断结直肠癌的蛋白质二硫化物异构酶测定方法

专利名称：体外诊断结直肠癌的蛋白质二硫化物异构酶测定方法
体外诊断结直肠癌的蛋白质二硫化物异构酶测定方法本发明涉及癌学领域。更特别地，本发明的主题是体外诊断人类患者中结直肠癌 的方法，通过确定取自这个患者的生物样品中蛋白质二硫化物异构酶的存在进行诊断，所 述方法可以用于结直肠癌相关的早期诊断、筛查、治疗随诊和预后以及用于复发诊断。结直肠癌(CRC)是主要的公众健康问题。在1996年估计全世界有875，000例新 发病例^考虑到男女两种性别，这是在西方国家最常见的癌症，其通常被分类为是由于癌 症所致死亡的前3名最常见疾病。所有阶段都考虑在内，5年存活率在60%的范围。唯有早期诊断可以帮助治疗。然而目前还没有早期血清学筛查检测或者特异性诊 断检测。目前在欧洲进行的结直肠癌筛查是用两种不同方法进行首先，使用亚临 床(paraclinical)检测，其包括查找粪便中血液的存在(便潜血检测，F0BT，例如以 Hemoccult⑩名称销售)。这种技术已经证实其临床有效性。当在年龄为50-74岁的个体 中每两年使用时，其可以使结直肠癌所致死亡率降低15-20% 2。为此，需要一半以上的人 群定期进行筛查以及对阳性检测结果的个体进行结肠镜检，任选随后进行适当治疗。然而，这种筛查技术具有某些不利之处·这种检测的主要缺点是其灵敏性一般，特别是对于腺瘤(癌前异常病变)，如果 其较大，通常导致1/10病例发生癌症。·这种检测也不是非常特异性的。粪便中出现血液也许与非肿瘤病变相关溃疡 性结肠炎、痔疮、瘘管等。在这种情况中，必须进行结肠镜检查，其缺点在后文描述。·最后，Hemoccult检测难以解释，其必须在专业中心由专业人士解读。也已经描述了特异于人血红蛋白的免疫学检测(Feca EIA . ,Heme Select; 等)。与Hemoccult. 相比其可能取得进展，但其基本上还存在相同的问题。因此，由 Enterix公司销售的hSure 可以检测87%的患有CRC的患者以及47%的具有癌前息肉 的那些患者。这是在粪便中检测人血红蛋白的一种检测方法，更特别是检测这个分子的球 蛋白部分。另一种筛查方法是在50岁以后系统进行结肠镜检，这样在理论上可以降低结直 肠癌所致死亡率。然而，在健康个体中使用内窥镜筛查以降低死亡率的这种检验的可接受 性太低(在设立这种筛查策略的欧洲国家的结肠镜检查的依从水平为大约2%)。不仅存 在一定的结肠穿孔和出血的危险(0. 1%。)和死亡危险(1/10000)，而且对于公共卫生事业 是非常昂贵的。此外，结肠镜检查需要非常限制性的提前结肠准备，这在很大程度上造成依 从性不佳。很久以来关于结直肠癌已经描述了可以通过免疫测定法测定的肿瘤标记物。这些 标记物特别是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。使用CEA用于随诊。其不可以用于筛查或者早期诊断结直肠癌，因为其灵敏性和 特异性不足。这是因为这种标记物也由其它类型癌症表达，在良性病变中也表达。尽管如 此，通过将CEA与另一肿瘤标记物如CA19-9或者CA72-4组合可以增加灵敏性而不丧失特 异性。
导致CA19-9发生生理变异的因素较罕见，但是其它良性病变(肝胆病变、胰腺病 变)或者恶性病变可诱导CA19-9增加。单独的这种标记物因此对于诊断也是无意义的。尽 管如此，因为其血清浓度与肿瘤的大小和转移癌的存在相关，因此其可用于治疗随诊或者 早期证实复发。此外，已经提出一些可商购的检测方法，如> Colopath /ColorectAlertMD，由Ambrilia销售，这是针对CRC的一种快速且
相对非侵入性筛查检测。Colopath 检测具有结直肠病变的个体直肠粘液中缩醛磷脂(复 合脂质，是磷脂的一部分)，而ColorectAlert 检测T-抗原，这是在直肠粘液中的一种复合 糖。Colopath /ColorectAlert 检测包括将直肠粘液用于试纸条，基于khiff反应获得 阳性或者阴性结果。Ambrilia研究了 1787名个体，证实Colopath /ColorectAlert 检 测出M%的早期结直肠癌病例以及49%的所有阶段病例。> COLARIS,由Myriad Genetics销售，这是检测血液中MLHl和MSH2基因突变的 一种检测方法，用以筛查遗传性非息肉型结肠癌(HNPCC综合征)。这个检测的结果在3周 内获得。Myriad使用目前可用的最灵敏及最具有特异性的测序技术。这种检测方法很昂贵。>Di -70 ，由AMDL销售，这是筛杳不同类型癌症(肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、 胃癌等)的一种检测方法。因此其对于CRC是非特异性的。所述检测方法的原理基于双夹 心ELISA技术(测定DR-70抗原)。通过酶反应揭示(抗体与生物素或者与链霉抗生物素 蛋白结合)。显色反应表示存在癌症。蛋白质二硫化物异构酶标记物(Swiss Prot No. P07237,也称作EC5. 3. 4. 1，PDI， 脯氨酰4-羟化酶亚基β，细胞甲状腺激素结合蛋白，PDI Al或者是一种多功能蛋白 质，其催化分子内二硫键的形成、破坏和重排。在细胞表面，其发挥还原酶作用并裂解附着 于细胞的蛋白质的二硫键。在细胞内部，其是位于内质网腔内的可溶的分子，在此其形成并 重排新合成的蛋白质的二硫键。其包含具有特征性CX)(C基序的硫氧还蛋白(thioredoxin) 类型的2个催化结构域。在高浓度，PDI作为伴侣蛋白，其抑制不正确折叠的蛋白质的聚集。 在低浓度，其具有拮抗作用并促进所述聚集。PDI还形成不同酶的结构亚基，如脯氨酰羟化 酶，其催化前胶原pro α链的脯氨酸残基的羟化。已经发现PDI在癌细胞表面特别富集3。 Tomonaga等4在结肠癌病例中观测到翻译后修饰。Stierum等5示出Caco-2结肠癌细胞系 的分化伴随PDI的细胞浓度增加。在专利申请EP17M586中，PDI被描述为作为某些癌症 的诊断标记物，如结肠癌。然而，仅举例说明了前列腺癌，由此目前为止还没有使用PDI作 为标记物诊断结直肠癌的灵敏性和特异性诊断方法。最后，专利申请AT 500 719A示出与 PDI A3不同，PDI不是结肠癌的标记物。本申请人现在令人惊奇地证实结肠肿瘤不仅特异性分泌PDI，而且特别从癌组织 中释放，正如后文更详细证实的那样，对其实施本发明方法的生物样品中的PDI浓度与在 健康个体中确定的参考值相比是增加的，且使用特殊的抗-PDI单克隆抗体可以提供诊断 结直肠癌的、灵敏且特异性的方法。因此，本发明的第一个主题是体外诊断结直肠癌的方法，特征在于使用针对PDI 表位的至少一种抗-PDI单克隆抗体确定取自怀疑患有结直肠癌的患者的生物样品、优选 远离肿瘤的生物样品中蛋白质二硫化物异构酶的存在，所述表位选自序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表 位。本发明还涉及这种方法在结直肠癌的早期诊断、筛查、治疗随诊和预后以及在结 直肠癌复发诊断中的应用。本发明的方法因此可以通过一种简便检测方法特异性和早期诊断结直肠癌，所述 检测方法包括在取自患者的生物样品、优选远离可能的肿瘤的生物样品中搜索PDI的存在。确定可能远离或者未远离肿瘤的生物样品中PDI的存在可以推断查找的病变。本 发明方法的一个优势也在于使用远离潜在肿瘤的样品作为诊断样品，从而可以简便且非侵 入性地诊断，而组织诊断需要侵入性的活组织检查。事实上，例如组织切片上组织标记物的 研究(免疫组织化学)感兴趣的是预后，但是对于筛查或者诊断结直肠癌无意义。短语“确定肿瘤标记物的存在”是指使用PDI表位的至少一种抗-PDI单克隆抗体 确定所述蛋白质的存在，所述表位选自序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三维结 构中与之接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表位。术语“表位”是指至少具有SEQ ID No. 1_3所示序列的肽，且至多有10、8、6或者 4个额外氨基酸均勻或者不均勻地分布在该序列的任一侧，或者仅在一侧，以及所述肽的类 似物和同系物。通常地，术语“类似物”是指这样的肽，与天然分子相比，其具有的序列呈现出一或 多个氨基酸添加、取代(通常为保守取代)和/或缺失，并具有天然多肽的结构，条件是上 述修饰不破坏抗原反应性。特别优选的类似物包括保守取代，即在氨基酸家族中发生的取代。特别地，氨基酸 通常被分为4个家族，S卩(1)酸性氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸，(2)碱性氨基酸如赖氨酸、 精氨酸和组氨酸，( 非极性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫 氨酸和色氨酸，以及(4)无电荷极性氨基酸如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时也分类为芳族氨基酸。例如，可以适 度地预测单独地用异亮氨酸或者用缬氨酸置换亮氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸或者用丝氨 酸置换苏氨酸，或者用结构相关的另一氨基酸置换氨基酸的相似的保守置换，对于生物活 性无明显影响。本领域技术人员可容易地确定感兴趣的肽分子可以耐受关于本领域熟知的 Hopp/ffoods 和 Kyte-Doolittle 图的变化的区域。术语“同源”是指两个肽分子之间的相同性百分比。当两个肽分子的氨基酸序列 在一指定长度上呈现出至少60 %、优选至少75 %、更优选至少80-85 %、更优选至少90 %及 更优选至少95-98%或者更高的序列相同性时，这两个氨基酸序列彼此是“基本同源的”。短语“SEQ ID No. 2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸所示的表位”是 指这样的表位，其由从中衍生出该表位的蛋白质的两个不同部分组成，即SEQ ID No.2以及 在蛋白质的三维结构中与之接近的芳族氨基酸所示的表位，识别这个表位的抗体需要识别 这两部分。短语“在蛋白质的三维结构中接近的芳族氨基酸”是指任何这样的芳族氨基酸，如 苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其由于PDI的三维结构而变得与SEQ ID No. 2接近。举例而言， 这种合适的芳族氨基酸可以是在第209位的苯丙氨酸、在第206位的苯丙氨酸或者在第195位的酪氨酸。短语“由结肠肿瘤释放”是指由肿瘤细胞自身或者由邻近的非肿瘤细胞在由于肿 瘤发生导致细胞表型损伤或者修饰之后主动或者被动分泌或者释放肿瘤标记物，无论机制 如何。短语“对其实施本发明方法的生物样品”是指可含有感兴趣的肿瘤标记物的任何 生物样品。举例而言，非远离肿瘤的生物样品是固体样品，如源自病人的肿瘤、这个肿瘤的 活检组织、淋巴结或者转移癌的组织，或者纯化自这些固体样品的细胞。举例而言，远离肿 瘤的生物样品是生物学液体如全血或者其衍生物，例如血清或者血浆、尿液、唾液和渗出 液，骨髓和粪便，以及纯化自这些液体样品的细胞。优选血液或者其衍生物以及粪便、渗出 物和纯化自这些液体样品的细胞。本发明的方法可以通过检测除了 PDI之外的至少一种其它肿瘤标记物而改良，优 选所述其它肿瘤标记物也是由结肠肿瘤释放至癌组织之外。因此，组合至少两种标记物可 以改良诊断结直肠癌的检验的特异性和灵敏性。因此，本发明另一主题还包括确定选自如下两组标记物的至少一种其它肿瘤标记 物的存在，所述标记物是单独或者组合的-A组白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白(ezrin)、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪 酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白，一些这些标记 物是由本申请人鉴别的新标记物，-B组具有额外的诊断意义的标记物，S卩β 2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝 集素-3、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3 α、肿瘤相关的钙信号转导蛋 白1、角蛋白类型II细胞骨架8、角蛋白类型I细胞骨架18、角蛋白类型I细胞骨架19、 上皮钙粘蛋白、CEA、绒毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72_2、睾酮、ΤΙΜΡ-1、Cripto_l、 htelectin-l、细胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、(前)防御素-A5 ；检测血液中那些 甲基化模式具有特异性改变的DNA片段，例如AXL4基因的甲基化DNAferistaless-like homeobox-4gene methylation)或者S印tin_9基因的甲基化DNA ；检测粪便DNA片段中特 异性改变，如粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变；检测人粪便 血红蛋白。本发明的方法因此可通过检测至少两个标记物而改良，一个是PDI，另一个是选自 A组的的肿瘤标记物，即白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪 酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白。“新描述的肿瘤标记物”是指蛋白质或者信使RNA或者相应基因的特异性修饰，如 突变或者甲基化。白细胞弹性蛋白酶抑制剂肿瘤标记物(Swiss Prot No. P30740，也称作LEI、 serpin Bi、单核细胞/嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂、M/NEI或者EI)在1992年测序6。 LEI通过形成在SDS作用下可以不解离的复合物而特异性抑制具有弹性蛋白酶类型或者糜 蛋白酶性质的蛋白酶7。LEI因此抑制由嗜中性粒细胞产生的三种主要的蛋白酶白细胞弹 性蛋白酶、蛋白酶-3以及组织蛋白酶G。这些蛋白酶使免疫系统通过细胞外或者吞噬的底 物蛋白酶解从而防御生物体。然而，当这些蛋白酶过量存在时，其导致炎症反应。LEI因此 可具有调节和限制细胞蛋白酶诱导的炎症反应的作用。本申请人令人惊奇地部分揭示了这种蛋白质在取自患有结直肠癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品可能远离肿瘤。所述埃兹蛋白标记物(Swiss Prot No. P15311，也称作p81、cytovillin或者绒毛 蛋白- 是这样的蛋白质，其提供细胞膜与细胞骨架的肌丝、特别是肠上皮细胞的微绒毛 之间的结合8。W. G.Jiang和S. Hiscox9已经揭示了白细胞介素IL-2、IL_8、IL-IO等可以 抑制埃兹蛋白在HD9人结直肠癌细胞系中表达。该作者“1揭示了抑制埃兹蛋白在HT115 和HRT18结直肠癌细胞系中的表达降低细胞之间的粘附并增加细胞的活动及侵入行为。已 经断定埃兹蛋白通过与细胞粘附分子E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的相互作用而调节细胞 /细胞及细胞/基质粘附。推测埃兹蛋白在控制癌细胞的侵入潜力中起重要作用。此外， Τ. Xiao等11使用ELISA量化患有肺癌的患者的血浆埃兹蛋白。然而，与对照个体相比未观 测到任何差异。本申请人令人惊奇地示出这种蛋白质在得自患有结直肠癌患者的生物样品 中是良好的标记物，所述样品可以远离所述肿瘤。酰化氨基酸水解酶1标记物(Swiss Prot No. Q03154,也称作EC3. 5. 1. 14，N-酰 基-L-氨基酸酰胺水解酶或者ACY-1)是酰化氨基酸水解酶家族的一部分。它们是催化酰 化氨基酸水解的酶，以提供脂肪酸和氨基酸12。酰化氨基酸水解酶酶活性的免疫化学测定 由K. Lorentz等在早如1975年揭示13，并用于测定不同的组织和血清14。研究表明酰化氨 基酸水解酶是在肝病变而不是在结肠癌中活性增加。此外，已经在染色体3p21. 1上鉴别酰 化氨基酸水解酶1基因15。在小细胞肺癌中，3p21. 1区域降低至纯合性，在这种情况中酰化 氨基酸水解酶表达被抑制或者不可检测16。相似地，S. Balabanov等17揭示了酰化氨基酸 水解酶表达在肾癌中被抑制。本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结直肠癌患者 的生物样品中是良好的标记物，所述样品可以远离所述肿瘤。肝脂肪酸结合蛋白标记物(SwissProt No. P07148，也称作L_FABP、FABP1、FABPL、 Z-蛋白质或者留醇转运蛋白)属于FABP家族，该家族包含9个同种型。每个同种型根据首 先在其中检测到该同种型的组织命名。这些特征性具有共有的功能和相似的三维结构，但 是其序列同源性不高。L-FABP在1985年被测序18。其是15kDa的小蛋白质，在细胞溶质中 富集且具有结合游离脂肪酸以及胆红素的能力。一些近来的研究似乎表明L-FABP蛋白质 表达的削弱可诱导肿瘤发生过程。对于前列腺癌，L-FABP在肿瘤活检组织中的表达水平比 在正常组织中的表达水平高10倍19。对于结肠癌，一些研究小组已经鉴别了 L-FABP蛋白 质在肿瘤组织中表达与在正常结肠粘膜中的表达相比降低，使用二维电泳技术进行^1。这 个结果也已经通过免疫组织化学技术证实。此外，L-FABP蛋白质在结直肠癌转移至肝的患 者中是预测肝切除的标记物21。本申请人令人惊奇地揭示了这个蛋白质在取自患有结直肠 癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。肠脂肪酸结合蛋白标记物(Swiss Prot No. P12104，也称作I-FABP、FABP-2或者 FABPI)在1987年被测序22。这是15kDa的小蛋白质，在细胞溶质中富集，且具有结合游离 脂肪酸及结合胆红素的能力。I-FABP蛋白质在小肠肠道细胞中表达，且占这种细胞类型的 蛋白质含量的2%。在组织水平，十二指肠和空肠与结肠相比含有显著较多量的I-FABP (空 肠4. 8μ g/g ；结肠0. 25μ g/g)23。I-FABP在健康个体的血浆样品中可以检测不到。另一方 面，在某些病理状况如肠缺血、Crohn' s病或者原发性胆汁性肝硬化中，在某些个体中可以 证实血浆I-FABP浓度增加23。对于前列腺癌，已经示出I-FABP mRNA在肿瘤活检组织中的表达水平比在正常组织中高7倍19。在用azoxymethane诱导结直肠肿瘤的大鼠模型中，当 该大鼠食用降低癌症发生的饮食(大豆蛋白或者乳清蛋白水解产物)时，I-FABP mRNA的 表达水平降低2. 92-3. 97倍“。本申请人令人惊奇地揭示了这个蛋白质在取自患有结直肠 癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品可以远离所述肿瘤。载脂蛋白是由极性氨基酸组成的蛋白质家族，其通过称作脂蛋白的亲水性大分子 复合物的形成而可以在血液中转运脂质。对于每种人血浆载脂蛋白，存在衍生自遗传多态 性和/或翻译后修饰的同种型，其在血液中的存在可以与某些病变相关^。载脂蛋白的血 浆浓度不是不明显，为lmg/ml26。载脂蛋白AI 标记物(NCBI No. 490098，也称作 Apo A-I, Apo AI 和 Apo Al)是具 有243个氨基酸的^kDa蛋白质。其基本上由肝和肠合成。这种蛋白质已经示出与在健康 个体中相比其在患有结直肠癌患者血清中不够富集，通过SELDI-T0F测定27。然而，本文指 出通过组合Apo AI与其它蛋白质标记物可以区分患有CRC的患者与健康个体。此外，本 文指出通过由另一小组进行的浊度免疫测定分析Apo AI未证实这个蛋白质在患有CRC的 患者血清中不够富集％。Hachem等在结直肠癌转移之后患有肝癌的患者血清中测定Apo Al。本申请人令人惊奇地示出通过免疫测定进行测定可以证实这个蛋白质在患有结直肠癌 的患者中浓度降低，与先前Engwegen等27所述相反，Engwegen等能证实这种降低仅通过实 施SELDI-T0F技术实现。通过免疫测定在生物药品中测定Apo AI是诊断结直肠癌的良好 方法，所述样品远离所述肿瘤，通过免疫测定进行的测定不是^iang等观研究小组使用的浊 度测定法。载脂蛋白AII 标记物(Swiss Prot No. P02652,也称作 ApoA II、Apo-AII 和 Apo A2)是17380-Da的蛋白质，由两条多肽链组成，每条链具有77个氨基酸，通过二硫键连接。 与载脂蛋白AI相同，载脂蛋白AII基本上由肝和肠合成。Hachem等”除了 Apo AI之外， 也测定了在结直肠癌转移后出现肝癌的患者血清中的Apo All。然而，结果不明显，不能推 断查找的病变。本申请人令人惊奇地揭示了这个蛋白质的浓度在结直肠癌患者中降低，使 其在取白患有结直肠癌的患者的生物样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。I-丝束蛋白(plastin)标记物(Swiss Prot No. Q14651，也称作小肠特异性丝束 蛋白或者丝束蛋白1)属于人丝束蛋白家族，已知其三个代表性成员I-丝束蛋白、L-丝束 蛋白和T-丝束蛋白。一些作者将丝束蛋白(plastin)称作“丝束蛋白(fimbrin)”，另一些 作者将丝束蛋白(fimbrin)命名为I-丝束蛋白。丝束蛋白是结合肌动蛋白以形成细胞骨 架(细胞骨架)的蛋白质。他们是70kDa蛋白质，在真核生物进化中相对保守。它们呈现出 强组织特异性，每次仅一种同种型存在于正常组织中3°。丝束蛋白关于癌症方面的应用在专 利US-A-5 360 715中描述，其提议一种确定细胞是否是血细胞生成或者瘤形成的细胞、即 癌性细胞的方法。这种方法主张在细胞水平测定L-丝束蛋白和T-丝束蛋白，更特别是测 定其mRNA。然而，尽管具有这些性质，但是先前未进行使用血清或者粪便样品评估丝束蛋白 在诊断结直肠癌中的重要性。此外，从未设想I-丝束蛋白是潜在的癌症标记物31。本申请 人令人惊奇地揭示了这个蛋白质在取自患有结直肠癌患者的生物样品中是良好的标记物， 所述样品远离或者未远离所述肿瘤。选自A组的肿瘤标记物在实施本发明方法的生物样品中的浓度与针对健康个体 确定的参考值相比增加或者降低。
本发明的方法也可以通过组合检测PDI与选自B组的一种其它肿瘤标记物而改 良，所述B组标记物是β2-微球蛋白，蛋白酶体20S，半乳凝集素-3，L-乳酸脱氢酶B链， 钙网蛋白，再生胰岛衍生蛋白3α，肿瘤相关的钙信号转导蛋白1，角蛋白类型II细胞骨架 8，角蛋白类型I细胞骨架18，角蛋白类型I细胞骨架19，上皮钙粘蛋白，CEA，绒毛蛋白， CA19-9, CA242, CA 50，CA 72-2，睾酮，ΤΙΜΡ-1，Cripto-1，Intelectin-Ι，细胞角蛋白 20，翻 译控制的肿瘤蛋白质，(前)防御素-A5，检测血液中其甲基化模式具有特异性改变的DNA 片段，例如AXL4基因的甲基化DNA (aristaless-样同源框-4基因甲基化)或者kptin-9 基因的甲基化DNA，检测粪便DNA片段中特异性改变，如粪便DNA的特异性突变或者粪便 DNA的甲基化模式的特异性改变，以及检测人粪便血红蛋白。当然，本发明的方法也可以在 同一测定中实施PDI、选自B组的至少一种肿瘤标记物以及选自A组的至少一种其它肿瘤标 记物的检测。β 2-微球蛋白标记物(Swiss Prot No. P61769，也称作β 2_微球蛋白，β 2Μ)是 低分子量(ll_12kDa)蛋白质，在大多数人有核细胞的表面发现。在患有癌症的某些患者血 清中β 2-微球蛋白水平增加，这种增加不具有特异性或者与肿瘤的性质、疾病的阶段或者 严重性相关。在其它疾病中也观测到显著增加，如在红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合 征、淋巴系统恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤)、某些病毒性疾病(肝炎或者AIDS) 以及在血友病患者中。由于β 2-微球蛋白通过肾小球过滤且由近曲小管重吸收，因此其在 血液中的浓度在肾病变情况中可以改变。因此测定β 2-微球蛋白是最常用于肾病变的诊 断或者获得性免疫缺陷病毒感染的随访。然而，已知这种标记物是肿瘤标记物，特别是针对 结肠癌的标记物。蛋白酶体20S标记物(也称作前体)是蛋白酶体的中心结构，其自身是与遍在蛋 白的细胞内降解相关的分子复合物32。蛋白酶体是700kDa的分子复合物，由观个亚基组成， 7个亚基组成一个环，共4个环。在人体中，已知有7个α单位(α 1、α 2、α 3、α 4、α 5、 α 6 禾口 α 7)禾口 10 个 β 单位(β 1、β 2、β 3、β 4、β 5、β 6、β 7、β II、β 2i 禾口 β 5i)。通过 其催化性质，蛋白酶体在细胞增殖、生长、调控和凋亡及因此在癌化途径中起重要作用。使 用BortezomiMVelcade)抑制蛋白酶体是一种公认的多发性骨髓瘤治疗方法。对于血液癌 症或肿瘤正在进行II期或者III三期治疗实验。Lavabre-Bertrand等33揭示了蛋白酶体 的血清水平在某些病变中可以增高，特别是在癌症中(骨髓瘤、淋巴瘤和实体瘤)。所述半乳凝集素-3标记物(Swiss Prot No. P17931，也称作feil-3，半乳糖特异性 凝集素3，MAC-2抗原，IgE-结合蛋白，35kDa凝集素，碳水化合物结合蛋白35，CBP 35，层 粘蛋白结合蛋白，凝集素L-四，L-31，半乳糖苷结合蛋白或者GALBP)是能结合N-乙酰乳糖 胺类型半乳糖苷结构的凝集素。其是具有参与多种生物功能的多功能蛋白质，所述功 能包括肿瘤细胞粘附、增殖、分化、血管发生、凋亡、转移癌进展34。多项研究已经示出fel-3 可以与多种分子组成复合物CEA、IgE、层粘蛋白、粘蛋白、Mac-2BP、LAMPU LAMP2、纤连蛋 白等。Gal-3的血清测定已经由I. Iurisci等描述35。Gal-3被捕获在用Mac-2-结合蛋白 (fel-3-结合蛋白)包被的微滴定平板上，然后用抗-Gal-3大鼠抗体揭示。这项研究表明 在胃肠道癌症、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤的情况中，Gal-3的血清水 平增加。L-乳酸脱氢酶B链标记物(Swiss Prot No. P07195,也称作LDH-B，LDH心肌亚单位(heart unit)或者LDH-H)是可以形成同源四聚体形式复合物的蛋白质。这种蛋白质也 可以与L-乳酸脱氢酶A链蛋白质(Swiss Prot No. P00338，也称作LDH-A，LDH肌单位或者 LDH-M)形成异源四聚体形式复合物。在一些实体瘤中，称作LDH的四聚体复合物在血流中 的血清剂量和/或血清酶活性与肿瘤的大小成比例地增加。推荐其与人绒毛膜促性腺激素 (β-hCG)和胎盘碱性磷酸酶组合用于精囊癌的治疗随诊中。LDH被认为是预后淋巴瘤、白 血病和结肠癌的重要标记物％。钙网蛋白标记物(SwissProt No. P27797，也称作 CRP55，calregulin，HACBP， ERp60或者grp60)是一种多功能蛋白质。其是能与实际上内质网的所有单糖基化蛋白质 瞬时相互作用的凝集素。D. J. McCool等37因此揭示了钙网蛋白参与结肠粘蛋白MUC2的成 熟。专利申请WO 03/065003中描述了一种诊断CRC的方法，该方法使用测定组织、粪便或 者体液中的钙网蛋白。再生胰岛衍生蛋白3α标记物(Swiss Prot No. Q06141，也称作Reg ΙΙΙ-α，胰腺 炎-相关蛋白1或者胰腺炎相关蛋白I (PAP 1))是在健康胰腺中弱表达的蛋白质。其在急 性胰腺炎期间及在某些慢性胰腺炎患者中过表达。在这种情况中，其在胰液及在血流中出 现38。Y. Motoo等39通过ELISA示出血液中PAP 1的水平在某些患有结肠癌、胃癌、肝癌或 者胰腺癌的患者中增加，以及在肾功能不全的患者中也增加。为此，使用由Dynabio公司 (La Gaude，France)销售的 ELISA (PANCEPAP)。肿瘤相关的钙信号转导蛋白1标记物(Swiss Prot No. P16422，也称作主要胃肠 道肿瘤相关蛋白GA733-2，上皮细胞表面抗原，EpCAM,上皮细胞糖蛋白，EGP，腺癌相关抗原， KSA, KS 1/4抗原，细胞表面糖蛋白Trop-I或者⑶3 抗原)，在1979年由于其被结直肠 癌细胞的抗体识别的能力而被鉴定4°。这种蛋白质有许多如上述的名称，但是最常用的是 EpCAM0其是在某些上皮和一些癌症的细胞基底外侧表面表达的跨膜蛋白质41。在早如1982 年，Herlyn等42揭示了在结直肠癌患者中注射抗-EpCAM单克隆抗体可以抑制肿瘤生长。这 些结果使得可以基于称作edrecolomab的抗-EpCAM抗体开发抗肿瘤治疗方式。这种治疗 方式以Panorex 名称销售。此外，Abe等43通过ELISA测定示出称作MK-I的可溶形式的 EpCAM在进行研究的10%癌症患者的血流中增加。细胞角蛋白是组成上皮细胞细胞骨架的中间丝的蛋白质的一部分。目前已经鉴别 了超过20种人细胞角蛋白。细胞角蛋白8 (Swiss Prot No. P05787，也称作细胞角蛋白-8， CK-8，角蛋白-8或者K8)、18(Swiss Prot No. P05783，也称作细胞角蛋白-18，CK-18，角蛋 白-18或者K18)和19 (Swiss Prot No. P08727，也称作细胞角蛋白_19、CK_19、角蛋白-19 或者K19)在上皮细胞中最富集，是诊断癌症病变的有效工具44。这种临床重要性与细胞凋 亡或者增殖阶段中上皮细胞释放细胞角蛋白相关。在细胞凋亡中，这种释放以可溶的片段 形式发生，其似乎在caspases的蛋白酶解作用下出现。血流中未降解的细胞角蛋白形式 从未描述。临床最常用的三种细胞角蛋白测定是组织多肽抗原(TPA)测定，组织多肽特异 性抗原(TPS)测定以及CYFRA21-1测定。TPA是广谱检测，其测量细胞角蛋白8、18和19。 TPS和CYFRA21-1测定更具特异性，分别测量细胞角蛋白18和细胞角蛋白19的片段。这 三个测定检测可能以自身或者蛋白质复合物形式存在的可溶的细胞角蛋白片段。TPA、TPS 或者CYFRA-21-1已经用于结直肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和某 些ENT癌的治疗随诊。测定血液中可溶的细胞角蛋白片段在筛查复发疾病或者评估所用治疗(放疗、化疗、激素治疗)的作用中具有临床价值。定期测定特别可以评估肿瘤体进 展。可溶的血液细胞角蛋白的量对于肿瘤阶段以及转移的形成具有预测意义。目前最常用 的细胞角蛋白血液测定是CYFRA21-1。其被高度推荐为患有小细胞肺癌的患者的治疗随诊 中。目前对于 TPA(AB Sangtec Medical Co.，Byk-Roland 等)、TPS(IDL Biotech AB,BEKI Diagnostics 等·)禾口 CYFRA-21-1 (Roche Diagnosiss, CIS Bio-International,Fujirebio Diagnostics等)有各种可商购的测定。此外，H. Kim等45已经示出测定粪便细胞角蛋白 19 (DiNonA he.)组合便潜血测定可用于筛查胃肠道疾病。最后，使用细胞角蛋白20 (Swiss Prot No.P35900，也称作角蛋白，I型细胞骨架20，CK-20，角蛋白-20，K20或者IT蛋白)在 结直肠癌中作为标记物在专利申请US2002/0160382中描述。上皮钙粘蛋白标记物(Swiss Prot No. P12830，也称作E-钙粘蛋白，uvomorulin， 钙粘蛋白-1，CAM 120/80或者CD3M抗原)是一种跨膜蛋白，其介导钙依赖性细胞粘附。其 在上皮细胞中特异性表达，在此其参与维持其表型。E-钙粘蛋白的胞质结构域结合β-连 环蛋白，所述β-连环蛋白自身结合细胞骨架的肌动蛋白丝网。这种E-钙粘蛋白/β-连 环蛋白结合在稳定上皮组织中细胞/细胞粘附中起重要作用。E-钙粘蛋白的丧失因此可降 低细胞粘附并因此增加癌细胞的侵润能力。E-钙粘蛋白或者β -连环蛋白表达降低通常与 肿瘤特别是胃肠道癌症的更大的侵润性和去分化相关。F. Roca等46因此示出患有结直肠 癌且低表达E-钙粘蛋白的患者与具有正常表达水平的患者相比具有更不佳的预后。在早 如1983年，Damsky等47揭示了可溶形式的E-钙粘蛋白可以由MCF-7乳腺癌细胞系释放。 这种可溶形式相应于E-钙粘蛋白胞外部分的裂解。随后，Katayama等48揭示了在癌症患 者中可溶形式的E-钙粘蛋白可以被释放进入血流中，Willmarms等49揭示了结直肠癌患者 血液中E-钙粘蛋白的量增加与肿瘤阶段相关。此外，Takara BioChemicals公司(Tokyo， Japan)提供了可商购的试剂盒。在1965年由P. Gold和S. Freedman5tl提议测定CEA(癌胚抗原)诊断结直肠癌，但 是在血液中测定这个标记物对于诊断相对未进展(nonadvanced)阶段结直肠癌的灵敏性 不佳。因此特别推荐测定血清CEA以评估肝癌转移的危险51以及治疗随诊。此外，其对于 结直肠癌不是非常具有特异性的标记物；事实上其在许多其它癌症(肺癌、乳腺癌等)中也 增加。另一方面，测定粪便CEA看起来比测定血清CEA或者比测定便潜血更灵敏且更具特 异性52。然而，这种测定仍未被常规提议。反应性抗原性决定簇1116-NS-19-9，更通常被称作CA19-9 (碳水化合物抗原 19.9)是由高分子量蛋白质携带53。测定血液中CA 19-9比CEA更具有特异性。在结直肠 癌、胰腺癌和肝癌(肝胆管型肝癌)中，血液CA 19-9水平增加，但是在一些非癌病变(胆 管炎)中也增加。在癌症诊断及病变治疗随诊中推荐其与CEA组合使用。J.Holmgren等54揭示了在结直肠癌中血液CA 50抗原的量增加。CA 50抗原通过 其被特异性单克隆抗体识别的能力界定。关于CA 72标记物，T.L. Klug等55揭示了在结直肠癌中血清CA 72抗原的量增加。 CA 72抗原通过其被特异性单克隆抗体识别的能力界定。相似地，P. Kuusela等揭示了在结直肠癌中血清CA 242抗原的量增加。CA 242 抗原通过其被特异性单克隆抗体识别的能力界定。在男性中测定睾酮用以诊断结直肠癌已经由M. Holland等57提议。这些作者揭示了在结直肠癌中血液睾酮水平降低。关于TIMP-I，或者1型基质金属蛋白酶的组织抑制剂标记物，专利申请US 2007/0020707描述了通过在体液中测定TIMP-I用以诊断结直肠癌。F. Model等在2006年7月在世界胃肠道癌症代表大会(World Congress on Gastrointestinal Cancer)期间提出可以检测结直肠癌患者血浆中甲基化形式的 Septin-9 基因。M. P. Ebert等59揭示了 ALX4基因或者aristaless-样同源框_4基因在结直肠癌 患者血清中比在对照血清中通常更甲基化(P < 0. 0001)。使用41. 4pg/mL阈值，获得灵敏 性为83. 3%及特异性为70%。绒毛蛋白在专利申请FR2581456中被描述为是诊断结直肠癌的血液标记物。C. Bianco等6°揭示了在结直肠癌中血清Cripto-Ι的量增加。专利申请US2003/0082533 描述了测定 htelectin-1 (Swiss Prot No.Q8WWA0，也 称作肠乳铁蛋白受体，呋喃半乳糖-结合凝集素，内皮细胞凝集素HL-I或者omentin)诊断
结直肠癌。使用翻译控制的肿瘤蛋白(Swiss Prot No. P13693，也称作TCTP，p23，组胺释放因 子，HRF或者fortiIin)以及前防御素_A5 (Swiss Prot No. Q01523)在结直肠癌中作为标 记物分别在专利申请US 2003/0172388和US 2006/0179496中描述。术语“(前)防御素” 是指前体，即裂解之前的前防御素，前肽，即在前防御素裂解之后的N-末端部分，成熟蛋白 质，即防御素，相应于裂解之后C-末端部分。最后，测定人粪便血红蛋白是一项已知技术，可以如先前所述实施。与针对健康个体确定的参考值相比，对其实施本发明方法的生物样品中选自B组 的肿瘤标记物的浓度增加或者降低。优选地，B组肿瘤标记物选自标记物β 2-微球蛋白，蛋白酶体20S，半乳凝集 素-3，L-乳酸脱氢酶B链，钙网蛋白，再生胰岛衍生蛋白3α，肿瘤相关的钙信号转导蛋白 1，上皮钙粘蛋白，CEA，CA19-9，睾酮，TIMP-I, Intelectin-l，细胞角蛋白20，翻译控制的肿 瘤蛋白，(前)防御素-A5，以及检测人粪便血红蛋白。当然，本发明的方法也可以包括检测本领域技术人员已知的结直肠癌的任何其它 标记物。与总是以蛋白质形式被检测的PDI相反，除了 PDI之外的感兴趣的肿瘤标记物以 蛋白质形式或者以信使RNA形式检测，或者通过相应DNA的改变(突变或者甲基化修饰) 而检测。确定生物样品中感兴趣的“蛋白质”肿瘤标记物的存在可以通过本领域技术人员 已知的确定样品中蛋白质存在的任何方法进行，例如生物化学检测方法，包括免疫测定，或 者通过质谱分析。所述生物化学检测可以是本领域技术人员已知的任何检测，包括分子相互作用， 即所述肿瘤标记物与特异于或者非特异于所述肿瘤标记物的一或多个结合配体之间的反应。优选地，所述生物化学检测是本领域技术人员已知的免疫测定，包括肿瘤标记物 (抗原)与一或多个更特异性的结合配体(即这种抗原的抗体)之间的免疫反应。
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特异于或者非特异于本发明方法中的肿瘤标记物的结合配体是能结合该标记物 的任何配体。当其能以高特异性或者甚至100%特异性结合这些标记物时，称其为是特异性 的。当其结合这些标记物的特异性较低以及其能结合其它配体如蛋白质时，称其为非特异 性的。例如，可以提及的是抗体、抗体部分、受体及能结合这种标记物的任何其它分子。所述结合配体抗体例如是多克隆抗体或者单克隆抗体。多克隆抗体可以通过用所述肿瘤标记物免疫接种动物，随后回收纯化形式的希望 的抗体，通过从所述动物中取血清，使所述抗体与其它血清组成成分分离，特别是在附着由 所述抗体、特别是所述标记物特异性识别的抗原的层析柱上通过亲和性层析而分离。所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术获得，这种技术的一般原理在后文复述。首先，用感兴趣的肿瘤标记物对动物通常是小鼠进行免疫接种，然后所述动物的B 淋巴细胞能产生所述抗原的抗体。这些产生抗体的淋巴细胞随后与“无限增殖化”的骨髓 瘤细胞(在实施例中是小鼠细胞)融合，以产生杂交瘤。使用由此获得的细胞的异源混合 物，选择能产生特定抗体及能无限繁殖的细胞。每个杂交瘤以克隆形式繁殖，导致单克隆抗 体产生，可以检测所述肿瘤标记物识别性质，例如通过ELISA、一维或者二维Western印迹、 免疫荧光或者利用生物传感器进行。随后纯化由此选择的单克隆抗体，特别是根据上述亲 和性层析技术进行。单克隆抗体也可以是利用本领域技术人员熟知的技术通过遗传工程获得的重组 抗体。抗蛋白质二硫化物异构酶抗体的实例是已知的，且特别可在Abcam目录中获 得，抗-PDI单克隆抗体，克隆RL77，Cat. No. Ab5484以及兔抗-PDI多克隆抗体，Cat. No.Ab3672。抗-白细胞弹性蛋白酶抑制剂抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录，兔 抗-LEI多克隆抗体，Cat. No. Ab47731。抗-LEI单克隆抗体，克隆ELA-1，已经由^sumatsu
等61在文章中描述。抗-埃兹蛋白抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录，抗-埃兹蛋白单克 隆抗体，克隆3C12，Cat. No. Ab4069,以及兔抗-埃兹蛋白多克隆抗体，Cat. No. Ab47418。抗-酰化氨基酸水解酶1抗体的实例是已知的，且特别可得自Abnova目录，抗-酰 化氨基酸水解酶1单克隆抗体，克隆4F1-B7，Cat. No. H00000095-M01,以及Abcam目录，鸡 抗-酰化氨基酸水解酶1多克隆抗体，Cat. No. Ab261730抗-肝脂肪酸结合蛋白抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录， 抗-L-FABP单克隆抗体，克隆6B6，Cat. No. Abl0059,以及兔抗-L-FABP多克隆抗体，Cat. No.Ab7807o抗-肠脂肪酸结合蛋白抗体的实例是已知的，且特别可得自R&D Systems目录， 抗-I-FABP单克隆抗体，克隆323701，Cat. No. MAB3078，以及Abcam目录，兔抗-I-FABP多 克隆抗体，Cat. No. Ab7805。抗-载脂蛋白AI抗体的实例是已知的，且特别可得自Biodesign Meridian Life Sciences目录，抗-Apo AI单克隆抗体，克隆4A90，Cat. No. H45402M，以及山羊抗-Apo AI 多克隆抗体，Cat. No. K45252P。抗-载脂蛋白AII抗体的实例是已知的，且特别可得自US Biological目录，抗-Apo AII 单克隆抗体，克隆 1402，Cat. No. A2299-31C，以及 Biodesign Meridian Life Sciences 目录，山羊抗-Apo AII 多克隆抗体，Cat. No. K74001P。抗-I-丝束蛋白多克隆抗体的实例是已知的，且特别可得自Santa Cruz Biotechnology目录。兔多克隆抗体H-300 (Cat. No. sc18531)与I-、L_和T-丝束蛋白反 应。本申请人揭示了抗I-丝束蛋白的单克隆抗体。抗-β 2-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睾酮抗体的实例是已知的，且特 别是用于本申请人测定试剂盒中的那些，分别是Vidas β 2-微球蛋白、Vidas CEA、 Vidas CA19-9 和 Vidas 睾酮。抗-蛋白酶体20S抗体的实例是已知的，特别是Affinity Research Products目 录中那些。抗-半乳凝集素-3、抗-L-乳酸脱氢酶B链、抗-钙网蛋白、抗-肿瘤相关的钙信 号转导蛋白1、抗-角蛋白类型II细胞骨架8、抗-角蛋白类型I细胞骨架18、抗-角蛋白 类型I细胞骨架19、抗-上皮钙粘蛋白、抗-绒毛蛋白以及抗-TIMP-I抗体的实例是已知 的，特别是Abcam目录中那些。抗-再生胰岛衍生蛋白3抗体的实例是已知的，特别是用于Dynabio测定试剂盒 (La Gaude，France)中的那些。抗-CA M2、抗-CA 50和抗-CA 72_4抗体的实例是已知的，特别是在Fujirebio 目录中那些。抗-Intelectin-I抗体的实例是已知的，特别是Alexis Biochemicals目 录，抗-Intelectin-I 单克隆抗体，克隆 Saly-I，Cat. No. ALX-804-850-C100，以及兔 抗-Intelectin-I 多克隆抗体，Cat. No. ALX-210-941。抗-细胞角蛋白20抗体的实例是已知的，且特别可得自Abcam目录，抗-细胞角 蛋白20单克隆抗体，克隆Ks20. 8，Cat. No. Ab962，以及兔抗-细胞角蛋白20多克隆抗体， Cat. No. Ab367560抗-TCTP抗体实例是已知的，且特别可得自Abnova目录，抗-TCTP单克隆抗体，克 隆 3C7，Cat. No. 157H00007178-M01 和抗-TCTP 多克隆抗体，Cat. No. 157H00007178-A01。抗-防御素-A5抗体的实例是已知的，且特别可得自Santa Cruz Biotechnology 目录，抗-防御素-A5单克隆抗体，克隆8C8，Cat. No. sc-53997，以及Alpha Diagnosis International Inc.目录，兔抗-防御素 _A5 多克隆抗体，Cat. No. HDEFA51-A。特异于或者非特异于本发明方法中肿瘤标记物的结合配体可以用作捕获试剂，作 为检测试剂或者作为捕获和检测试剂。免疫反应，即肿瘤标记物/结合配体的结合，可以通过任何检测方式观测，如直接 或者间接方式。在直接检测中，即不包含标记的检测中，通过例如表面离子共振法或者通过在具 有传导聚合物的电极上循环伏安法观测所述免疫反应。间接检测是通过“显示试剂”结合配体或者感兴趣的肿瘤标记物自身标记进行。在 后者中，这种方法被称作竞争方法。术语“标记”是指能直接或者间接产生可检测信号的标记试剂的附着。这些标记 试剂非限制性地包括
·酶，其产生可以例如通过比色、荧光或者发光检测的信号，如辣根过氧化物酶、碱 性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，·生色团，如荧光或者发光化合物或者染料，·放射性分子，如32P、35S或者1251，以及 荧光分子，如Alexa或者藻蓝蛋白。也可以使用间接检测系统，例如能与抗配体反应的配体。成对的配体/抗配体为 本领域技术人员熟知，可以是例如如下配对生物素/链霉抗生物素蛋白，半抗原/抗体、抗 原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/与该多核苷酸互补的序列。在这种情况中，其 是携带结合配对体的配体。抗配体可以通过先前段落中描述的标记试剂直接检测，或者可 以通过配体/抗配体自身检测。这些间接检测系统在一定条件下可以导致信号放大。这种信号放大技术为本领 域技术人员熟知，参见本申请人先前的专利申请FR98/10084或者W0-A-95/08000以及 Chevalier等62的文章。根据使用标记的类型，本领域技术人员加入试剂以可以观测所述标记。举例而言，上述免疫测定可以提及的是“夹心”方法，如ELISA、IRMA和RIA，“竞争” 方法和直接免疫检测方法如免疫组织化学、免疫细胞化学、Western印迹以及斑点印迹。质谱分析也可以用于在生物样品中检测本发明方法中的肿瘤标记物。质谱分析的 原理为本领域技术人员已知，在例如I^atterson，S.63中描述。为此，使已经预处理或者未预处理的生物样品经过质谱分析仪，并将获得的质谱 与本发明方法中的肿瘤标记物的质谱对比。举例而言，样品预处理包括使其经过免疫捕获 支持物，所述免疫捕获支持物包含本发明方法中肿瘤标记物的结合配体之一，例如本发明 方法中肿瘤标记物的抗体。样品预处理的另一实例可以是对所述生物样品进行预分级分 离，以使样品蛋白质彼此分离。在本领域技术人员熟知的技术中，样品的主要蛋白质可例如 首先被耗竭。当本发明的方法是“夹心”方法时，可以使用两种单克隆抗体或者一种单克隆抗体 和一种多克隆抗体。当然，在后者情况中，单克隆抗体至少是抗PDI表位的抗-PDI单克隆 抗体，所述表位选自序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三维结构中与之接近的芳 族氨基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表位。已知抗-蛋白质二硫化物异构酶抗体的实例，特别是Abcam目录，例如兔抗-PDI 多克隆抗体，Cat. No. Ab3672。另一方面，抗-PDI抗体特异性结合选自序列SEQ ID No. 1、SE ID NO. 2或者SEQ ID No. 3所示的表位，由此其特异性结合PDI且不结合PDIs A3和A6，所述抗体是新的抗体， 且构成本发明的另一主题。根据本发明的一个实施方案，本发明的方法使用两种单克隆抗体，优选序列SEQ ID No. 3所示表位的至少一种抗-PDI单克隆抗体以及选自序列SEQ ID No. 1以及SEQ ID No. 2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸所示PDI表位的至少一种其它单克隆抗 体。更优选地，本发明的方法使用序列SEQ ID No. 1所示表位的至少一种抗PDI抗体以及 序列SEQ ID No. 3所示表位的至少一种其它抗体。在生物样品中确定感兴趣的“mRNA”肿瘤标记物的存在可以通过确定样品中mRNA存在的任何方法进行，即mRNA的直接检测方法或者mRNA的间接检测方法，或者通过确定样 品中RNA存在的任何其它方法进行，这些方法为本领域技术人员已知。术语“mRNA的直接检测”是指证实mRNA自身存在于所述生物样品中。生物样品中mRNA的直接检测可以通过本领域技术人员已知的任何方式进行，例 如通过与特异于该mRNA的结合配体杂交，在适当情况中是在通过PCR或者NASBA技术扩增 之后进行。术语“杂交‘是指这样的过程，在此期间在合适条件下，两个核苷酸片段彼此通过 稳定和特异性氢键结合，以形成双链复合体。这些氢键在互补的碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧 啶(T)(或者尿嘧啶(U))(称作A-T键)之间形成，或者在互补的碱基鸟嘌呤(G)与胞嘧啶 (C)(称作G-C键)之间形成。两个核苷酸片段的杂交可以是完全的(互补核苷酸片段或者 序列)，即在这个杂交期间获得的双链复合体仅包含A-T键和C-G键。这种杂交可以是部分 杂交(充分互补的核苷酸片段或者序列)，即获得的双链复合体包含可以形成双链复合体 的A-T键和C-G键，但是也包含于互补碱基不键合的碱基。在两个核苷酸片段之间的杂交 依赖于使用的运行条件，特别是严格性。所述严格性特别定义为与两个核苷酸片段的碱基 成分成函数关系，与两个核苷酸片段之间的错配程度也相关。所述严格性也依赖于反应参 数，如杂交溶液中存在的离子的浓度和类型，变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。所有这 些数据均为本领域技术人员熟知，且其可以确定合适的条件。通常地，根据希望杂交的核苷 酸片段的长度，杂交温度在大约20-70°C之间，特别是在35-65°C之间，盐溶液浓度为大约 0.5-1M。特异于或者非特异于mRNA的结合配体是能结合该mRNA的任何配体。例如可以提 及的是核酸探针、扩增引物，以及能结合该mRNA的任何其它分子。术语“杂交”探针是指包含5-100个核苷酸单位、特别是10-35个核苷酸单位的核 苷酸片段，在指定条件下具有杂交特异性以与特异于感兴趣的靶基因的材料形成杂交复合 物。所述杂交探针可包含使其得以检测的标记。对于本发明，术语“扩增引物”是指包含5-100个核苷酸单位、优选15-30个核苷 酸单位的核苷酸片段，使得酶聚合作用特别是如酶扩增反应起始。术语“酶扩增反应”是指 通过至少一种酶的作用而产生核苷酸片段的多个拷贝的过程。这种扩增反应为本领域技术 人员熟知，可特别提及的是如下技术-PCR (聚合酶链反应)，如专利 US 4 683 195、US 4 683 202 和 US4 800 159 所 述，-NASBA (基于核酸序列的扩增)，见专利申请WO 91/(^818所述，-TMA (转录介导的扩增)，见专利US 5 399 491所述。术语“检测”是指物理方法，或者使用嵌入染料如STORGreen I或者溴化乙锭 的化学方法，或者使用标记的检测方法。现有许多检测核酸的检测方法64。合适的标记如 上所述。对于本发明，杂交探针可以是“检测，，探针。在这种情况中，“检测，，探针通过使用 上述标记进行标记。借助于这个标记的存在，可以检测指定的检测探针与被检测的转录体 之间的杂交反应的存在。所述检测探针可特别是“分子信标”检测探针65。这些“分子信标”在杂交期间成 为荧光的。它们具有茎环结构，且含有荧光团和猝灭基团。特异性环序列与其互补靶核酸序列的结合导致所述茎的不折叠，且在以合适波长激发期间发射荧光信号。所述杂交探针也可以是“捕获”探针。在这种情况中，所述“捕获”探针可以通过 任何适当方式即直接或者间接固定在或者可以固定在固体支持物上，例如通过共价或者吸 附方式固定。合适的固体支持物为本领域技术人员熟知，例如可以提及的是合成材料或者 天然材料、乳胶、磁性颗粒、金属衍生物、凝胶等。所述固体支持物可以使微滴定平板形式， 如专利申请W0-A-94/12670所述的膜，或者颗粒。也可以将一些不同的捕获探针固定在支 持物上，每个捕获探针特异于靶转录体。特别地，可以使用其上固定了大量探针的生物芯片 作为支持物。探针固定在支持物上也为本领域技术人员已知，可以提及的是通过直接转移、微 沉积、原位合成及光刻法(photolithography)固定探针。在生物样品中证实编码感兴趣的肿瘤标记物的基因中的DNA修饰或者异常可以 通过确定样品中DNA改变的任何方法进行，即直接检测突变，或者证实感兴趣的基因座的 甲基化模式的改变，或者确定样品中DNA改变的任何其它方法，这些方法为本领域技术人 员已知。所述突变可包括一个核苷酸由另一核苷酸的点取代，缺失一或多个核苷酸以及插 入一或多个核苷酸。所述突变可位于感兴趣的肿瘤标记物基因的编码部分，或者在5’和3’ 非编码部分，如转录启动子区域或者转录终止区域。证实突变的策略基于分子生物学技术，包括DNA提取、PCR扩增或者另一扩增技 术、杂交和/或测序步骤。在结直肠癌的情况中，如下方法已经成功用于检测粪便DNA中的 突变通过沉淀浓缩DNA，使用捕获寡核苷酸在磁珠上富集所述靶，通过PCR扩增感兴趣的 基因，固相测序以鉴别点突变66。针对预期的参考片段与突变片段之间大小的不同鉴别缺 失。Imperiale等描述了位于K_ras、APC和p53基因中的一组21个突变，使得可以检测 16/31的扩散的癌症。使用的其它DNA标记物是BAT-沈缺失，其是的微卫星DNA和称作长DNA (L-DNA) 的可高度扩增的DNA的不稳定性的标志，其不是特异性标记物，但是似乎反映结肠腔内脱 落的肿瘤细胞紊乱凋亡67。这些标记物在灵敏性或者特异性方面不令人满意。如先前指出，DNA改变也可以相应于感兴趣的肿瘤标记物的相应基因甲基化模式 的修饰。甲基化模式的修饰可相应于低甲基化(hypomethylation)(甲基化数目降低)或 者高甲基化(hypermethylation)(甲基化数目增加)。改变的单位可以位于感兴趣的肿瘤 标记物基因的编码部分，或者位于5’和3’非编码部分，如转录启动子区域或者转录终止区 域。DNA甲基化的分析可以使用基于定性和/或定量PCR技术进行，如MSP(甲基化特 异性PCR)，亚硫酸氢盐测序，用甲基化敏感的限制酶消化结合PCR，COBRA (组合的亚硫酸氢 盐限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感性单一核苷酸引物延伸)。对比参考所有这些技术， 在方法学文献中详细描述68。在文献中，已经报道了结直肠癌基因中的一些高甲基化的基因。例如，可以提及的 是ALX4 (aristaless-样同源框-4)基因59，TPEF/HHP1 (含有表皮生长因子的跨膜蛋白和卵 泡抑素(follistatin)结构域)基因69的启动子区域或者kptin-9基因7°。在本发明方法中，当检测至少两个标记物时，可以通过单独例如使用不同的免疫
17测定测量法或者同时在多元测定中证实。在本发明方法中，当检测不同性质的两个标记物时，例如蛋白质标记物和mRNA标 记物，可以使用选自上述那些方法的两种不同检测方法。也可以在同一检测介质及在相同 反应条件下同时检测，如专利申请WO 03/104490所述。本专利申请中描述的检测方法包括 同时检测样品中杂交和免疫反应，所述样品可含有由至少一种核酸及不同性质的至少一种 其它配体组成的靶分析物，所述方法的步骤包括(i)将在反应缓冲液中稀释的已知体积量的样品沉积在用所述靶分析物的捕获配 体预包被的捕获表面上，所述捕获配体包含至少一种核酸探针和至少一种抗配体，(ii)在15°C -60°C温度之间进行反应，以及(iii)观测因此获得的杂交和免疫反应。所述生物样品可需要特殊处理，因为其也许含有本发明方法中的肿瘤标记物，或 者其也许含有具有本发明方法中的标记物的循环肿瘤细胞和/或能分泌本发明方法中的 标记物的循环肿瘤细胞。因此，根据本发明的一个实施方案，对所述生物样品进行预处理以分离所述液体 中含有的循环肿瘤细胞。短语“分离循环肿瘤细胞”是指获得富含循环肿瘤细胞的细胞组份。对所述生物样品进行处理以分离循环肿瘤细胞可以通过在流式细胞仪中进行细 胞淘选、通过在Ficoll上富集、通过涌特异性抗体覆盖的磁珠富集，或者通过本领域技术 人员已知的任何其它特异性富集方法进行。在血液作为生物样品的情况中，循环肿瘤细胞可以通过在Ficoll上细胞分离技 术组合使用与磁珠结合的抗-CD45抗体耗竭血细胞而分离(Dynal Biotech ASA,Norway) 0然后可以进行本发明方法中的肿瘤标记物的检测，使用分离自生物样品的循环肿 瘤细胞进行，例如在通过细胞离心涂片器(cytospin)使循环肿瘤细胞沉积在载玻片上之 后，用本发明方法中的肿瘤标记物的抗体对这些细胞进行免疫细胞化学标记。本发明方法 中的肿瘤标记物的检测也可以通过直接在循环肿瘤细胞中使用如M6t6zeaU等71所述流式 细胞计量术进行。在这些条件下，所述循环细胞可以在使本发明方法中的肿瘤标记物封闭的条件下 在所述细胞内部处理。这种处理如Mathieu等72所述。本发明方法中的肿瘤标记物的检测在使得所述细胞膜通透之后进行，以使得特异 于本发明方法中的标记物的结合配体进入。基于循环细胞直接检测本发明方法中使用的肿瘤标记物也可以通过ELISP0T方 法进行，例如通过由本申请人申请的专利申请WO 03/076942中描述的方法进行。这种方法 是检测和/或量化生物样品的循环肿瘤细胞的方法，所述循环肿瘤细胞在体外能释放或者 分泌一或多种肿瘤标记物，所述方法包括如下步骤(i)使一定量的所述细胞沉积在附着了特异于所述肿瘤标记物的至少一种结合配 体的培养表面的底部，(ii)在使所述细胞释放或者分泌所述肿瘤标记物的条件下培养所述细胞，所述肿 瘤标记物被免疫捕获在培养表面的底部，(iii)通过洗涤除去所述细胞，
(iv)加入特异于所述肿瘤标记物的至少一种标记的缀合物，(ν)观测由此获得的标记。在肿瘤细胞中直接检测本发明方法中使用的肿瘤标记物可以在使肿瘤细胞分泌 本发明方法中使用的肿瘤标记物的条件下培养所述肿瘤细胞，之后在所述细胞的培养基中 进行检测。释放或者表达所述肿瘤标记物的培养条件是常规条件，如37°C在湿润环境及在 5% CO2 中。当生物样品是固体样品时，肿瘤标记物的存在也可以在体内、肿瘤原位示出。为了示出体内肿瘤标记物的存在，可以使用本领域技术人员已知的任何显影方 法。为此，可以将所述肿瘤标记物的结合配体与显影示踪剂结合。术语“结合配体与显影示踪剂的结合”是指能通过本领域技术人员已知的任何显 影方法检测的以及能直接或者间接产生可检测信号的示踪剂的附着。因此，所述示踪剂可 以是放射性示踪剂如锝-99。在这种情况中，具有原发癌或者转移癌的器官将结合肿瘤标记 物及其示踪剂。可以用专业相机例如-相机使该器官发射的射线成像。该设备收集由放射 性物质产生的闪烁(scintillations)，并因此可以观测该器官。在本发明另一方法中，示踪剂可包含发射正电子的放射性物质(氟18)。然后通过 正电子发射X线断层摄影系统获取图像。在本发明的另一优选方法中，肿瘤标记物的配体可以与纳米粒子结合，所述纳米 粒子可以是超磁性(supramagnetic)纳米粒子，例如用于直接细胞标记和通过核磁共振显 影的体内检测中的阴离子磁性纳米粒子。它们也可以是金纳米粒子。通过本发明的可以在体内检测肿瘤标记物的方法，可以观测到机体的结合肿瘤标 记物的结合配体的区域，产生肿瘤标记物的癌症、特别是结直肠癌，以及其远离的转移癌和 涉及的淋巴结。本发明的方法可用于结直肠癌的早期诊断及筛查、治疗随诊、预后和复发诊断，因 为仅癌细胞分泌PDI，且这种产生依赖于癌症的阶段，所述方法构成本发明的另一主题。此外，本申请书中描述的具有序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3的 表位是新的表位，构成本发明另一主题。本发明通过如下实施例以及附

图1-22得以更清晰地理解，所述实施例只是举例 说明本发明而无限制本发明之意，其中-图1是通过ELISA测定PDI(Al)、PDI A3和PDI A6的示意图，提供信号(OD)与 PDI (Al)、PDI A3 和 PDI A6 的浓度(ng/ml)相关。-图2是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中PDI (ng/ml)的图示。-图3是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中LEI (ng/ml)的图示。-图4是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中埃兹蛋白(ng/ml)的图示。-图5是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中酰化氨基酸水解酶1 (ng/ml)的图示。
-图6是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中L-FABP(ng/ml)的图示。-图7是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中I-FABP(pg/ml)的图示。-图8是关于通过微量培养板ELISA(图8A)或者使用LincopIex试剂盒(图8B) 经ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清中载脂蛋白AI ( μ g/ ml)的图示。-图9是使用Lincomultiplex试剂盒测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个 体(CRC-)的血清中载脂蛋白AII (μ g/ml)的图示。-图10是通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的血清 中I-丝束蛋白(RFV，相对荧光值)的图示。-图11是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中β 2-微球蛋白(ng/ml)的图示。-图12是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中CEA(ng/ml)的图示。-图13是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中CA 19-9 (U/ml)的图示。-图14是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中睾酮(ng/ml)的图示。-图15是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中E-钙粘蛋白(ng/ml)的图示。-图16是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中PAPl (ng/ml)的图示。-图17是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中半乳凝集素-3 (RFVl)的图示。-图18是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中LDH(ng/ml)的图示。-图19是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 血清中蛋白酶体20S(ng/ml)的图示。-图20是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 粪便中酰化氨基酸水解酶1 (ng/ml)的图示。-图21是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 粪便中半乳凝集素-3 (RFV)的图示。-图22是关于通过ELISA测定患有结直肠癌的患者(CRC+)及健康个体(CRC-)的 粪便中蛋白酶体20S(RFV)的图示。-图23通过ELISP0T测定LEI、埃兹蛋白和半乳凝集素_3的示意图，单位是斑点 数目/IO6个Caco-2、HT-29和Η ^9_Β6细胞系的癌细胞。实施例1 编码肿瘤标记物的基因的克隆及重组蛋白的表达1. cDNA扩增和克隆
Caco-2结直肠癌细胞系在不含FCS (胎牛血清)但含有2mM L-谷氨酰胺的DMEM 培养基(均Gibco)中培养。为克隆LEI、L-FABP 和 Gal_3 基因，用 Invitrogen FastTrack 2. O 试剂盒(Cat. No. 45-0019)根据厂商方案从108Caco-2细胞的沉淀中提取信使RNA。用Superscript III One Step RT-PCR System试剂盒(Invitrogen Cat. No. 12574-018)使用 Platinum Taq DNA 聚合酶根据厂商方案用450ng Cac0-2mRNA在单个步骤中进行逆转录和PCR步骤。用于基 因扩增的PCR引物在表1中给出。表权利要求
1.一种体外诊断结直肠癌的方法，特征在于使用针对蛋白质二硫化物异构酶(PDI)表 位的至少一种抗PDI单克隆抗体确定取自怀疑患有结直肠癌的患者的生物样品中PDI标记 物的存在，所述PDI表位选自SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三维结构中与之接近 的芳族氨基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表位。
2.权利要求1的方法，特征在于所述生物样品是远离肿瘤的样品。
3.权利要求1或2的方法，特征在于使用针对序列SEQID No. 3所示表位的至少一种 抗PDI单克隆抗体，以及针对PDI表位的至少一种其它单克隆抗体，所述PDI表位选自序列 SEQ ID No. 1、以及SEQ ID No. 2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸。
4.权利要求3的方法，特征在于使用针对SEQID No. 1所示表位的至少一种抗PDI单 克隆抗体以及针对SEQ ID No. 3所示表位的至少一种其它抗体。
5.权利要求1-4任一项的方法，特征在于其还包括确定选自如下标记物的至少一种其 它肿瘤标记物的存在白细胞弹性蛋白酶抑制剂、埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪 酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白。
6.权利要求1-5任一项的方法，特征在于其还包括确定至少一种其它肿瘤标记物的存 在，所述其它肿瘤标记物选自如下标记物β 2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝集素-3、 L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关的钙信号转导蛋白1、角蛋 白类型II细胞骨架8、角蛋白类型I细胞骨架18、角蛋白类型I细胞骨架19、上皮钙粘蛋白、 CEA、绒毛蛋白、CA19-9、CA 242,CA 50,CA 72-2、睾酮、TIMP-l、Cripto_l、Intelectin-1、细 胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、(前)防御素-A5 ；血液中甲基化DNA的检测，优选AXL4 基因的甲基化DNA或者kptin-9基因的甲基化DNA的检测；粪便DNA片段中特异性改变的 检测，如粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变；以及粪便人血红 蛋白的检测。
7.权利要求1-6任一项的方法在结直肠癌早期诊断、筛查、治疗随诊、预后以及复发诊 断中的应用。
8.序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 或者 SEQ ID No. 3 所示的表位。
9.抗-PDI抗体，其特异性结合权利要求8的表位。
全文摘要
本发明涉及体外诊断结直肠癌的方法，特征在于使用针对PDI表位的至少一种抗PDI单克隆抗体确定取自怀疑患有结直肠癌的患者的生物样品中蛋白质二硫化物异构酶肿瘤标记物的存在，所述PDI表位选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和在PDI的三维结构中与之接近的芳族氨基酸、以及SEQ ID No.3所示的表位。所述方法可用于对结直肠癌进行早期诊断、筛查、治疗随诊和预后，以及与结直肠癌相关的复发诊断。
文档编号G01N33/574GK102089663SQ200980126924
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月9日 优先权日2008年7月10日
发明者C·博利厄, D·罗兰, G·肖凯-卡斯蒂勒夫斯基, J-P·沙里耶, S·比瑟雷特, Y·阿塔曼-厄纳尔 申请人:生物梅里埃公司