专利名称：硫化物醌氧化还原酶基因载体构建及其转基因工程乳酸菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫化物醌氧化还原酶基因载体(pMG36e-SQR-Myc)构建及其转基因工程乳酸菌菌株，属于生物技术领域。该转SQR基因工程菌可导入畜禽肠道内定居，以降低肠道粪便中硫化物废气的产生与排放，减少环境污染。ニ背景技术：
随着畜牧产业的快速发展，养殖场规模的不断扩大，畜禽(猪、鸡、牛等)粪便产生的废气(H2S等硫化物)已经成为不容忽视的空气污染源，如何使这些废气无害化是保证环境友好型养殖业健康发展的必要条件之一。然而，目前采用堆放发酵、沼气化、吸附、焚烧以及除臭剂等常规方法可一定程度上降低废气对环境的污染，还不能做到无害化。所以探求ー种废气无害化处理技术途径非常必要。硫化物-醌氧化还原酶(Sul de-Quinone Reductase，SQR)广泛存在于光营养和化学营养細菌中(绿菌属、荚膜杆菌属、着色菌属等)，它是一条57-kDa的多肽，能够分解 H2S等硫化物。1997年，ShUtz等从红荚膜杆菌中分离纯化出SQR，并将SQR基因成功克隆于大肠杆菌，结果显示，大肠杆菌表达的SQR具有生物酶活性。近十余年来，国内外科学家对 SQR基因的序列结构及其降解硫化物的生物功能进行了系统的研究，取得显著进展，其特殊生物功能的利用前景已初见端倪。但目前为止尚未开展有关利用SQR用于降低畜禽粪便中硫化物排放的研究。乳酸菌是宿主(人和动物)肠道中重要的益生菌群之一，对调节维持肠道微生态平衡，促进摄入养分的消化、吸收利用，維持宿主健康状态等具有非常有益的作用。随着乳酸菌的各种表达调控元件的成功分离，使得乳酸菌成为较理想的转基因工程受体菌。pMG36e 是常用于乳酸乳球菌的一种表达型质粒载体，该质粒大小为361Λ，含红霉素抗性基因、p32 启动子、多克隆位点和Prtp转录终止子。Guchte和Brurberg等以此为载体已在乳酸菌中成功表达溶菌酶和几丁质酶等外源基因产物。赵莹等成功获得了酸性纤维素酶转基因乳酸杆菌菌株；赵丹等则获得了转鸡球虫基因的乳酸杆菌。目前，转基因乳酸杆菌研究已见诸于动物营养和动物疾病防治等领域，但尚未涉及于应用转SQR基因乳酸菌降低动物肠道粪便中废气产生于排放，减少环境废气污染相关领域的研究。SQR能够降解等硫化物的生物功能已经得到肯定，但是通过转基因乳酸菌表达的SQR降解H2S等硫化物这一新途径降低畜禽粪便中的硫化物排放，尚需解决诸种技术问题，如构建出适宜的SQR基因乳酸菌表达质粒，该质粒经转化整合在乳酸菌基因组中及其传代过程中稳定遗传以及SQR能否在乳酸菌中高效表达等，这些技术环节必须在开展SQR 转基因乳酸菌微生态制剂的研究及用于活体动物实验之前得到有效解决。针对上述技术环节问题，本发明构建出SQR基因的乳酸菌表达质粒pMG36e-SQR，经电转化方法感染乳酸菌工程菌，鉴定和筛选出高效稳定表达SQR的乳酸菌菌株，并经反复传代、建系。为进ー步开展SQR转基因乳酸菌微生态制剂的研制，有效解决畜禽养殖过程中H2S等硫化物环境污染难题提供必要的实验材料和关键技术支撑。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供表达SQR蛋白的重组载体pMG36e-SQR构建方法及其转基因乳酸菌工程菌株制备技木，最终获得的转基因乳酸菌株可稳定、高效地表达SQR。技术方案
表达SQR蛋白的乳酸菌，是通过以下方法生产的，包括 (一)乳酸菌SQR蛋白表达载体pMG36e-SQR的构建 1. pMG36e-SQR-Myc载体构建及其鉴定
本发明SQR基因载体pMG36e-SQR-Myc的构建选用pcDNA3. I-SQR-Myc (图1)真核表达质粒为最初原材料，首先，利用限制性内切酶Kpn I和)(ba I将SQR目的基因连同Myc标记基因(即SQR-Myc)从pcDNA3. I-SQR-Myc载体上酶切下来，回收SQR-Myc基因片段，采用T4 连接酶将其连接于pMG36e载体(图2)相应的酶切位点，构建成pMG36e-SQR-Myc (图3)原核表达载体。将转化子利用KCM转化法导入大肠杆菌DH5 α中，在含有红霉素的LB培养基上筛选、鉴定出阳性转化子。2.含SQR基因的重组质粒鉴定
为确认转化子的阳性，必须对重组质粒pMG36e-SQR-Myc进行PCR法和双酶切法鉴定。 在KCM法转化大肠杆菌后接种的固体培养基上分別挑取白色菌落，接种至LB培养基中培养，碱裂解法少量提取质粒，经双酶切鉴定目的基因SQR和标记基因Myc连接于pMG36e的相应位点(见图4)。以质粒为模板，P1、P2为引物进行扩増，鉴定阳性重组质粒。引物Pl TCGTCACCAAGGACCCGATGTAT, P2 TCACGGCCTTCAGCTTGTCG，反应条件为 94°C，预变性 5min， 94°C变性10s，51°C退火30s，72°C延伸80s，共30个循环，72°C延伸lOmin，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测出该重组质粒含有SQR基因(图5)。(ニ)乳酸乳球菌MG1363的电转化 1.乳酸乳球菌MG1363感受态的制备
接种MG1363于GM17培养基中，30で培养过夜，按5%接种量接种于含1%甘氨酸的高渗GM17培养基(SGM17)至OD值为0. 2^0. 8，培养结束后将细菌培养物冰浴lOmin，离心收集菌体，冰冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体3次，最后采用菌液体积的1/100的电击缓冲液重思菌体。2.电穿孔法转化MG1363
质粒pMG36e-SQR-Myc与上述感受态MG1363混合，冰浴lOmin，电击。电转參数如下电压2000 V，电容25 μ F，电阻400 Ω。30°C复苏培养3 h后，将其涂布在含有10 μ g/ mL 的红霉素GM17平板上，培养2 3 d，获得阳性转化子菌落。(三)SQR在乳酸乳球菌MG1363中的表达
取阳性乳酸菌菌株，接种于5mL液体GM17培养基中，过夜培养，收集菌体，用双蒸水洗2次，加入终浓度lOmg/mL溶菌酶100 μ 1，37°C消化30min，加等量的上样缓冲液，100 °C 作用5 min，高速离心后用于SDS-PAGE电泳，结果显示表达产物中含有目的蛋白大小的条带(图6)。有益效果
本发明成功构建了 SQR的乳酸菌表达载体pMG36e-SQR-Myc，为了检测目的蛋白SQR的表达情況，同时将标签蛋白Myc也连入其中，并通过双酶切和PCR两种方法鉴定 pMG36e-SQR-Myc是否连接成功。获得感受态的乳酸乳球菌MG1363，并进一歩调节优化电转化參数(电压、电容等)，建立高效转化乳酸乳球菌的电转化參数条件，获得表达SQR的乳酸乳球菌菌株，SQR的表达通过SDS-PAGE电泳和^festern Blot进行检测。迄今为止已有大肠杆菌表达SQR的文献报道，但尚未见SQR在乳酸菌中的表达研究。之所以选择乳酸菌是因为乳酸菌为益生菌类，可作为ー种安全的微生态制剂直接饲喂动物，使之栖居于肠道内发挥正常生理作用，而SQR乳酸菌有望在动物肠道中发挥降解硫化物的功能，最终降低粪便中硫化物的排放。四
图1 :pcDNA3. 1(-)-SQR-Myc重组质粒示意图。图2 :pMG36e质粒图谱示意图，蓝线标注分别为)(ba I和Kpn I酶切位点。图3 :pMG36e-SQR-Myc重构质粒示意图，显示SQR-Myc的插入位置。图4 :pMG36e-SQR-Myc经过Kpn I和Xba I酶切后的电泳图。M: Marker ;1和2: pMG36e_SQR-Myc酶切后产生的目的基因条带(2个重复)。图 5 :pMG36e-SQR-Myc PCR 扩增鉴定图。M: Marker ； 1-4: pMG36e_SQR-Myc PCR 扩增产物条带(4 个重复)。图6 转基因乳酸乳球菌中表达SQR的SDS-PAGE图谱。M 蛋白 Marker ；1 阴性对照；2、3 :pMG36e-SQR-Myc_MG1363 阳性菌株，箭头标记为目的蛋白条带。图7 =SQR在乳酸菌中的表达Western检测分析。M 蛋白 Marker ；1 阴性对照；2、3 :pMG36e_SQR-Myc- MG1363 阳性菌株中提取的总蛋白，箭头所指为目的基因表达的SQR酶蛋白条带。图8 转SQR乳酸乳球菌MG1363的生长曲线图。五具体实施例方式
(一)乳酸菌SQR蛋白表达载体pMG36e-SQR-Myc的构建(图1_5) 1.主要实验材料
质粒:pcDNA3. I-SQR-Myc (于峰祥等，江苏农业学报，2011，27 (5) 1043-1046)，pMG36e 由赢润生物技术公司购买。菌种大肠杆菌DH5ci购于大连宝生物有限公司。酶及试剂限制性内切酶Kpn I和)(ba I、T4连接酶、酶切反应的缓冲液、DL5000 Marker, PCR premix均购自大连Takara公司；胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技公司；其余化学试剂为国产、进ロ分装或进ロ。2.溶液配制
培养基、试剂的配制若无特别要求，均以重蒸水为溶剤，高压灭菌条件为102. 9kPa蒸气灭菌30分钟。LB液体培养基蛋白陈10g，酵母粉5g，NaCl IOg，溶于800ml水中，调节pH值至 7. 5，定容至1000ml，高压灭菌。LB固体培养基蛋白陈10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加琼脂粉15g， 调节PH值至7. 5，定容至1000ml，高压灭菌。
红霉素配制将红霉素溶于无水乙醇中，浓储液浓度为50mg/ml，工作浓度 250μ g/ml。KCM转化法相关试剂配制 (1) TSM 液配制(IOml)
权利要求
1.硫化物醌氧化还原酶基因载体pMG36e-SQR-Myc，其构建方法包括1)pMG36e-SQR-Myc 载体构建选用pcDNA3. I-SQR-Myc真核表达质粒为最初原材料，利用限制性内切酶Kpn I和 Xba I将SQR目的基因连同Myc标记基因SQR-Myc从pcDNA3. I-SQR-Myc载体上酶切下来， 回收SQR-Myc基因片段，采用T4连接酶将其连接于pMG36e载体相应的酶切位点，构建成 pMG36e-SQR-Myc原核表达载体；利用KCM转化法导入大肠杆菌DH5 α中，在含有红霉素的 LB培养基上筛选、鉴定出阳性转化子；2)含SQR基因的重组质粒阳性鉴定分別挑取阳性转化子白色菌落进行PCR法和双酶切法鉴定接种至LB培养基中培养，碱裂解法少量提取质粒，经双酶切鉴定目的基因SQR和标记基因Myc连接于pMG36e的相应位点；以质粒为模板，根据SQR基因序列设计引物PI、P2，鉴定阳性重组质粒，引物Pl TCGTCACCAAGGACCCGATGTAT, P2 TCACGGCCTTCAGCTTGTCG，反应条件为 94°C，预变性 5min， 94°C变性10s，51°C退火30s，72°C延伸80s，共30个循环，72°C延伸lOmin，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，含有SQR基因的条带，大小为1179bp。
2.用权利要求1所述载体转化获得的转基因工程乳酸菌菌株，是由以下步骤获得的1)乳酸乳球菌MG1363感受态的制备接种MG1363于GM17培养基中，30。C培养过夜，按体积比5%接种量接种于含体积比1% 的甘氨酸的SGM17培养基至OD值为0. 2^0. 8，培养结束后将细菌培养物冰浴lOmin，离心收集菌体，冰冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体3次，最后采用菌液体积的1/100的电击缓冲液重悬菌体；2)电穿孔法转化MG1363质粒pMG36e-SQR-Myc与上述感受态MG1363混合，冰浴lOmin，电击，电转參数如下电压 2000 V，电容 25 μ F,电阻 400 Ω，300C复苏培养3 h后，将其涂布在含有10 μ g/ mL的红霉素GM17平板上，培养2 3 d，获得转基因工程乳酸菌菌株菌落。
3.权利要求2所述转基因工程乳酸菌菌株表达的硫化物醌氧化还原酶，是由以下步骤获得的取权利要求2所述转基因工程乳酸菌菌株，接种于5mL液体GM17培养基中，过夜培养，收集菌体，用双蒸水洗2次，加入终浓度lOmg/mL溶菌酶ΙΟΟμ 1，37°C消化30min，加等量的上样缓冲液，100で作用5 min，高速离心后用于SDS-PAGE电泳，结果显示表达产物中含有目的蛋白的条带，大小为53KD，即为获得的所述转基因工程乳酸菌菌株表达的硫化物醌氧化还原酶。
全文摘要
本发明涉及硫化物醌氧化还原酶基因载体(pMG36e-SQR-Myc)构建及其转基因工程乳酸菌菌株,属于生物技术领域。选用pcDNA3.1-SQR-Myc真核表达质粒为最初原材料，将SQR-Myc基因片段，连接于pMG36e载体，电转化乳酸乳球菌MG1363并得到高效稳定表达。本发明选择乳酸菌是因为乳酸菌为益生菌类，可作为一种安全的微生态制剂直接饲喂动物，使之栖居于肠道内发挥正常生理作用，而SQR乳酸菌有望在动物肠道中发挥降解硫化物的功能，最终降低粪便中硫化物的排放。
文档编号C12N1/21GK102559732SQ20121001167
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者于峰祥, 于建宁, 徐小波, 李燕, 潘伟芹, 王公金, 陈哲 申请人:江苏省农业科学院