专利名称：一种蛋白水解度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白水解度的测定方法，尤其是涉及一种乳中游离氨基氮的定量检测方法。
背景技术：
牛乳是优秀的营养食品，蛋白含量为3.0％～3.5％，其中酪蛋白(CN)含量较高，约占总蛋白的80％。酪蛋白主要有四种即αs1-、αs2-、β-、κ-CN，牛乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为80∶20，而人乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为60∶40。由于其与人乳中的蛋白组成不同，有很多人饮用了牛乳后会产生过敏现象。许多研究表明牛乳中αs-酪蛋白、β-乳球蛋白(β-LG)是最主要的过敏原，其中约82％的牛乳过敏人都对β-LG过敏，尤其是婴儿。
为了解决牛乳过敏的问题，要对牛乳蛋白进行改性研究。目前，研究热点集中在通过酶水解牛乳蛋白来降低或消除过敏原。因此开发一种准确可行的蛋白水解度测定方法具有深远的意义。
目前检测蛋白水解度的方法有很多，如邻苯二甲醛(OPA)法、茚三酮比色法、甲醛滴定法和三硝基苯磺酸(TNBS)方法等。但每种方法的适用性不同，有的显色液不稳定，且测定不同的蛋白需要不同的显色液，稍有不慎即会使结果出现偏差；有的实验步骤操作繁杂；有的实验试剂用量太大。因此研究一种适合于乳蛋白水解度测定，既稳定准确又简单快速的方法非常有意义。本发明人研发了一种新的测定蛋白水解度的方法，可以弥补现有技术中存在的不足。
发明内容
蛋白水解度(Degree of Hydrolysis，DH)的定义是指蛋白肽键裂解的百分比，通过水解后增加的游离氨基氮占总蛋白的百分比来表示。本方法适用于乳中游离氨基氮的检测和牛乳蛋白水解度的检测，也可以检测牛乳中掺入的外源水解蛋白，作为掺假的监测手段。其中蛋白水解度测定中的总氮测定采用IDF20-22001的乳中氮含量的测定方法。
本方法是通过测定水解前后乳中游离氨基氮的含量，来计算蛋白水解度的一种方法。在水解牛乳样中加入三氯乙酸(TCA)溶液使蛋白沉淀，然后过滤掉沉淀的蛋白，通过水解后在三氯乙酸(TCA)溶液中增加的游离氨基酸与TNBS反应的颜色变化来测定蛋白水解度。以甘氨酸为标准物质，在420nm处有吸收峰。本方法结果重现性好，检验耗时短，试剂用量少，可操作性高，只用分光光度计即可满足测定需求。
具体方法如下取乳样，加入2倍乳样体积的0.7N-0.8N的三氯乙酸，室温下放置20min-30min，过滤取上清液，加入10倍上清液体积的0.095M-0.15M硼酸钠，再加入4倍上清液体积的4.95mM-5.05mM TNBS，室温下暗处放置20min-30min，加入4倍上清液体积的2M混合终止剂，所述混合终止剂为包含17.95mM/L-18.05mM/L亚硫酸钠的1.95M/L-2.05M/L磷酸二氢钠，混匀，在420nm处测定吸光值。
所述硼酸钠的pH为9.0-9.4。
所述TNBS和混合终止液现用现配。
所述测定方法还包括以不同浓度的甘氨酸为标准物质绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品中游离氨基氮的含量。
所述方法测得的乳样吸光值在标准曲线浓度范围之内。
根据公式1和公式2分别计算游离氨基氮的含量和蛋白水解度。游离氨基氮的含量按下式计算C＝B□A----------------------------1其中C样品中游离氨基酸的含量，mM/L，B根据滤液的吸光度，通过标准曲线计算出的游离氨基氮的浓度，mM/L，A稀释因子。
蛋白水解度按下式计算 其中DH％蛋白肽键裂解的百分比，C1水解前样品中游离氨基氮的含量，mM/L，C2水解后样品中游离氨基氮的含量，mM/L，Pro样品中蛋白质的浓度，g/100mL，htot为每克蛋白质的肽键的豪摩尔数，htot对于某一特定蛋白质来讲是一个常数(乳清蛋白htot＝8.8(mM/g))。
附图1甘氨酸标准曲线。
具体实施例方式实施例1水解酪蛋白中的游离氨基氮的测定适当稀释样品。然后取稀释后的样品2mL，加入4mL 0.7N的TCA，20℃放置20min，过滤取上清液待测。取上清液0.2mL加入2mL 0.095M硼酸钠，0.8mL 4.95mM TNBS，20℃暗处放置30min，加入0.8mL 2M混合终止剂(所述混合终止剂为包含18mM/L亚硫酸钠的2M/L磷酸二氢钠)，混匀，同时用未水解的牛奶作对照，用蒸馏水做空白试验，在分光光度计上，用1cm直径吸收池，以空白为参比，于波长420nm测其吸光度，颜色可稳定近1h。分别移取不同浓度的甘氨酸标准溶液2mL于不同的试管中，加入4mL 0.75N的TCA，后续处理同样品分析。然后以吸光度与浓度绘制标准曲线。通过标准曲线求出样品的浓度。同一试样做两次平行，取平均值；重复测定3次。根据公式1计算游离氨基氮的含量，结果见表1。
表1水解酪蛋白水解样品游离氨基氮的测定结果单位mM/L
实施例2酶水解乳清蛋白水解度的测定适当稀释酶水解后的乳清蛋白样品。然后取稀释后的样品2mL，加入4mL 0.8N的TCA，25℃放置30min，过滤取上清液待测。取上清液0.2mL加入2mL 0.15M硼酸钠，0.8mL 5.05mM TNBS，25℃暗处放置20min，加入0.8mL 2M混合终止剂(所述混合终止剂为包含17.95mM/L亚硫酸钠的2.05M/L磷酸二氢钠)，混匀，同时用未水解的牛奶作对照，用蒸馏水做空白试验，在分光光度计上，用1cm直径吸收池，以空白为参比，于波长420nm测其吸光度，颜色可稳定近1h。分别移取不同浓度的甘氨酸标准溶液2mL于不同的试管中，加入4mL 0.75N的TCA，后续处理同样品分析。然后以吸光度与浓度绘制标准曲线。通过标准曲线求出样品的浓度。同一试样做两次平行测定。根据公式1和公式2分别计算游离氨基氮的含量和蛋白水解度，结果见表2和表3。
表2酶水解乳清蛋白样品游离氨基氮及水解度的测定结果
表3酶水解乳清蛋白样品水解度的测定结果的分析表
实施例3水解酪蛋白中的游离氨基氮的测定适当稀释样品。然后取稀释后的样品2mL，加入4mL 0.75N的TCA，22℃放置20min，过滤取上清液待测。取上清液0.2mL加入2mL 0.1M硼酸钠，0.8mL 5mMTNBS，22℃暗处放置30min，加入0.8mL 2M混合终止剂(所述混合终止剂为包含18mM/L亚硫酸钠的2M/L磷酸二氢钠)，混匀，同时用未水解的牛奶作对照，用蒸馏水做空白试验，在分光光度计上，用1cm直径吸收池，以空白为参比，于波长420nm测其吸光度，颜色可稳定近1h。分别移取不同浓度的甘氨酸标准溶液2mL于不同的试管中，加入4mL 0.75N的TCA，后续处理同样品分析。然后以吸光度与浓度绘制标准曲线。通过标准曲线求出样品的浓度。同一试样做两次平行测定，取平均值；重复测定3次。根据公式1计算游离氨基氮的含量，结果见表4。
表4水解酪蛋白水解样品游离氨基氮的测定结果单位mM/L
权利要求
1.一种蛋白水解度的测定方法，其特征在于取乳样，加入2倍乳样体积的0.7N-0.8N的三氯乙酸，室温下放置20min-30min，过滤取上清液，加入10倍上清液体积的0.095M-0.15M硼酸钠，再加入4倍上清液体积的4.95mM-5.05mM TNBS，室温下暗处放置20min-30min，加入4倍上清液体积的2M混合终止剂，所述混合终止剂为包含17.95mM/L-18.05mM/L亚硫酸钠的1.95M/L-2.05M/L磷酸二氢钠，混匀，在420nm处测定吸光值。
2.权利要求1所述的测定方法，其中所述硼酸钠的pH为9.0-9.4。
3.权利要求1所述的测定方法，其中所述TNBS和混合终止液现用现配。
4.权利要求1-3任一项所述的测定方法，其中还包括以不同浓度的甘氨酸为标准物质绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品中游离氨基氮的含量。
5.权利要求4所述的测定方法，乳样测得的吸光值在标准曲线浓度范围之内。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白水解度的测定方法。本方法是通过测定水解前后乳中游离氨基氮的含量，来计算蛋白水解度的一种方法。在水解牛乳样中加入三氯乙酸(TCA)溶液使蛋白沉淀，然后过滤掉沉淀的蛋白，通过水解后在三氯乙酸(TCA)溶液中增加的游离氨基酸与TNBS反应的颜色变化来测定蛋白水解度。本方法操作简便，可省时、增效。
文档编号G01N21/31GK1987470SQ200610156368
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月31日 优先权日2006年12月31日
发明者王彩云, 云战友, 李翠枝 申请人:内蒙古伊利实业集团股份有限公司