专利名称：盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA序列、其编码蛋白及其全长基因序列和克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种盐藻("w朋/zW/" v/nVfo)中26S蛋白酶体亚基RPN10基因 (Z)v及P;WO)的cDNA序列、其编码蛋白以及全长基因序列和克隆方法。
背景技术：
盐藻，又叫杜氏藻，它是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是已知的最耐盐的真 核生物。同时，它对光照、环境pH、温度等变化造成的胁迫也能够很好的耐受。因 而被广泛的用来研究植物对各种胁迫的反应机制，特别是耐盐胁迫的机制。
泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径(ubiquitin/26S proteasome pathway)是真核细 胞中蛋白质的选择性降解中一种非常重要的机制。因其高效的降解细胞内蛋白的能 力，参与了真核细胞调控的各个方面。在众多26S蛋白酶体亚基中，研究最多就要数 RPN10 了。最初，人们被发现它在体内能够与多聚泛素链结合。并且由于其特异地 识别与那些结合有泛素链的蛋白，它被认为是26S蛋白酶体中主要的泛素蛋白受体。 但是后来证明酵母^r;w/0菌株仍然可以正常生长，只不过对氨基酸类似物比较敏感， 这就说明RPN10并不是泛素/26S蛋白酶体途径中唯一的泛素受体且在蛋白降解的过 程中起到了加强底物特异性的作用。研究发现在其C末端附近有一段疏水区域能与 泛素结合被称为泛素互作基序(UIM)。出乎人们的意料之外，在氨基酸类似物胁迫 实验中，这段结构域的缺失并未对酵母的生长产生影响，说明存在其他的结构域参与 识别泛素链的功能。在拟南芥的研究中发现，RPN10在ABA信号传导中起到底物特 异性的功能。
此外，RPN10还参与了26S蛋白酶体调控区域的结构稳定。在酵母的研究中， RPN10的突变使得蛋白酶体的盖部和基底部在体内易于解离。这说明RPN10参与了 两个亚基符合体的联接。研究发现RPN10的N末端存在一个在位置上保守的天冬氨 酸(Asp-ll)对蛋白酶体的稳定起到了关键的作用。该氨基酸位于N端与保守结构域 von Willebrand factor A相关的150个氨基酸区域内。von Willebrand factor A结构域可 能也有助于盖部和基底部的联接。
另外，RPN10的功能还可能与其能够结合一系列蛋白有关，包括DSK2和DNA 修复蛋白RAD23等。这些蛋白的特征是具有UBL结构域的N末端和泛素结合结构 域的C末端。由于UIM和UBI结构域的相互作用，RPN10可能与RAD23/DSK2结 合，参与引导泛素化底物进入26S蛋白酶体。
许多研究表明泛素/26S蛋白酶体途径参与了多种环境胁迫和激素的应答。比如， 在拟南芥的研究中，Smalle等发现RPN12与细胞分裂数的生长应答有关，参与了稳 定了一个或多个细胞分裂素调控因子；而RPN10可能参与了底物专一性功能，在调 节脱落酸信号传到的过程中起到了十分重要的作用。此夕卜，RPN10还是P/^cwm'加/to 生长发育所必须的。在盐藻和水稻的蛋白组学的研究中人们发现在高渗的环 境下，26S蛋白酶体调控亚基的表达有所上调，这就说明蛋白酶体调控体系在调节渗 透胁迫信号传到的过程中起重要作用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因(Dv及尸A70) 全长编码区序列。
本发明的目的之二在于提供该序列编码的氨基酸序列。
本发明的目的之三在于提供盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因(DW 尸JWO) 的全长基因序列。
本发明的目的之四在于提供该Dv及PiWO基因的克隆方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA序列，其特征在于该序列具
有SEQ NO 1所示的碱基序列。
上述的cDNA序列编码的蛋白，其特征在于具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。
一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因序列，其特征在于具有SEQ NO
3所示的碱基序列。
上述的盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因序列的克隆方法，其特征在 于该方法具有如下步骤
a. 利用限制性内切酶I/ATzo I消化含有Dv及PA^0的盐藻EST文库质粒释放 出目的片段，获得26S蛋白酶体亚基RPN10基因全长cDNA序列；
b. 根据上述的cDNA序列设计引物筛选藻基因组BAC文库，得到盐藻26S蛋白
酶体亚基RPN10基因的基因组BAC克隆，利用QIAGEN公司的 Large-Construct Kit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经 机械破碎后，回收大小在2 4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪 文库；所述的引物序列为
RPN10P4a: 5' ACATCGAGGGCGAGTCCAAC 3' RP画P4b: 5' TGTGCAGCAGTGCATAAGAGC 3'
c. 大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定；
每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。共测序480个鸟枪文库 质粒，即5块96孔板
d. 将上述的480个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计
算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以 填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列；通过与其 cDNA序列的比对，在该连续的盐藻基因组序列中，获得盐藻26S蛋白酶体亚 基RPN10基因的全长基因序列。 盐藻是迄今发现的最耐盐的真核生物之一。其极强的耐盐能力及简单的细胞结 构使盐藻成为研究植物适应盐胁迫的分子机制的重要模式生物。如今盐胁迫是影响农 作物产量的重要因素之一，为了解植物耐盐机制，提高作物耐盐性，对盐藻盐适应机 制的研究已成为目前国际上植物耐盐研究的一个热点。泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解 途径是真核细胞中一种非常重要的选择性蛋白质降解机制，因其高效的降解细胞内异 常蛋白的能力，参与了真核细胞调控的各个方面。本发明提供了盐藻26S蛋白酶体 RPN10亚基完整的编码序列，并采用实时荧光定量PCR的方法发现了盐藻RPN10 受盐胁迫诱导的表达特性。RPN10在细胞内具有多方面的功能，参与并增加了底物 蛋白的专一性识别，稳定26S蛋白酶体整体结构和结合泛素化的蛋白。盐藻细胞在高 盐胁迫下产生大量异常蛋白，如果这些蛋白积累过量将会影响细胞的正常生理活动。 DW^/W川的上升表达有助于专一性地识别这些蛋白，从而降低这些蛋白的胞内含量， 维持细胞正常的生理环境，对于盐藻的抗盐机制具有十分重要的意义。因此，本发明 提供的关于盐藻RPN10亚基基因的研究对揭示盐藻细胞内泛素/26S蛋白酶体蛋白质 降解途径及其耐盐机制，具有一定的理论。此外，本发明提供了盐藻26S蛋白酶体 RPN10的基因组序列，为进一步研究该基因的表达调控并将其用于抗盐植物的改良
奠定了基础，具有一定的实际应用价值。
图1为本发明的盐藻Dv/ 尸A70基因在酵母力r/7w70突变体中功能互补的结果。 图2为生长于不同盐浓度下，本发明的盐藻DW 尸iV70基因转录水平的实时荧光 定量PCR分析结果
图3为盐诱导下，本发明的盐藻Dvi 户A70基因转录水平的实时荧光定量PCR 分析结果。
图4为本发明的盐藻DW^A70基因的基因结构。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按 照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rded.)或植物分子 生物学一实验手册(Plant Molecular Biology—A Laboratory Manual, Melody S. Clark 编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的 条件。
实施例一i)vl PA70全长编码区序列的克隆与分析
本实验所克隆的基因Z)v/ PW川源于盐藻EST文库。利用限制性内切酶(五coi I/ATw I)消化含有DW 尸A^0的盐藻EST文库质粒释放出目的片段并用于以后的实验。 经测序分析，Dvi^iVM最长cDNA片段为1486bp，含有绿藻基因特异的加尾信号 TGTAA及poly(A)结构。Vector NTI软件的分析结果显示，Dv及iW70最长读码框编码 了一个含377个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为39.4 kDa，等电点是4.43，可见 DW /W^所编码的蛋白为偏酸性蛋白。
实施例二 i)v及尸A7fl基因序列的测序及拼接
通过筛选盐藻BAC文库，得到含有DW 尸A70基因的BAC克隆。利用QIAGEN 公司的Large-Construct Kit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经 机械破碎后，回收大小在2 4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪文库。
大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定。每 个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。共测序480个鸟枪文库质粒，即 5块96孔板。
在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测
序列。构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，最终获得DW PA7( 全长基 因组序列。通过与其编码区序列的比较，得出其基因结构，参见图4。
实施例三"vi /WM的功能鉴定
为了鉴定Z)vi 户A^O的生理功能，本发明做了以下验证。
将Z)W /W^的全长编码区序列连接到酵母表达载体pAJ401 ，再转化酵母突变体。 由于酵母RPN10基因的突变，使得酵母突变体对氨基酸类似物敏感，不能在含有 6ug/ml刀豆氮酸(精氨酸类似物)的培养基中生长。但转化DW 尸AA70的酵母突变体 仍然对刀豆氨酸敏感，参见图1中的A和B。分析盐藻编码序列的密码子使用频率， 发现盐藻和酵母之间存在巨大的密码子使用偏好。为了消除或减弱盐藻基因翻译过程 中的密码子偏好，对酵母tRNA基因进行了克隆和修改，将反义密码子为"CCT"酵 母tRNA (Arg)基因改为"GCG"和"CCG"。
根据GENEBANK中反义密码子为"CCT"酵母tRNA (Arg)基因序列设计克隆 及修改所需引物
tR(CCU-GCG)J(F)(+): 5' -agtcgacttgatttccatcgtgtaagtttt-3 ， 5""/1 tR(CCU-GCG)J(F)(-): 5，-tctcctt￡g￡agggagacgcgttaccatta-3 ， tR(CCU-GCG)J(L)(+): 5 ， -tctccctg￡gaaggagaagactgcgggttc-3 ， tR(CCU-GCG)J(L)(-): 5'陽agtcgaccaactagttattaccactgtggcac陽3 ， &/1 tR(CCU-CCG)J(F)(+): 5 ， -aeaattcttgatttccatcgtgtaagtttt-3 ， ￡coi I tR(CCU-CCG)J(F)(-): 5 ， -tctcctt￡ggagggagacgcgttaccatta-3 ， tR(CCU-CCG)J(L)(+): 5 ， -tctccct￡￡gaaggagaagactgcgggttc-3 ， tR(CCU-CCG)J(L)(-): 5' -agaattccaactagttattaccactgtggcac-3'五coi I 在两个tRNA基因的帮助下，转化了 Z)vi /W70的突变体酵母能够在有6ug/ml刀 豆氨酸(精氨酸类似物)的培养基中生长，参见图1中的C和D。这说明1、 Dvi^iVM 能够部分恢复酵母突变体的功能缺失。2、经修改的两个tRNA有助于缓解盐藻与酵 母的密码子偏好，在DW 尸A^( 的酵母中表达起到了十分重要的作用。 实施例四DW 尸7VM在不同盐浓度及3M盐诱导下的表达 参见图2，对于不同稳态盐浓度下的Z)vi PiV70的研究，我们将盐藻细胞在含0.5、 1M、 2M、 3M、 4M和5MNaCl的盐藻培养基中进行培养，在2xl06 cell/ml的时候收 集细胞，分别提取盐藻细胞总RNA。上述RNA样品经DNaseI消化后，在反转录酶 的作用下反转成cDNA，稀释10倍后作为各个实验条件的realtime PCR的模板。PCR引物 RPN10P7a: 5，一ACCCTCGTCAAGATAGCCAAGA—3， RP画P7b: 5，一AGCCGATGAGCACATCAGACAG—3' DvActinRT+: 5'—GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC—3' DvActinRT-: 5'—CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA—3' Dvi PA70和DMC77iV的文库质粒经纯化和定量后，按照10倍梯度稀释作为定 量PCR的标准曲线，""C77tV的转录量作为内参。基因Z)W 户A^0的转录变化数据 以其在模板中的拷贝数与Ih^C77iV的拷贝数的比值来作图展示。(见图2)
由于Z^i PW70的转录在1M-3M的盐浓度变化中上升了大约3倍，为经一步了 解DW 户iVM受盐诱导的转录情况，我们对该基因在高盐振荡下的转录进行了研究。 我们将生长在1MNaCl的盐藻(2xl06cell/ml)转移至含有3.0MNaCl的新鲜盐藻培 养基中继续培养，分别在含有3.0M NaCl的新鲜盐藻培养基中继续培养0小时、12 小时、24小时、36小时、48小时、60小时、和72小时，然后提取盐藻细胞总RNA。 然后以相同的方法检测i)vi i^V70的转录变化。(见图3)
由上述实验可知，Dvi 尸A^0在0.5M至3M盐浓度范围内，受盐诱导表达，高 盐浓度下其表达量约是低盐浓度下的3倍，且在3M盐诱导36小时后其表达量开始 上升。因此推测其可能参与了盐藻抗盐胁迫晚期的某些重要生理活动。 序歹U表
<110> 上海大学
<120>盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA序列、其编码蛋白及其全长基因 序列和克隆方法
<160> 3
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<211> 1486
<212> DNA
<213> 盐藻v/Wtfo)
<400> 1
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Asn Gly Asp Tyr Val Pro Thr Arg Tyr lie Ser Gin Thr Asp Ala Ala 20 25 30
Asn Leu Leu Ala Gly Ala Lys Thr Gin Ala His Pro Glu Asn Thr Val 35 40 45
Gly Val Leu Thr Met Ala Gly Lys Met Pro Gin Val Leu Val Thr Pro 50 55 60
Thr Gin Asp Leu Gly Arg Val Leu Asn Cys Met Thr Glu lie Asp lie 65 70 75
Glu Gly Glu Ser Asn Phe Ser Ala Ala Val Gin lie Ala Gin Leu Ala 80 85 90 95
Leu Lys His Arg Gin Asn Lys Asn Gin Arg Gin Arg Val Val lie Phe 100 105 110
Val Ala Ser Pro lie Lys Glu Asp Arg Asp Thr Leu Val Lys lie Ala 115 120 125Lys Lys Leu Lys Lys Asn Ser Val Ala Val Asp Val Val Ser Phe Gly 130 135 140
Cys Glu Ala Asp Asn Asp Glu Lys Leu Ala Ala Phe Asn Glu Ala Val 145 150 155
Asn Ser Asn Asn Asn Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Pro Val 160 165 170 175
Leu Ser Asp Val Leu He Gly Ser Pro lie Phe Gin Gly Glu Gly Gly 180 185 190
Asp Phe Gly Gly Gly Gly Ala Glu Gly Gly Ala Pro Phe Glu Phe Gly 195 200 205
Val Asp Pro Asn Met Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser 210 215 220
Leu Glu Glu Glu Arg Ala Arg Gin Asn Thr Thr Glu Gly Gly Ala Pro 225 230 235
Ala Ala Gly Ala Glu Gly Ala Gly Pro Ser Gly Ala Gin Pro Ala Ala 240 245 250 255
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Gly Lys Pro Ala Gin Pro Ser Ala Ala Gly Gly Gly Glu Gly Met Asp 275 280 285
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Val Ser Gin Gin Gin Pro Gin Gin Gin Ala Gin Gin Gin Gin Gin Gin 320 325 330 335
Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gly Asp Ser Asn Met Phe Asp Asn Val 340 345 350
Glu Asp Glu Glu Leu Arg Lys Ala Leu Ser Met Ser Met Gin Asp Ser 355 360 365
Glu Ala Lys Asp Lys Asp Ser Ser Lys 370 375
<210> 3 <211> 5409 <212> DNA
<213> 盐藻(￡)w2af//e〃a v/〃Vfo)
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<222〉 (557)...(1246)
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<220>
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<400> 3
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权利要求
1.一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA序列，其特征在于该序列具有SEQ NO 1所示的碱基序列。
2. —种根据权利要求l所述的cDNA序列编码的蛋白，其特征在于具有SEQN0 2所 示的氨基酸序列。
3. —种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因序列，其特征在于具有SEQ NO 3所示的碱基序列。
4. 一种根据权利要求3所述的盐藻26S蛋白酶体亚基RPNIO基因的全长基因序列 的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤a. 利用限制性内切酶&oi I消化含有Dvi 户A^0的盐藻EST文库质粒释放 出目的片段，获得26S蛋白酶体亚基RPNIO基因全长cDNA序列；b. 根据上述的cDNA序列设计引物筛选藻基因组BAC文库，得到盐藻26S蛋白 酶体亚基RPNIO基因的基因组BAC克隆，利用QIAGEN公司的 Large-Construct Kit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经 机械破碎后，回收大小在2 4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪 文库；所述的引物序列为RPN10P4a: 5' ACATCGAGGGCGAGTCCAAC 3' RPN10P4b: 5' TGTGCAGCAGTGCATAAGAGC 3'c. 大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE4500上进行序列的测定； 每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。共测序480个鸟枪文库 质粒，即5块96孔板d. 将上述的480个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计 算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以 填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列；通过与其 cDNA序列的比对，在该连续的盐藻基因组序列中，获得盐藻26S蛋白酶体亚 基RPN10基因的全长基因序列。
全文摘要
本发明涉及一种盐藻(Dunaliella viridis)中26S蛋白酶体亚基RPN10基因(DvRPN10)的cDNA序列、其编码蛋白以及全长基因序列和克隆方法。本发明提供的关于盐藻RPN10亚基基因的研究对揭示盐藻细胞内泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径及其耐盐机制，具有一定的理论意义。此外，本发明提供了盐藻26S蛋白酶体RPN10的基因组序列，为进一步研究该基因的表达调控并将其用于抗盐植物的改良奠定了基础，具有一定的实际应用价值。
文档编号C07K14/405GK101096677SQ20071004119
公开日2008年1月2日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者孙晓斌, 孟祥宗, 宋任涛, 许政暟 申请人:上海大学