一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领 域。
【背景技术】
[0002] 角蛋白酶（Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和 细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有 嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致 疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白（Prion)的降解。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研宄价 值，但是从野生菌中筛选出的角蛋白酶热稳定性差，底物专一性不高，大大降低了角蛋白酶 的开发和运用。目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA 基因。本发明将来自嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)BBEll_l的角蛋 白酶KerSMD进行分子改造，提高角蛋白酶对酪蛋白或羽毛的底物专一性，对角蛋白酶的规 模化生产及推广具有深远的技术指导意义。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体， 是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的第180位的丝氨酸替换成甘氨酸，或者第208 位的谷氨酸替换为丝氨酸，或者第215位的酪氨酸替换成甘氨酸或者丙氨酸或者丝氨酸或 者苯丙氨酸，或者第180位的丝氨酸替换成甘氨酸同时将第215位的酪氨酸替换成丙氨酸 或者丝氨酸。
[0004] 在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第180位丝氨酸替换成甘氨 酸的S180G。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第208位谷氨酸替换为丝氨 酸的E208S。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶突变体为第215位酪氨酸替换成甘氨 酸或者丝氨酸或者丙氨酸的Y215G、Y215S、Y215A。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶组合突变体为第180位丝氨酸替换成 甘氨酸和215位的酪氨酸替换成丙氨酸的S180G/Y215A。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶组合突变体为第180位丝氨酸替换成 甘氨酸和215位的酪氨酸替换成丝氨酸S180G/Y215S。
[0010] 本发明要解决的第二个技术问题是提供获得所述角蛋白酶突变体的方法，具体步 骤如下：
[0011] (1)根据从嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)BBEll_l 中获得 编码角蛋白酶KerSMD基因，克隆到pET22b (+)中，构建重组质粒pET22b+kerSMD ;
[0012] (2)采用滚环PCR的方法，设计中间含有突变氨基酸代表的密码子碱基的互补引 物，PCR扩增质粒pET22b+kerSMD得到含有编码角蛋白酶突变体的基因序列的开环重组载 体；
[0013] (3)将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突 变的原来质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌JM109,挑取正确复制子，并提取正确突变 质粒；
[0014] (4)将正确的重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白 酶突变体粗酶液。
[0015] 所述方法还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和HisTrap FF crude Iml的镍柱对 角蛋白酶进行纯化。
[0016] 将所述方法中步骤（4)获得的重组菌在含有100 μ g/L的氨苄青霉素的LB培养基 中37 °C液体培养过夜，后接入含有100 μ g/L的氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37 °C培养 至OD6tltl= 0. 6,降温至20°C培养，加入最终浓度0.1 mM的诱导剂IPTG诱导，72h时离心获得 上清酶液，即为粗酶液。
[0017] 通过对对选定位点的定点突变以及组合突变，本发明所得角蛋白酶突变体对酪蛋 白或羽毛的底物特异性明显增强，突变体S180G、E208S、Y215S、Y215A、S180G/Y215A对羽毛 底物的特异性提高，突变体Y215G、S180G/Y215S对酪蛋白底物的特异性提高。且部分角蛋 白酶突变体热稳定性显著提高，角蛋白酶酶活显著提高，比酶活也得到提升。对比原始角蛋 白酶，突变体E208S和Y215S，以及组合突变体S180G/Y215S最适反应温度从原来的50°C提 升到60°C，并且孵育90min酶活损失不到35%。本发明提供的角蛋白酶突变体在40-70°C、 pH9. 0下与不溶性角蛋白底物反应，能够很好的水解羽毛粉、羊毛，在洗涤、皮革纺织、饲料 消化、医药等领域具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1角蛋白酶KerSMD同源性模拟结构示意图。A :角蛋白酶KerSMD的卡片结构及 三角催化中心（D42，H105，S289)和Sl 口袋组成氨基酸残基（S180，E208，Y215，R216)。B: 角蛋白酶KerSMD的表明结构及相应氨基酸残基。
[0019] 图2构建角蛋白酶突变体质粒的滚环PCR基因操作图，其中Primer 1和2分别是 互补引物。
[0020] 图3角蛋白酶KerSMD及其突变体的SDS-PAGE电泳图。M，蛋白分子量（kDa)，所有 蛋白的分子大小接近46kDa。
[0021] 图4角蛋白酶突变体在不同温度下的酶活（A)和在60°C下孵育不同时间后的残余 酶活（B)。
[0022] 图5任意组合突变体在60°C下的角蛋白酶活性和酪蛋白酶活性。
[0023] 图6角蛋白酶KerSMD及其各种突变体的Sl 口袋模拟结构图，A :WT，B :Y215A，C : Y215S，D :Y215G，E :S180G/Y215A，F :S180G/Y215S，图中所圈出的线条示意口袋大小。
【具体实施方式】
[0024] 角蛋白酶酶活测定原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，释放出酪氨酸，通过酪氨酸与 福林酚显色，在660nm下测定吸光度值。吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。
[0025] 角蛋白酶酶活测定步骤：0.1 mL经适当稀释的酶液，加入0.1 mL的1% (w/v)羽毛 粉或不可溶性角蛋白底物（使用前和0. lmol/L的pH9. 0的Gly-NaOH缓冲液混合），在50°C 反应20min，每个反应样品中加入0. 2mLTCA反应终止蛋白沉淀剂，摇匀后10, 000r/min离 心5min，取0. 2mL上清液加入ImL的4% (w/v)Na2C03，再加入0. 2mL上海生工公司购买的 福林酚试剂（预先稀释3倍）在50°C下反应15分钟。使用0. 5cm的石英比色杯测定清液 在660nm处的吸光值。空白对照是在加入底物之前已经加入同等体积的TCA终止酶活，其 他步骤相同。酶活定义为每毫升酶液每分钟释放出多少微克酪氨酸。
[0026] 实施例1编码角蛋白酶突变体S180G的基因的构建
[0027] (1)先使用一对30bp互补引物S180G-F和S180G-R，以含有嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1 (于2011年4月3日保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏编号为CCTCC No :M 2011193)角蛋白酶基因 kerSMD的质粒pET22b+kerSMD为 模版，进行滚环PCR扩增如图1。反应条件为：95°C预变性5min后进入一下循环：98°C变性 1〇8,55°0退火1〇8,72°0延伸7!1^115〇8，15个循环 ；72°0延伸1〇1^11，然后再降温到12°〇得 到最终反应液。使用的DNA扩增酶为TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方参照产品说明 书。
[0028] (2)将扩增后的PCR产物用Dpn I处理，消化模板。
[0029] (3)将消化液直接进行转化感受态大肠杆菌JM109,转化产物涂布含100mg/L氨苄 青霉素的LB平板，37°C培养过夜，挑取单菌落验证，将此质粒进行序列测定。选择正确的测 序结果即为我们所需要的重组质粒。
[0030] (4)正确的突变质粒转化大肠杆菌BL21，37°C培养过夜，挑取单菌落为我们所需 的产重组角蛋白酶工程菌。
[0031] 表1角蛋白酶突变体的重叠 PCR引物序列
[0032]
【主权项】
1. 一种角蛋白酶突变体，其特征在于，是将来源于嗜麦芽窄食单胞菌的角蛋白酶的第 180位的丝氨酸替换成甘氨酸，或者第208位的谷氨酸替换为丝氨酸，或者第215位的酪氨 酸替换成甘氨酸或者丙氨酸或者丝氨酸或者苯丙氨酸，或者第180位的丝氨酸替换成甘氨 酸同时将第215位的酪氨酸替换成丙氨酸或者丝氨酸。
2. 根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，所述来源于嗜麦芽窄食单胞 菌的角蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
3. 编码权利要求1所述角蛋白酶突变体的基因。
4. 携带权利要求3所述基因的载体或重组细胞。
5. -种获得权利要求1所述角蛋白酶突变体的方法，其特征在于，具体步骤如下： (1)将从嗜麦芽窄食单胞菌BBEll-I中获得的编码角蛋白酶的基因，克隆到pET22b(+) 中，构建重组质粒pET22b+kerSMD; (2)采用滚环PCR的方法，设计含有代表突变氨基酸的密码子碱基的互补引物，PCR扩 增质粒pET22b+kerSMD得到含有编码角蛋白酶突变体的基因序列的开环重组载体； (3) 将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变的 原质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌JM109,挑取正确复制子，并提取正确突变质粒； (4) 将正确的重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，诱导表达，发酵上清液即角蛋白酶突 变体粗酶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还进一步包括使用AKTA蛋白纯化仪和 HisTrapFFcrudeIml的镍柱对角蛋白酶进行纯化。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将步骤（4)获得的重组菌在含有100yg/ L的氨苄青霉素的LB培养基中37°C液体培养过夜，后接入含有100yg/L的氨苄青霉素的 LB发酵液体培养基37°C培养至OD6qq= 0.6,降温至20°C培养，加入最终浓度0.ImM的诱导 剂IPTG诱导，72h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。
8. 权利要求1所述角蛋白酶突变体在日化洗涤产品中的应用。
9. 权利要求1所述角蛋白酶突变体在纺织领域的应用。
10. 权利要求1所述角蛋白酶突变体在饲料消化中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。本发明通过分析得出最佳突变点进行定点突变，获得角蛋白酶酶活和底物专一性提高的优秀突变体。该角蛋白酶及其突变体能够有效水解羽毛，羊毛等非水溶性角蛋白底物，可用于皮革纺织工业和饲料工业。
【IPC分类】C12N15-57, A23K1-165, C12N9-52, C11D3-386, D06M16-00, C12N15-70
【公开号】CN104726436
【申请号】CN201510119684
【发明人】张娟, 方真, 堵国成, 陈坚, 刘柏宏
【申请人】江南大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月18日