专利名称：带有进化免疫球蛋白结合分子的hiv蛋白酶底物分子、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及HIV蛋白酶底物分子、其制备方法及应用，尤其涉及重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子、其制备方法及应用。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，现已成为世界范围内危害人类健康最严重的传染性疾病。
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)蛋白酶包含99个氨基酸，活性形式为同源二聚体。该酶通过切割HIV gag与gag-pol融合蛋白促进病毒颗粒的成熟。Gag蛋白的切割引起病毒体形态的改变以及核心蛋白的浓缩，切割产物与病毒体结构形成及RNA包装密切相关。蛋白酶被包装进病毒体及切割事件基本上与病毒从感染细胞表面出芽同时发生，或稍迟一些完成。缺少活性蛋白酶的原病毒DNA只能产生无感染性的幼稚型病毒颗粒。因此，蛋白酶是HIV复制所必需的酶，也是抗HIV药物的重要靶位点之一。HIV蛋白酶属于天冬氨酸酶类。两个蛋白酶单体形成可转动C2精确对称结构的二聚体。活性中心具有催化活性的Asp基团位于二聚体裂缝底部的共面结构上，通常作用于Gag与Gag-Pol中的保守的氨基酸序列Ser-Thr-Xa-Ya-Phe/Pro-Za。其它的切点位于Phe与Tyl之间也可位于Met-Met，Phe-Leu，Leu-Ala，Leu-Phe之间。现有的抗HIV蛋白酶抑制剂药物是根据蛋白酶的结构设计的一系列HIV蛋白酶切割位点P1-P1’相似物，通过现有的蛋白酶抑制剂药物体外筛选方法从中初筛出有效的抑制物，酶动力学实验分析蛋白酶抑制剂对蛋白酶切割活性的抑制作用，上述大规模体外筛选所获的候选物再用细胞模型进行鉴定，用于抗-HIV新药的开发。与众多HIV反转录酶抑制剂药物相比，目前仅有四个蛋白酶抑制剂药物投入临床应用，Indinavir(Crixivan)，nelfinavir(Viracept)，ritonavir(Norvir)，and saquinavir(Invirase and Fortovase)，这些药物都是通过模拟肽链结合到酶的底物结合部位而抑制蛋白酶的切割作用。
由于HIV在逆转录中具有高突变与频繁重组的特性，导致病毒的核苷酸序列呈多样性。HIV-1分为M、N和O组，仅M组又可为A到K的11个亚型。HIV-2则分为A到F六组。并且，各组及亚型均有突变株出现。并且，不仅同一感染个体不同时段体内的HIV基因序列不同，而且同一感染个体同一时段也存在不同基因序列的病毒。HIV-1与HIV-2编码蛋白酶的Pol基因间有34％的核苷酸差异，同一基因型内不同病毒组间也有10％的差异，同一组中不同毒株间的差异也达3％，而单点核苷酸引起的氨基酸不同就可导致对某抗HIV药物的抵抗。因此，目前所开发的蛋白酶抑制剂种类远远不能满足对所有HIV毒株或大部分HIV毒株的有效抑制，必须建立更多的不同序列蛋白酶的筛选模型筛选出更多的蛋白酶抑制剂以有效覆盖更多的HIV毒株。
此外，随着HIV蛋白酶抑制剂类药物的应用，HIV蛋白酶耐药性突变的不断产生已成为抗HIV治疗的重大难题之一。HIV蛋白酶通过突变来逃脱蛋白酶抑制剂的作用，临床上主要的耐药性突变图谱已经被绘制，如，30位Asp突变为Asn可引起对nelfinavir耐受，48位Gly突变与90位Leu突变可以导致saquinavir耐受。Condra et al.曾经报导过用indinavir治疗的病人产生对saquinavir和amprenavir的耐药性，即交互耐药现象，从而使得HIV蛋白酶突变耐药机制更为复杂。总的来说，HIV蛋白酶的突变导致病毒耐药性的产生，但是这是以牺牲病毒蛋白酶的活性为代价的，而此类突变之所以能够保留下来，是因为病毒还在蛋白酶切割位点发生相应突变作为补偿。HIV蛋白酶切割位点有两种酶切位点的形式“经典”的位于p17/p24，p11(蛋白酶)/p51之间以及蛋白酶N端，“非经典”的指其余的酶切位点。不同切割位点，有不同切割速度p2/p7与TF(转位蛋白)/蛋白酶之间的是最快的切割位点，而p7/p1与p1/p6则是最慢的切割位点。在蛋白酶抑制剂的作用下，除蛋白酶发生突变外，蛋白酶所识别并切割的Gag前体蛋白的p7/p1和p1/p6也发生了突变。使用蛋白酶序列46、82位突变的重组HIV-1病毒株，作用于无突变p7/p1和p1/p6切割位点时，相比作用于野生型切割位点，复制率降低68％。引入p7/p1突变位点后，相比蛋白酶突变而p7/p1位点无突变的病毒株，复制率提高了41％。可见同时发生蛋白酶突变和适应性酶切位点突变的病毒株生长状态虽然没有野生型病毒好，但比构建的单纯蛋白酶突变的嵌合病毒突变株好。可见，HIV有很好的机制来逃脱抗HIV药物的打击，病毒耐药毒株的不断出现已是抗HIV药物治疗的重大难题。因此，开发新的抗耐药HIV也成为抗HIV新药开发的重要方向和主要工作，而新的抗耐药HIV的新药筛选模型的研发也成为首当其冲的重要研究工作。
由此可见，由于HIV蛋白酶的序列多样性及耐药突变的不断产生，有效的高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retroviral therapy，HAART)疗法要求针对不同HIV蛋白酶应使用不同蛋白酶抑制剂，同时要求蛋白酶抑制剂类药物的体外大规模筛选模型不仅能够筛选出针对现有各种不同蛋白酶的抑制剂，更要能快速不断地对新出现的耐药突变株蛋白酶作出反应，筛选出针对新突变株蛋白酶的抑制剂。虽然目前所应用的蛋白酶抑制剂类药物的体外大规模筛选方法虽然已有多种，却远远不能很好地满足抗HIV新药开发的要求。具体目前所应用的体外大规模筛选方法按功能主要分为两类(1)竞争结合法(2)功能测定法。
竞争结合法为目前所应用的主要的体外筛选方法将现有蛋白酶固相化，加入的待筛选药物与现有对此蛋白酶有效的药物竞争性结合固相化蛋白酶，其中待筛药物可带有检测标记如同位素、生物素、荧光物质等，待充分结合后，洗去游离成分，使用同位素测定法、生物素检测法或光学检测法来判断待筛选药物的结合效果是否优于现有药物。若检测结果为阳性，则说明待筛药物与蛋白酶亲合力高于现有药物，可作进一步鉴定。该法已经用于大规模药物体外筛选，具有筛选效果较好、速度快的特点。其缺点也很明确(1)由于是与现有蛋白酶抑制剂竞争结合位点，因此仅能筛选出已知蛋白酶抑制剂的同类物，对于针对序列不同的不能结合已知蛋白酶抑制剂的蛋白酶及耐药性蛋白酶的药物筛选效果不好。(2)不利于生物大分子及其它类型药物如中药等的筛选。由于生物大分子或其它类型的药物与蛋白酶相互作用的多样性，因此可能存在多种并不影响结合但却影响切割效果的相互作用结果，譬如通过与活性中心外的关键基团发生作用引起蛋白酶切割活性的降低甚至丧失等，这样作用的药物候选物该模型效果也不好。
功能测定法Matayosh，E.D.et al早在1990就合成了一种含蛋白酶酶切位点短肽的荧光淬灭分子来作为蛋白酶的底物，即在一端连接荧光基团，另一端连接荧光淬灭基团，使用蛋白酶切割该底物后，荧光基因与淬灭基团分离，发出荧光。当所筛分子对蛋白酶有抑制时，底物不被切割，则不能发出荧光，因此，通过检测荧光强度即可判断所筛药物的活性。目前该法已被实际应用到HIV蛋白酶抑制剂的筛选过程中。另外，国外有学者将蛋白酶酶切位点融合表达到两个蛋白之间，其中一个蛋白是可用ELISA检测的标记蛋白，另一个则提供针对前一蛋白ELISA法检测位点的封闭基团。待筛药物与蛋白酶结合后，如有抑制作用，则不能切割融合蛋白，标记蛋白则不能被检测出。用ELISA法检测切割后的标记蛋白信号强度，如呈显弱阳性，则可认为待筛药物抑制了蛋白酶的切割作用，封闭基团仍可作用于检测标记基团。上述方法尤其是第一种具有敏感、快速、简便的特点，特别适合于大规模的体外筛选，并且是直接测定蛋白酶的切割功能，适用于生物大分子及其它类型药物的检测。但上述两种方法所模拟的酶切位点底物，由于方法自身的局限性，两端基团需要足够短的距离才能起作用，导致包含酶切位点的片断只能很短，无法保留较完整HIV蛋白酶靶序列周围天然的结构域，因此所得构象与HIV切割位点周围的实际序列差距较大，当切割位点周围序列对蛋白酶作用产生影响时，一些在体外模型中所筛出的蛋白酶抑制剂候选物就不一定能在体内实际的环境中有效作用，从而导致所筛药物在HIV细胞模型中的有效率下降。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子及其基因序列。
本发明的另一个目的是提供上述带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子的表达载体、转化体及其制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子的应用。
本发明的第四个目的是提供展示上述带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子的噬菌体、转化体及其制备方法。
本发明的第五个目的是提供上述展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体的应用。
为了得到更加简便实用的HIV蛋白酶抑制剂类药物筛选模型，我们选择了将HIV蛋白酶靶位点及其周围结构域序列克隆至带有免疫球蛋白结合分子的噬菌体，得到了可以被HIV蛋白酶切割的新型噬菌体，以及可被HIV蛋白酶切割的带有免疫球蛋白结合分子的多肽。具体为体外合成了HIV GAG蛋白CAP2NC片断的cDNA序列。并将该片断克隆至噬菌体载体PCANTAB5S-LD3的Stu I和Sal I位点。PCANTAB5S-LD3是从展示金黄色葡萄球菌蛋白和大消化链球菌表面蛋白的Ig结合结构域的噬菌体文库中筛选获得的具有高免疫球蛋白结合单克隆噬菌体，其制备方法详见《噬菌体展示SpA及PpL Ig结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页。进一步将LD3-CAP2NC DNA序列克隆至pQE30载体，表达了带有免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物多肽。
本发明将HIV gag基因CAP2NC序列克隆至噬菌体载体PCANTAB5S-LD3，生产并纯化新型噬菌体PCANTAB5S-LD3-CAP2NC，对HIV蛋白酶切割该噬菌体的切割效果进行了测定，建立了应用该噬菌体进行HIV蛋白酶切割活性检测的方法，建立了应用该噬菌体进行HIV蛋白酶抑制剂类药物筛选的酶联免疫吸附方法。另外，本发明生产并纯化了带有免疫球蛋白结合分子的HIV底物多肽，并建立了应该该多肽进行HIV蛋白酶切割活性检测的方法。
本发明的第一方面，公开了一种重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子，它是SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白。较佳的，它是SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
上述分子是发明人通过将HIV GAG蛋白CAP2NC片断连接于LD3分子的C端后获得的。该分子包含HIV蛋白酶的靶位点P2NC。经过发明人的一系列试验，证实该分子可以在体外被HIV蛋白酶所切割，并为特异性切割。
本发明的第二方面，公开了一种分离的多核苷酸，它编码上述带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子。较佳的，它是SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。
本发明的第三方面，公开了一种表达载体，它表达上述SEQ ID NO1蛋白，表达载体含有上述多核苷酸以及与该多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。较佳的，上述表达载体为原核表达载体，如pKK223-3、pBR322、pGEX载体等等，优选pQE30。
本发明的第四方面，公开了一种宿主细胞，它被上述表达载体所转化。较佳的，上述宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，其中优选大肠杆菌如M15，DH5α，TG1，其中优选大肠杆菌M15。
本发明的第五方面，公开了上述带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子的制备方法，该方法包含(1)在适合表达带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子的条件下，培养上述宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有免疫球蛋白结合活性且可被HIV蛋白酶切割的多肽。实施例中，发明人将新型带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子克隆入原核表达载体pQE30中，构建其大肠杆菌表达菌种，对该菌种进行大规模培养，诱导生产进化免疫球蛋白结合分子，用Ni亲和层析柱进行纯化，制备出纯化的新型带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子LD3-CAP2NC。
本发明的第六方面，公开了将上述的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子用于体外HIV蛋白酶的切割试验，HIV蛋白酶切割该噬菌体的模式是特异性切割模式，即HIV蛋白酶特异性识别展示于噬菌体表面的CAP2NC片断中的氨基酸序列SATIMMQRGN。
优选的，上述应用为将带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子用于检测HIV蛋白酶的体外活性，其中体外活性检测优选体外切割活性检测。
同样优选的，上述应用为将带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子用于HIV蛋白酶抑制剂类药物的筛选鉴定。
较佳的，上述HIV蛋白酶来自HIV SF2株蛋白酶。
本发明的第七方面，公开了一种噬菌体，它含有上述多核苷酸以及与该多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。噬菌体优选PCANTAB5S。经过一系列试验证实，该噬菌体可以在体外被HIV蛋白酶切割，并为特异性切割。
本发明的第八方面，公开了一种宿主细胞，它被上述噬菌体所转化。较佳的，上述宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，其中优选大肠杆菌如M15，DH5α，TG1，其中更佳的，为大肠杆菌TG1。
本发明的第九方面，公开了上述带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体的制备方法，该方法包含(1)在适合培养带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体的条件下，培养上述宿主细胞；(2)从培养物中分离出带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体。实施例中，发明人将HIV蛋白酶底物分子克隆入噬菌体载体PCANTAB5S-LD3中，构建其大肠杆菌菌种，对该菌种进行大规模培养，扩增上述展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体，用0.22μm微孔滤膜进行纯化，制备出纯化的新型的带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体。
本发明的第十方面，公开了将上述的带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体用于体外HIV蛋白酶的切割试验，HIV蛋白酶切割该噬菌体的模式是特异性切割模式，即HIV蛋白酶特异性识别展示于噬菌体表面的CAP2NC片断中的氨基酸序列SATIMMQRGN。
优选的，上述应用为将带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体用于体外检测HIV蛋白酶的活性，其中体外活性检测优选体外切割活性检测。
同样优选的，上述应用为将带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体用于HIV蛋白酶抑制剂类药物的筛选鉴定。
较佳的，上述HIV蛋白酶来自HIV SF2株蛋白酶。
本发明的优点在于本发明公开的带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体，在蛋白酶靶位点周围保留了较完整的HIV蛋白酶靶序列结构域，能更好地模拟体内蛋白酶切割底物的真实情况，使得如此体外所筛出的蛋白酶抑制剂候选物在细胞体内模型中有更高地阳性率，提高了筛选效率。另一方面，本发明公开了上述带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体的基因工程制备方法，使得低成本、大规模生产成为可能。再一方面，本发明公开了将上述带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体用于HIV蛋白酶的体外活性检测及HIV蛋白酶抑制剂类药物的筛选鉴定，与现有技术相比，使用了本发明的带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体可以提高检测的灵敏度，筛选的效率。
图1CAP2NC DNA合成并克隆于噬菌粒pCANTAB5S-LD3的流程2CAP2、NC、CAP2NC DNA PCR扩增MDL2,000marker；1，2CAP2/NC PCR产物3，4CAP2PCR产物5，6NC PCR产物图3重组噬菌粒pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的酶切鉴定MDL2,000marker；1pCANTAB5S-LD3-CAP2/NC2，3噬菌粒pCANTAB5S-LD3-CAP2NC/Stu I+Sal I，图4CAP2NC和LD3-CAP2NC融合蛋白表达载体构建流程5LD-CAP2NC DNA片断的PCR扩增1-3LD3-CAP2NC DNA片断PCR产物MDL 2,000marker图6pQE30-LD3-CAP2NC质粒限制酶酶切分析1pQE30-LD3-CAP2NC质粒2-4pQE30-LD3-CAP2NC质粒/Bam H I+Sal IMDL 2,000marker图7大肠杆菌中诱导表达HIV CAP2NC与的LD3-CAP2NC融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析MP Protein marker；1-4pQE30-CAP2NC/M15诱导后总蛋白5pQE30/M15对照；6-9pQE30-LD3-CAP2NC/M15诱导后总蛋白图8纯化HIV CAP2NC与LD3-CAP2NC蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析MProtein marker；
1纯化LD3-CAP2NC蛋白图9不同剂量HIV SF2蛋白酶切割LD3-CAP2NC融合蛋白MProtein marker；1蛋白酶2μg+LD3-CAP2NC；2蛋白酶0.2μg+LD3-CAP2NC；3蛋白酶0.02μg+LD3-CAP2NC；4LD3-CAP2NC control；5蛋白酶2μg+LD3；6LD3**由于LD3分子是由pET32a(+)/BL21系统表达，其纯化产物融合有Trx Tag、S Tag、HisTag等，因此融合蛋白分子量达到约36 000。
图10不同剂量HIV SF2蛋白酶切割噬菌体表面的CAP2NC none 10ug/ml HIV SF2蛋白酶 5ug/ml HIV SF2蛋白酶 2.5ug/ml HIV SF2蛋白酶 1.25ug/ml HIV SF2蛋白酶图11Indinavir对HIV SF2蛋白酶切割展示HIV CAP2NC蛋白的重组噬菌体的作用 none 10ug/ml HIV SF2蛋白酶 3ug/ml Indinavir 10ug/ml HIV SF2蛋白酶+3ug/ml Indinavir具体实施方式
在本发明中，术语“其保守性变异蛋白”是指具有HIV蛋白酶底物分子活性的SEQ IDNO1所示的氨基酸序列的蛋白的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-30个，较佳的1-10个，更佳的1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸，例如，在本领域中，用性能相近或相似地氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质地功能，如可以用Val或Leu或Ile取代Ala等，又比如，在C末端和/或N末端添加一个和数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。此外，这些变异形式还包括成熟蛋白与另一个化合物融合所形成的蛋白，附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，比如GST)。此外，变异形式还包括(但不限于)进化免疫球蛋白结合分子及上述蛋白经过修饰后的形式化学衍生形式如乙酰化或羧基化；糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白，这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟悉技术人员公知的范围。
本发明中，术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
用重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法或热击法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明所述适合表达进化免疫球蛋白结合分子的条件与表达所用的宿主细胞有关，重组载体转化的宿主细胞获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。上述方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
一、一种新型带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子原核制备本发明所述的一种新型带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子LD3-CAP2NC是将HIV GAG蛋白CAP2NC片断克隆至噬菌体PCANTAB5S-LD3获得。其中，PCANTAB5S-LD3带有进化免疫球蛋白结合分子，制备PCANTAB5S-LD3的方法在《噬菌体展示SpA及PpL Ig结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页中具有详细描述。本发明以含有编码带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子LD3-CAP2NC cDNA序列克隆pCANTAB5S-LD3-CAP2NC为模板，PCR扩增LD3-CAP2NC的DNA片断，并通过引物合成方法在扩增片断上游引入Bam HI内切酶识别位点。扩增片断用PCR产物回收试剂盒回收后Bam H I和SalI内切酶酶切，酶切片断进行琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，克隆到原核表达载体PQE30的BamH I和SalI位点中，构建成功原核表达载体PQE30-LD3-CAP2NC，用CAP2NC的下游引物C1Ld-6(5’-gggg GTC GAC GTT AGC CTG ACG TTC GGT GCA GTC-3’(SEQ ID NO5)。委托上海生工生物技术有限公司合成。)测定克隆片段LD3-CAP2NC的DNA序列，序列分析结果证实PQE30-LD3-CAP2NC在Bam H I和SalI位点间的插入序列与带有免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAPN2C的序列完全相符，读框完全正确，起始子和终止子已加上。取重组质粒PQE30-LD3-CAP2NC200ng转化大肠杆菌M15，获得LD3-CAP2NC的原核表达菌种。将该菌中培养后IPTG诱导表达，设空菌作阴性对照，SDS电泳显示在分子量约60000Daltons处出现对照菌没有的一条蛋白带，符合LD3-CAP2NC的分子量。将菌种菌种活化后大量培养，IPTG诱导表达，Ni-NTA柱纯化获得纯化LD3-CAP2NC融合蛋白，SDS电泳显示纯化后仅出现一条蛋白带，符合其相应分子量。
二、HIV蛋白酶体外切割带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子HIV SF2株蛋白酶为HIV-1型B亚型SF2株蛋白酶，其制备方法在《Identificationof efficiently cleaved substrates for HIV-1 protease using a phage display libraryand use in inhibitor development》，Virology，2000年274期中391-401页中有详细记载。
将纯化后的LD3-CAP2NC蛋白用磷酸盐缓冲液调至5μg/μl。取LD3-CAP2NC蛋白各25μg于MES缓冲液(0.2M NaCl，0.1M 2-吗啉代乙烷磺酸，pH 6.7)中，加入不同浓度的HIV SF2蛋白酶(2μg，0.2μg，0.02μg，0.002μg)，混匀后于37℃孵育16h，反应完成后，每一反应体系加入20μl 2倍SDS加样缓冲液，振荡混匀后100℃加热7min，用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定切割效果。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳显示2μg蛋白酶可以将LD3-CAP2NC蛋白切割成两条目的条带，大小与LD3-CAP2和NC蛋白的分子量一致，表明融合了LD3分子后，HIV蛋白酶靶分子仍可被HIV SF2株蛋白酶特异性切割。单独的LD3蛋白未见任何切割作用。
三、带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体的制备本发明所述的带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体是将HIV GAG蛋白CAP2NC片断克隆至噬菌体载体pCANTAB5S-LD3获得。取pCANTAB5S-LD3-CAP2NC重组噬菌粒1μg转化大肠杆菌TG1，活化培养1h后加入1ml 4×1010TU/ml的M13KO7辅助噬菌体拯救，37℃，250rpm振荡培养1h，1000×g离心10min，细菌沉淀用10ml 2×YT(含氨苄青霉素100ng/μl和卡那霉素50ng/ml)悬浮，37℃，250r/min振荡培养过夜。培养液上清加入2ml聚乙二醇/NaCl沉淀后悬浮于10ml2×YT培养液中，经0.22μm滤膜过滤，获得pCANTAB5S-LD3-CAP2NC重组噬菌体。取1μl重组噬菌体10倍系列稀释，感染对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃培养1h后涂琼脂(含氨苄青霉素100ng/μl)平板，置37℃培养过夜。计数不同稀释度平皿上的菌落数，生长菌落数的稀释倍数乘以100即为每毫升噬菌体的转化单位数(transformation unit，TU)。
四、HIV蛋白酶体外切割带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体将pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体用2×YT培养液均调整至1.0×1012TU/ml后，分别取噬菌体100μl，加入包被有人IgG抗体的反应孔中，37℃孵育3h后洗涤10次。每孔加入不同稀释度的HIV SF2蛋白酶至终浓度分别为10ug/ml，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml。37℃孵育4h后洗涤10次。加入抗M13噬菌体酶标抗体，37℃孵育45min后加入TMB显色，测D450值，每种蛋白酶浓度各作3复孔，取平均值计算切割率。切割率＝(未加蛋白酶D450均数-(加入蛋白酶后D450均数-对照D450均数))/(未加蛋白酶D450均数-对照D450均数)。结果证实HIV蛋白酶能够很好的切割展示于噬菌体表面的蛋白酶靶分子，在蛋白酶浓度分别为10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml时，HIV SF2蛋白酶切割噬菌体pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的切割率分别为80％、53％、24％，且与HIV SF2蛋白酶浓度呈相关关系(0.05＞P＞0.02)，表现出较好的特异性作用。
五、应用带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体鉴定HIV蛋白酶抑制剂类药物蛋白酶切割的抑制作用为验证上述实验中噬菌体数量减少是否为HIV SF2蛋白酶的特异性作用，我们利用蛋白酶抑制剂类药物Indinavir(商品名Crixivan，Merck公司，由上海公共卫生中心卢洪洲教授惠赠)对上述切割进行了鉴定。将pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体用2×YT培养液均调整至1.0×1012TU/ml后，分别取噬菌体100μl，加入包被有人IgG抗体的反应孔中，37℃孵育3h后洗涤10次。每孔加入不同稀释度的HIV SF2蛋白酶至终浓度分别为10ug/ml，0ug/ml，分成两组，一组中加入Indinavir至3μg/ml，另一组不加Indinavir，37℃孵育3h后洗涤10次。每孔加入不同稀释度的HIV SF2蛋白酶，37℃孵育4h后洗涤10次。加入抗M13噬菌体酶标抗体，37℃孵育45min后加入TMB显色，测D450值同，每种蛋白酶浓度各作3复孔，取平均值计算切割率。结果表明，同时加入HIV SF2蛋白酶与Indinavir组，结合于板上的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC数量明显高于仅加入HIV SF2蛋白酶组，且与对照组结合于板上噬菌体数量相当，说明蛋白酶抑制剂特性抑制蛋白酶对CAP2NC的特异切割。Indinavir同样抑制蛋白酶对LD3的非特异切割。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆试验手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1 一种新型带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌体制备的方法噬菌体载体pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的构建流程见图1含有编码带有进化免疫球蛋白结合分子LD3的展示HIV蛋白酶靶分子cDNA序列克隆的重组噬菌粒载体pCANTAB5S-LD3-CAP2NC，是通过将CAP2NC的cDNA序列克隆至噬菌体载体PCANTAB5S-LD3的StuI和SalI位点之间构建的，pCANTAB5S-LD3制备的具体步骤在《噬菌体展示SpA及PpL Ig结合单结构域随机组合文库及亲和筛选》，生物物理与生物化学进展，2005年第32卷第6期第535～543页中已完全公开。
1引物合成CAP2NC cDNA序列是通过重叠延伸PCR方法在体外合成的。根据GenBank中HIV-1 HXB2株CAP2序列(GenBank NOAF 033819；CAP2氨基酸序列为GAG蛋白上第133位到430位氨基酸)，根据大肠杆菌偏好密码子设计并合成了10对用以重叠延伸PCR合成蛋白酶DNA序列的引物C1Bu-1，C1Bu-2，C1Bu-3，C1Bu-4，C1Bu-5，C1Bu-6，C1Bu-7，C1Bu-8，C1Bu-9，C1Bu-10，C1Bd-1，C1Bd-2，C1Bd-3，C1Bd-4，C1Bd-5，C1Bd-6，C1Bd-7，C1Bd-8，C1Bd-9，C1Bd-10。每条约50个碱基，重叠区域包含20个碱基，序列全长726bp。HIV CAP2NC片段中存在两个蛋白酶靶位点CA/P2，P2/NC，本研究选择P2/NC序列作为蛋白酶切割对象，为了避免CA/P2位点的影响，我们对CA/P2位点进行了改造，将GAG蛋白第231位L突变为G，232位A突变为G，突变后的CA/P2位点将不会被HIV蛋白酶特异性切割。引物序列如下C1Bu-1(SEQ ID NO6)5’-gg TCTAG ACCGA TCGTT CAGAA CATCC AGGGT CAGAT GGTTC ACCAG GCTAT CTCTC-3’C1Bu-2(SEQ ID NO7)5’-CTTGG GTTAA AGTTG TTGAA GAAAA AGCTT TCTCT CCGGA AGTTA TCCCG ATGTT-3’C1Bu-3(SEQ ID NO8)5’-AGGTG CTACC CCGCA GGACC TGAAC ACCAT GCTGA ACACC GTTGG TGGTC ACCAG-3’C1Bu-4(SEQ ID NO9)5’-CTGAA AGAAA CCATC AACGA AGAAG CTGCT GAATG GGACC GTGTT CACCC GGTTC-3’C1Bu-5(SEQ ID NO10)5’-CTCCG GGTCA GATGC GTGAA CCGCG TGGTT CTGAC ATCGC TGGTA CCACC TCTAC-3’C1Bu-6(SEQ ID NO11)5’-CGGTT GGATG ACCAA CAACC CGCCG ATCCC GGTTG GTGAA ATCTA CAAAC GTTGG-3’C1Bu-7(SEQ ID NO12)5’-AACAA AATCG TTCGT ATGTA CTCTC CGACC TCTAT CCTGG ACATC CGTCA GGGTC-3’C1Bu-8(SEQ ID NO13)5’-GTGAC TACGT TGACC GTTTC TACAA AACCC TGCGT GCTGA ACAGG CTTCT CAGGA-3’C1Bu-9(SEQ ID NO14)5’-GACCG AAACC CTGCT GGTTC AGAAC GCTAA CCCGG ACTGC AAAAC CATCC TGAAA-3’C1Bu-10(SEQ ID NO15)5’-CCTGG AAGAA ATGAT GACCG CTTGC CAGGG TGTTG GTGGT CCGGG TCACA AAGCT-3’C1Bd-1(SEQ ID NO16)5’-TTCAA CAACT TTAAC CCAAG CGTTC AGGGT ACGCG GAGAG ATAGC CTGGT GAACC-3’C1Bd-2(SEQ ID NO17)5’-GGTCC TGCGG GGTAG CACCT TCAGA CAGAG CAGAG AACAT CGGGA TAACT TCCGG-3’C1Bd-3(SEQ ID NO18)5’-TCGTT GATGG TTTCT TTCAG CATCT GCATA GCAGC CTGGT GACCA CCAAC GGTGT-3’C1Bd-4(SEQ ID NO19)5’-TTCAC GCATC TGACC CGGAG CGATC GGACC AGCGT GAACC GGGTG AACAC GGTCC-3’C1Bd-5(SEQ ID NO20)5’-GGTTG TTGGT CATCC AACCG ATCTG TTCCT GCAGG GTAGA GGTGG TACCA GCGAT-3’C1Bd-6(SEQ ID NO21)5’-TACAT ACGAA CGATT TTGTT CAGAC CCAGG ATGAT CCAAC GTTTG TAGAT TTCAC-3’C1Bd-7(SEQ ID NO22)5’-GAAAC GGTCA ACGTA GTCAC GGAAC GGTTC TTTCG GACCC TGACG GATGT CCAGG-3C1Bd-8(SEQ ID NO23)5’-GAACC AGCAG GGTTT CGGTC ATCCA GTTTT TAACT TCCTG AGAAG CCTGT TCAGC-3’C1Bd-9(SEQ ID NO24)5’-ATCAT TTCTT CCAGG GTAGC AGCCG GACCC AGAGC TTTCA GGATG GTTTT GCAGT-3’C1Bd-10(SEQ ID NO25)5’-GTTGG TAACC TGAGA CATAG CTTCA CCACC AACAC GAGCT TTGTG ACCCG GACCAC-3’根据GenBank中HIV-1 HXB2株NC序列(GenBank NOAF 033819；NC氨基酸序列为GAG蛋白上第431位到488位氨基酸)，根据大肠杆菌偏好密码子设计并合成了2对用以重叠延伸PCR合成NC DNA序列的引物C1Lu-1a，C1Lu-2，C1Ld-1，C1Ld-2。每条约50个碱基，重叠区域包含20个碱基，序列全长176bp。引物序列如下C1Lu-1a(SEQ ID NO26)5’-a TCATG ATGCA GCGTG GTAAC TTCCG TAACC AGCGT AAAAT CGTTAAATGC TTCAA CT-3’C1Lu-2(SEQ ID NO27)5’-CTCGT AACTG CCGTG CTCCG CGTAA AAAAG GTTGC TGGAA ATGCG GTAAAGAAGG TCAC-3’C1Ld-1(SEQ ID NO28)5’-GGAGC ACGGC AGTTA CGAGC GGTGT GACCT TCTTT ACCGC AGTTG AAGCATTTAA CGA-3’C1Ld-2(SEQ ID NO29)5’-gg GTCGA CGTTA GCCTG ACGTT CGGTG CAGTC TTTCA TCTGG TGACCTTCTT TACCG CA-3’上述引物均委托上海生工生物技术有限公司合成。
用重叠延伸PCR方法体外合成编码HIV-1 CAP2的DNA序列。首轮PCR反应体系包括上述10对引物(C1Bu-1，C1Bu-2，C1Bu-3，C1Bu-4，C1Bu 5，C1Bu-6，C1Bu-7，C1Bu-8，C1Bu-9，C1Bu-10，C1Bd-1，C1Bd-2，C1Bd-3，C1Bd-4，C1Bd-5，C1Bd-6，C1Bd-7，C1Bd-8，C1Bd-9，C1Bd-10，浓度分别为0.25mM)，Pfu DNA聚合酶(购自Promega公司)1u，总体积50μl，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 60sec，30个循环；最后72℃延伸5min。第二轮反应以首轮PCR产物1μl为模板，以引物C1Bu-1，C1Bd-10为上、下游引物，各0.25mM，Pfu DNA聚合酶1u，总体积50μl，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30sec，45℃ 45sec，72℃ 60sec，30个循环；最后72℃延伸5min。1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。结果如图2所示，在756kb处有条带显示。
用重叠延伸PCR方法体外合成编码HIV-1 NC的DNA序列。首轮PCR反应体系包括上述2对引物(C1Lu-1a，C1Lu-2，C1Ld-1，C1Ld-2，浓度为0.25mM)，Pfu DNA聚合酶lu，总体积50μl，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 30sec，30个循环；最后72℃延伸5min。第二轮反应以首轮PCR产物1μl为模板，以引物C1Lu-la，C1Ld-2为上、下游引物，各0.25mM，Pfu DNA聚合酶lu，总体积50μl，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30sec，45℃ 45sec，72℃ 30sec，30个循环；最后72℃延伸5min。1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，如图2所示，在176kb处有条带显示。
DNA凝胶抽提试剂盒(购自杭州维特洁生化技术有限公司)纯化上述两种PCR产物。纯化后的PCR产物CAP2与NC各取100ng，分别与50ng pMD-18T载体(购自Takara公司)混合，同时加入等体积的DNA Ligation Solution I(购自Takara公司)，于16℃连接30min。取连接液10μl转化氯化钙法制备的100μl感受态大肠杆菌Top10F’。冰浴30min，42℃ 1min，冰浴2min；加入900μl 37℃预热的SOC，37℃，200rpm，1h；取100μl转化液涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜。
对CAP2克隆的质粒以C1Bu-1，C1Bd-10为上、下游引物PCR扩增筛选阳性克隆，引物浓度为0.25mM，Taq DNA聚合酶(购自Takara公司)1U，总体积50μl，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 45sec，30个循环；最后72℃延伸5min。对NC克隆的质粒以引物C1Lu-1a，C1Ld-2为上、下游引物PCR扩增筛选阳性克隆，引物浓度为0.25mM，Taq DNA聚合酶1U，总体积50μl，反应条件为94℃变性5min；94℃ 30sec，45℃ 30sec，72℃ 30sec，30个循环；最后72℃延伸5min。取鉴定为阳性的单克隆委托Invitrogen公司进行序列测定，测序结果用DNASTAR软件与GenBank中序列进行同源性比较分析，结果符合预期，CAP2与NC的cDNA序列分别如SEQ ID NO3，SEQ ID NO4所示。将测序正确的质粒分别命名为pMD18-T-CAP2和pMD18-T-NC。
CAP2 cDNA序列(SEQ ID NO3)如下TCTAGACCGATCGTTCAGAACATCCAGGGTCAGATGGTTCACCAGGCTATCTCTCCGCGTACCCTGAACGCTTGGGTTAAAGTTGTTGAAGAAAAAGCTTTCTCTCCGGAAGTTATCCCGATGTTCTCTGCTCTGTCTGAAGGTGCTACCCCGCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTTGGTGGTCACCAGGCTGCTATGCAGATGCTGAAAGAAACCATCAACGAAGAAGCTGCTGAATGGGACCGTGTTCACCCGGTTCACGCTGGTCCGATCGCTCCGGGTCAGATGCGTGAACCGCGTGGTTCTGACATCGCTGGTACCACCTCTACCCTGCAGGAACAGATCGGTTGGATGACCAACAACCCGCCGATCCCGGTTGGTGAAATCTACAAACGTTGGATCATCCTGGGTCTGAACAAAATCGTTCGTATGTACTCTCCGACCTCTATCCTGGACATCCGTCAGGGTCCGAAAGAACCGTTCCGTGACTACGTTGACCGTTTCTACAAAACCCTGCGTGCTGAACAGGCTTCTCAGGAAGTTAAAAACTGGATGACCGAAACCCTGCTGGTTCAGAACGCTAACCCGGACTGCAAAACCATCCTGAAAGCTCTGGGTCCGGCTGCTACCCTGGAAGAAATGATGACCGCTTGCCAGGGTGTTGGTGGTCCGGGTCACAAAGCTCGTGTTGGTGGTGAAGCTATGTCTCAGGTTACCAACTCTGCTACCATCATGATGCAGCGTGGTAANC cDNA序列(SEQ ID NO4)如下ATCATGATGCAGCGTGGTAACTTCCGTAACCAGCGTAAAATCGTTAAATGCTTCAACTGCGGTAAAGAAGGTCACACCGCTCGTAACTGCCGTGCTCCGCGTAAAAAAGGTTGCTGGAAATGCGGTAAAGAAGGTCACCAGATGAAAGACTGCACCGAACGTCAGGCTAACGTCGAC2 CAP2NC序列的PCR扩增以pMD18-T-CAP2质粒为模板，以C1Bu-stu(SEQ ID NO30)(5’-gg AGG CCT TCT AGACCG ATC GTT CAG AA-3’，生工生物技术公司合成)和C2Bd-11t(SEQ ID NO31)(5’-GTTACC ACG CTG CAT CAT GAT GGT AGC AGA GTT GGT AAC CTG AGA CAT AG-3’，生工生物技术公司合成)为引物扩增CAP2片段，引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg2+3mmol，Taq酶1U，50μl反应体积，扩增条件为94℃ 40s；56℃ 40s；72℃ 60s；30个循环。以pMD18-T-NC质粒为模板，以C1Lu-1a，和C1Ld-6为引物扩增NC片段，引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg2+3mmol，Taq酶1U，50μl反应体积，扩增条件为94℃ 40s；56℃ 40s；72℃ 60s；30个循环。PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶电泳分析、试剂盒溶液回收。
以CAP2与NC扩增产物为模板，以C1Bu-stu和C1Ld-6为引物扩增CAP2/NC片段，引物各1μmo1，dNTP 100μmol，Mg2+3mmol，Taq酶1U，50μl反应体积，扩增条件为94℃ 40s；55℃ 40s；72℃ 90s；30个循环。PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2，912kb处条带为CAP2NC。PCR产物纯化试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)溶液回收。回收产物StuI和SalI双酶切过夜，DNA凝胶抽提试剂盒(购自杭州维特洁生化技术有限公司)胶回收。
3重组噬菌体载体的构建及DNA序列测定将HIV CAP2NC DNA的Stu I和Sal I酶切回收产物与限制酶Stu I和Sal I消化后的pCANTAB5S-LD3载体连接并转化大肠杆菌Top10F’。提取单克隆噬菌粒，双酶切鉴定，如图3所示，在912kb可见一条带，即为CAP2NC DNA。初步鉴定正确的三个单克隆送英骏生物技术公司进行序列测定。测序结果用DNASTAR软件与GenBank中序列进行同源性比较分析。
最终获得的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的cDNA序列如序列SEQ ID NO2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
最终获得的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的cDNA序列(SEQ ID NO2)AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCAGGTCTAGACCGATCGTTCAGAACATCCAGGGTCAGATGGTTCACCAGGCTATCTCTCCGCGTACCCTGAACGCTTGGGTTAAAGTTGTTGAAGAAAAAGCTTTCTCTCCGGAAGTTATCCCGATGTTCTCTGCTCTGTCTGAAGGTGCTACCCCGCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTTGGTGGTCACCAGGCTGCTATGCAGATGCTGAAAGAAACCATCAACGAAGAAGCTGCTGAATGGGACCGTGTTCACCCGGTTCACGCTGG
TCCGATCGCTCCGGGTCAGATGCGTGAACCGCGTGGTTCTGACATCGCTGGTACCACCTCTACCCTGCAGGAACAGATCGGTTGGATGACCAACAACCCGCCGATCCCGGTTGGTGAAATCTACAAACGTTGGATCATCCTGGGTCTGAACAAAATCGTTCGTGGTACTCTCCGACCTCTATCCTGGACATCCGTCAGGGTCCGAAAGAACCGTTCCGTGACTACGTTGACCGTTTCTACAAAACCCTGCGTGCTGAACAGGCTTCTCAGGAAGTTAAAAACTGGATGACCGAAACCCTGCTGGTTCAGAACGCTAACCCGGACTGCAAAACCATCCTGAAAGCTCTGGGTCCGGCTGCTACCCTGGAAGAAATGATGACCGCTTGCCAGGGTGTTGGTGGTCCGGGTCACAAAGCTCGTGTTGGTGGTGAAGCTATGTCTCAGGTTACCAACTCTGCTACCATCATGATGCAGCGTGGTAACTTCCGTAACCAGCGTAAAATCGTTAAATGCTTCAACTGCGGTAAAGAAGGTCACACCGCTCGTAACTGCCGTGCTCCGCGTAAAAAAGGTTGCTGGAAATGCGGTAAAGAAGGTCACCAGATGAAAGACTGCACCGAACGTCAGGCTAACGTCGAC带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的氨基酸序列(SEQ IDNO1)KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELRSRPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVGGEAMSQVTNSATIMMQRGNFRNQRKIVKCFNCGKEGHTARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANVD4带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌体的构建取pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌粒各1μg转化大肠杆菌TG1，活化培养1h后加入1ml 4×1010TU/ml的M13KO7辅助噬菌体拯救，37℃，250rpm振荡培养1h，1000×g离心10min，细菌沉淀用10ml 2×YT(含氨苄青霉素100ng/μl和卡那霉素50ng/ml)悬浮，37℃，250r/min振荡培养过夜。培养液上清加入2ml聚乙二醇/NaCl沉淀后悬浮于10ml 2×YT培养液中，经0.22μm滤膜过滤，分别获得pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体。取1μl重组噬菌体10倍系列稀释，感染对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃培养1h后涂SOB(含氨苄青霉素100ng/μl)平板，置37℃培养过夜。计数不同稀释度平皿上的菌落数，生长菌落数的稀释倍数乘以100即为每毫升噬菌体的转化单位数(transformation unit，TU)。
所制备的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体滴度分别为3.2×1012、5.6×1012TU/ml，pCANTAB5S对照噬菌体滴度为7.6×1012TU/ml可见重组噬菌体的滴度与对照噬菌体基本在同一水平。
实施例2 新型带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子的原核制备方法及应用
1带有进化免疫球蛋白结合分子的蛋白酶靶分子的原核表达载体的构建表达带有进化免疫球蛋白结合分子的蛋白酶靶分子的原核表达载体的构建流程如图4所示以pCANTAB5S-LD3-CAP2NC质粒为模板，以LCu-bam，C1Ld-6(LCu-bam(SEQ ID NO32)5’-gggg GGA TCC CCG GCC TCT AGA GAG-3’，上海生工生物技术有限公司合成。)分别为上下游引物扩增LD3-CAP2NC DNA片断，94℃ 40s；55℃ 40s；72℃ 120s；Taq酶0.3μl，50μl反应体系，30个循环。PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳分析、试剂盒溶液回收，如图5所示；回收产物Bam H I和Sal I双酶切过夜，试剂盒回收后与限制酶Bam H I与Sal I消化后的原核表达载体pQE30(购自QIAgene公司)连接并转化大肠杆菌.Top10F’。提取单克隆质粒，Bam H I与Sal I双酶切鉴定。
如图6所示，pQE30-LD3-CAP2NC经Bam H I与Sal I后，在1500bp左右处出现一条带，大小与LD3-CAP2NC DNA一致。
2重组表达载体pQE30-LD3-CAP2NC的表达与纯化将pQE30-LD3-CAP2NC转化大肠杆菌M15(购自QIAgene公司)中进行IPTG诱导表达。取诱导后菌液1ml，离心收集菌体，加20μl 2倍SDS加样缓冲液，振荡混匀后100℃加热7min，用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达结果。挑选表达量较高的菌种进行重组蛋白的大量诱导表达和纯化将pQE30-LD3-CAP2NC/M15的过夜培养物50ml接种500ml LB培养基，剧烈振摇4h，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导3.5h，离心收集细菌沉淀，8M pH8.0尿素裂解过夜，离心收集上清用于纯化，纯化按Qiagen公司Ni-NTA使用说明书进行。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定纯化效果。Brade-ford法595nm下测定目的蛋白浓度。
如图7所示，pQE30-LD3-CAP2NC/M15诱导产物在分子量约60000 Daltons处出现对照菌pQE30/M15没有的一条蛋白带，符合LD3-CAP2NC的分子量。将菌种菌种活化后大量培养，IPTG诱导表达，Ni-NTA柱纯化获得纯化LD3-CAP2NC融合蛋白。
灰度扫描分析表明目的蛋白LD3-CAP2NC占总蛋白量达到10％以上。用Ni-NTA亲和介质纯化目的蛋白，经10％SDS-PAGE鉴定，纯化后显示为分子质量60 000的单一条带(图8)，经Smartview软件密度扫描分析纯化后的LD3-CAP2NC条带占纯化后总蛋白百分比约为80％。用Brade-ford工作液在595nm下测纯化后蛋白浓度，LD3-CAP2NC融合蛋白的浓度达3.25mg/ml。根据DNA测序的结果，推得蛋白序列为SEQ ID NO1。
3HIV蛋白酶切割带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子
LD3纯化蛋白为pET32(a)/BL21系统表达，其具体制备方法详见《噬菌体展示proteinA和protein L的单结构域组合文库及亲和筛选》，生物化学与生物物理进展2005年32卷第6期535-543页。
将纯化后的LD3-CAP2NC蛋白用磷酸盐缓冲液调至5μg/μl。取LD3-CAP2NC蛋白25μg于MES缓冲液中，加入不同浓度的HIV SF2蛋白酶，混匀后于37℃孵育16h，反应完成后，每一反应体系加入20μl 2倍SDS加样缓冲液，振荡混匀后100℃加热7min，用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定切割效果。
如图9中所示2μg蛋白酶可以将LD3-CAP2NC蛋白切割成两条目的条带，大小与LD3-CAP2和NC蛋白的分子量一致，表明融合了LD3分子后，HIV蛋白酶靶分子仍可被HIVSF2株蛋白酶特异性切割。单独的LD3蛋白未见任何切割作用实施例3 HIV蛋白酶切割带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌体辣根过氧化物酶标记鼠抗M13噬菌体单克隆抗体(anti-M13-HRP monoclonalconjugate)购自Amersham Pharmacia公司。
将pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体用2×YT培养液均调整至1.0×1012TU/ml后，分别取噬菌体100μl，加固相包被的人IgG抗体反应孔中，37℃孵育3h后洗涤10次。每孔加入不同稀释度的HIV SF2蛋白酶，37℃孵育4h后洗涤10次。反应后，在样品孔中每孔加抗M13噬菌体酶标抗体，37℃孵育45min后加入TMB显色，测D450值。
如表1、图10所示，pCANTAB5S-LD3-CAP2NC可以很好的被HIV SF2蛋白酶切割，在蛋白酶浓度分别为10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml时，HIV SF2蛋白酶切割噬菌体pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的切割率分别为80％、53％、24％，且与HIV SF2蛋白酶浓度呈相关关系(0.05＞P＞0.02)，表现出较好的特异性作用。
加入HIV SF2蛋白酶后，结合于板上的pCANTAB5S-LD3数量也有减少，但在10ug/ml蛋白酶时最多仅减少了约61％，小于HIV SF2蛋白酶切割pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的相应切割率，并且减少程度与HIV SF2蛋白酶浓度无相关关系，说明二者没有表现出特异性的作用。
表1 不同剂量HIV SF2蛋白酶切割噬菌体表面的CAP2NC(D450)
噬菌体pCANTAB5S的制备在《新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建》，安徽医科大学学报，2004年第39卷第2期83-86页中有详细描述。
实施例4 应用带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶靶分子的噬菌体检测HIV蛋白酶抑制剂类药物对HIV蛋白酶切割活性的抑制作用将pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体用2×YT培养液均调整至1.0×1012TU/ml后，分别取噬菌体100μl，加固相包被的人IgG抗体反应孔中，37℃孵育3h后洗涤10次。每孔加入不同稀释度的HIV SF2蛋白酶，分成两组，一组中加入Indinavir至3μg/ml，另一组不加Indinavir，37℃孵育3h后洗涤10次。每孔加入不同稀释度的HIV SF2蛋白酶，37℃孵育4h后洗涤10次。在样品孔中每孔加抗M13噬菌体酶标抗体，37℃孵育45min后加入TMB显色，测D450值。
如表2、图11所示，同时加入HIV SF2蛋白酶与Indinavir组，结合于板上的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC数量明显高于仅加入HIV SF2蛋白酶组，且与对照组结合于板上噬菌体数量相当，说明蛋白酶抑制剂特性抑制蛋白酶对CAP2NC的特异切割。Indinavir同样抑制蛋白酶对LD3的非特异切割。
表2 Indinavir对HIV SF2蛋白酶切割展示HIV CAP2NC蛋白的重组噬菌体的作用
噬菌体pCANTAB5S的制备在《新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建》，安徽医科大学学报，2004年第39卷第2期83-86页中有详细描述。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子、其制备方法及应用<130>PCNTJ070127<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>516<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的氨基酸序列<400>1Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala1 5 10 15Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly20 25 30Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu35 40 45Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr50 55 60Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn65 70 75 80Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met85 90 95Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys100 105 110Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu115 120 125Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu130 135 140Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly145 150 155 160Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala
165 170 175Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr180 185 190Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala195 200 205Gly Glu Leu Arg Ser Arg Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met210 215 220Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val225 230 235 240Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala245 250 255Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr260 265 270Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn275 280 285Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro290 295 300Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly305 310 315 320Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro325 330 335Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu340 345 350Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg355 360 365Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys370 375 380Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr385 390 395 400Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu405 410 415Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys420 425 430Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Gly Gly Glu Ala435 440 445
Met Ser Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn450 455 460Phe Arg Asn Gln Arg Lys Ile Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu465 470 475 480Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp485 490 495Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln500 505 510Ala Asn Val Asp515<210>2<211>1548<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶靶分子LD3-CAP2NC的cDNA序列<400>2aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca 180gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgatgc gcaacaaaat 240aacttcaaca aagatcaaca aagcgccttc tatgaaattt tgaacatgcc taacttaaac 300gaagcgcaac gcaatggttt cattcaaagt cttaaagacg atccaagcca aagcactaac 360gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa tctcaagcac cgaaagagct caaagaaaaa 420acaccagaag aaccaaaaga agaagttact attaaagcaa acttaatcta tgcagatgga 480aaaacacaaa cagcagaatt caaaggaaca tttgaagaag caacagcaga agcatacaga 540tatgctgact tattagcaaa agaaaatggt aaatatacag tagacgttgc agataaaggt 600tatactttaa atattaaatt tgctggagag ctcaggtcta gaccgatcgt tcagaacatc 660cagggtcaga tggttcacca ggctatctct ccgcgtaccc tgaacgcttg ggttaaagtt 720gttgaagaaa aagctttctc tccggaagtt atcccgatgt tctctgctct gtctgaaggt 780gctaccccgc aggacctgaa caccatgctg aacaccgttg gtggtcacca ggctgctatg 840cagatgctga aagaaaccat caacgaagaa gctgctgaat gggaccgtgt tcacccggtt 900cacgctggtc cgatcgctcc gggtcagatg cgtgaaccgc gtggttctga catcgctggt 960accacctcta ccctgcagga acagatcggt tggatgacca acaacccgcc gatcccggtt1020
ggtgaaatct acaaacgttg gatcatcctg ggtctgaaca aaatcgttcg tatgtactct1080ccgacctcta tcctggacat ccgtcagggt ccgaaagaac cgttccgtga ctacgttgac1140cgtttctaca aaaccctgcg tgctgaacag gcttctcagg aagttaaaaa ctggatgacc1200gaaaccctgc tggttcagaa cgctaacccg gactgcaaaa ccatcctgaa agctctgggt1260ccggctgcta ccctggaaga aatgatgacc gcttgccagg gtgttggtgg tccgggtcac1320aaagctcgtg ttggtggtga agctatgtct caggttacca actctgctac catcatgatg1380cagcgtggta acttccgtaa ccagcgtaaa atcgttaaat gcttcaactg cggtaaagaa1440ggtcacaccg ctcgtaactg ccgtgctccg cgtaaaaaag gttgctggaa atgcggtaaa1500gaaggtcacc agatgaaaga ctgcaccgaa cgtcaggcta acgtcgac 1548<210>3<211>755<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3tctagaccga tcgttcagaa catccagggt cagatggttc accaggctat ctctccgcgt 60accctgaacg cttgggttaa agttgttgaa gaaaaagctt tctctccgga agttatcccg120atgttctctg ctctgtctga aggtgctacc ccgcaggacc tgaacaccat gctgaacacc180gttggtggtc accaggctgc tatgcagatg ctgaaagaaa ccatcaacga agaagctgct240gaatgggacc gtgttcaccc ggttcacgct ggtccgatcg ctccgggtca gatgcgtgaa300ccgcgtggtt ctgacatcgc tggtaccacc tctaccctgc aggaacagat cggttggatg360accaacaacc cgccgatccc ggttggtgaa atctacaaac gttggatcat cctgggtctg420aacaaaatcg ttcgtatgta ctctccgacc tctatcctgg acatccgtca gggtccgaaa480gaaccgttcc gtgactacgt tgaccgtttc tacaaaaccc tgcgtgctga acaggcttct540caggaagtta aaaactggat gaccgaaacc ctgctggttc agaacgctaa cccggactgc600aaaaccatcc tgaaagctct gggtccggct gctaccctgg aagaaatgat gaccgcttgc660cagggtgttg gtggtccggg tcacaaagct cgtgttggtg gtgaagctat gtctcaggtt720accaactctg ctaccatcat gatgcagcgt ggtaa 755<210>4<211>177<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4atcatgatgc agcgtggtaa cttccgtaac cagcgtaaaa tcgttaaatg cttcaactgc60
ggtaaagaag gtcacaccgc tcgtaactgc cgtgctccgc gtaaaaaagg ttgctggaaa120tgcggtaaag aaggtcacca gatgaaagac tgcaccgaac gtcaggctaa cgtcgac 177<210>5<211>34<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>5gggggtcgac gttagcctga cgttcggtgc agtc 34<210>6<211>57<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>6ggtctagacc gatcgttcag aacatccagg gtcagatggt tcaccaggct atctctc 57<210>7<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>7cttgggttaa agttgttgaa gaaaaagctt tctctccgga agttatcccg atgtt 55<210>8<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>8aggtgctacc ccgcaggacc tgaacaccat gctgaacacc gttggtggtc accag 55<210>9<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>9ctgaaagaaa ccatcaacga agaagctgct gaatgggacc gtgttcaccc ggttc 55<210>10<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>10ctccgggtca gatgcgtgaa ccgcgtggtt ctgacatcgc tggtaccacc tctac 55<210>11<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>11cggttggatg accaacaacc cgccgatccc ggttggtgaa atctacaaac gttgg 55<210>12<211>55<212>DNA<213>artificial sequence
<220>
<223>引物<400>12aacaaaatcg ttcgtatgta ctctccgacc tctatcctgg acatccgtca gggtc 55<210>13<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>13gtgactacgt tgaccgtttc tacaaaaccc tgcgtgctga acaggcttct cagga 55<210>14<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>14gaccgaaacc ctgctggttc agaacgctaa cccggactgc aaaaccatcc tgaaa 55<210>15<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>15cctggaagaa atgatgaccg cttgccaggg tgttggtggt ccgggtcaca aagct 55<210>16<211>55<212>DNA
<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>16ttcaacaact ttaacccaag cgttcagggt acgcggagag atagcctggt gaacc 55<210>17<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>17ggtcctgcgg ggtagcacct tcagacagag cagagaacat cgggataact tccgg 55<210>18<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>18tcgttgatgg tttctttcag catctgcata gcagcctggt gaccaccaac ggtgt 55<210>19<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>19ttcacgcatc tgacccggag cgatcggacc agcgtgaacc gggtgaacac ggtcc 55<210>20<211>55
<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>20ggttgttggt catccaaccg atctgttcct gcagggtaga ggtggtacca gcgat 55<210>21<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>21tacatacgaa cgattttgtt cagacccagg atgatccaac gtttgtagat ttcac 55<210>22<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>22gaaacggtca acgtagtcac ggaacggttc tttcggaccc tgacggatgt ccagg 55<210>23<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>23gaaccagcag ggtttcggtc atccagtttt taacttcctg agaagcctgt tcage 55<210>24
<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>24atcatttctt ccagggtagc agccggaccc agagctttca ggatggtttt gcagt 55<210>25<211>56<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>25gttggtaacc tgagacatag cttcaccacc aacacgagct ttgtgacccg gaccac 56<210>26<211>58<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>26atcatgatgc agcgtggtaa cttccgtaac cagcgtaaaa tcgttaaatg cttcaact58<210>27<211>59<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>27ctcgtaactg ccgtgctccg cgtaaaaaag gttgctggaa atgcggtaaa gaaggtcac 59
<210>28<211>58<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>28ggagcacggc agttacgagc ggtgtgacct tctttaccgc agttgaagca tttaacga58<210>29<211>59<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>29gggtcgacgt tagcctgacg ttcggtgcag tctttcatct ggtgaccttc tttaccgca 59<210>30<211>28<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>30ggaggccttc tagaccgatc gttcagaa 28<210>31<211>50<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>31gttaccacgc tgcatcatga tggtagcaga gt tggtaacc tgagacatag50
<210>32<211>25<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>引物<400>32ggggggatcc ccggcctcta gagag2权利要求
1.一种重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子，其特征在于，它是SEQID NO1所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的蛋白。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，它是SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于，它表达权利要求1所述的蛋白。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的多核苷酸以及与该多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
6.如权利要求4或5所述的载体，其特征在于，所述载体为原核载体。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述原核载体为pQE30。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4-7中任一权利要求所述的表达载体所转化。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为原核细胞。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于所述原核细胞为大肠杆菌。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于所述大肠杆菌为M15。
12.一种重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子的制备方法，其特征在于，该方法包含(1)在适合表达权利要求1所述的蛋白的条件下，培养权利要求8-11中任一权利要求所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有免疫球蛋白结合活性的且可被HIV蛋白酶切割的多肽。
13.权利要求1所述的蛋白作为底物用于体外HIV蛋白酶的切割。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，将所述蛋白用于检测HIV蛋白酶的活性。
15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，将所述蛋白用于筛选HIV蛋白酶抑制剂。
16.如权利要求13-15中任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述的HIV蛋白酶为HIV SF2株蛋白酶。
17.一种噬菌体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的多核苷酸以及与该多核苷酸序列操作性相连的调控序列。
18.如权利要求17所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为PCANTAB5S。
19.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求17或18所述的噬菌体所转化。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为原核细胞。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于所述原核细胞为大肠杆菌。
22.如权利要求21所述的宿主细胞，其特征在于所述大肠杆菌为TG1。
23.如权利要求17或18所述的噬菌体的制备方法，其特征在于，该方法包含(1)在适合培养带有进化免疫球蛋白结合分子的展示HIV蛋白酶底物分子的噬菌体的条件下，培养权利要求19-22中任一权利要求所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有免疫球蛋白结合活性且可被HIV蛋白酶切割的噬菌体。
24.如权利要求17或18所述的噬菌体用于体外结合免疫球蛋白并被HIV蛋白酶切割。
25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，将所述噬菌体用于检测HIV蛋白酶的活性。
26.如权利要求24所述的用途，其特征在于，将所述蛋白用于筛选HIV蛋白酶抑制剂。
27.如权利要求24-26中任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述的HIV蛋白酶为HIV SF2株蛋白酶。
全文摘要
本发明涉及新型HIV蛋白酶切割模型的体系构成、制备方法及应用。本发明公开一种重组的带有进化免疫球蛋白结合分子的HIV蛋白酶底物分子，它是SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白。本发明还公开了上述蛋白的制备方法及应用。本发明还公开了展示上述蛋白的噬菌体、其制备方法及应用。本发明公开的HIV蛋白酶切割模型具有简便快速的特点，可用于HIV蛋白酶活性鉴定，HIV蛋白酶对蛋白酶抑制剂类药物敏感性的鉴定以及HIV蛋白酶抑制剂类药物的筛选与鉴定。
文档编号C07K14/005GK101045748SQ20071003773
公开日2007年10月3日 申请日期2007年2月28日 优先权日2007年2月28日
发明者潘卫, 贾建安, 周波, 蒋少华, 陈秋莉, 曹洁, 赵平, 潘欣, 温宗梅, 戚中田 申请人:中国人民解放军第二军医大学