专利名称：新型的免疫刺激分子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及新型的免疫刺激分子(Immune Stimulation Molecules，ISM)及其制备方法，更具体地说，涉及具有特定功能基序的寡核苷酸、寡核苷酸功能基序的连结方式及其制备方法。
背景技术：
近年来研究发现，细菌DNA和人工合成的寡脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotide，ODN)具有免疫刺激活性，序列中均含有未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸基序，其研究成为当今颇具希望的前沿领域之一。
含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸-DNA的发现遗传信息DNA除编码基因物质之外，还有直接的免疫刺激作用。约七十年前问世的福氏佐剂(Freund′s adjuvant)包括多种免疫刺激物质，推测细菌(灭活的结核杆菌)DNA成份可能是其中之一。上世纪七十年代，牛型分枝杆菌的卡介苗(BCG)对动物和人肿瘤的治疗作用引起研究者的关注。1984年，Tokunaga等发现从BCG中提纯的核酸具有抗肿瘤作用，称其为MY-1。它刺激脾细胞分泌干扰素(IFN)和增强自然杀伤细胞(NK)的活性，使肿瘤缩小。研究还发现MY-1的生物活性能被DNA酶消化而失活。Yamamoto等人继续以诱导IFN分泌和刺激NK活性为标准，终于从MY-1中鉴定出一种由45个碱基组成的寡脱氧核苷酸(在本括号中加入文献信息，书写格式有参考)。其后，他们又根据编码BCG蛋白的cDNA合成了不同的ODN，针对ODN免疫学研究发现并非所有的ODN均可刺激机体免疫反应，只有那些含一个或多个回文序列(palindromic sequence)的ODN才具有免疫学活性(在本括号中加入文献信息，书写格式有参考)。经过深入研究，最终发现所有刺激性回文序列均含有未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸组成的二核苷酸(在本括号中加入文献信息，书写格式有参考)。
另一项有重要意义的研究源于Missena等人的工作(在本括号中加入文献信息，书写格式有参考)。他们发现细菌DNA在体外具有B淋巴细胞有丝分裂原的作用，而来自脊椎动物的DNA则无此作用。如果将细菌DNA的胞嘧啶核苷酸甲基化后，也完全失去了对B淋巴细胞的有丝分裂原作用。在此实验基础上的研究最终认识到细菌、病毒和无脊椎动物富含未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸结构，而脊椎动物除所含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸相对缺乏外，其胞嘧啶每5位碳原子多为甲基化。一般而言，前者未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸结构为后者的100倍之多。这提示，在长期的进化过程中，脊椎动物DNA所形成的这种有别于细菌DNA的结构特征有其重要的生物学意义。即通过识别未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸，辩别细菌、病毒等外源DNA，并对其产生免疫反应。Krieg等将纯化B细胞与各种来源的DNA共同培养，仅细菌DNA和末甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸组成的ODN具有刺激作用。若将细菌DNA及ODN先用甲基化酶处理，或将其序列替换成鸟嘌呤和胞嘧啶二核苷酸或其它序列，则失去激活作用，表明激活B细胞是未甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸特异的(在本括号中加入文献信息，书写格式有参考)。进一步研究发现，当此二核苷酸5′端接二个嘌呤、3′端接二个嘧啶时，刺激作用最强(在本括号中加入文献信息，书写格式有参考)。从而证实，细菌DNA中未甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸基序具有免疫刺激作用。
胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸-ODN序列活性的研究哺乳动物可以识别未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸基序，诱生免疫应答。所述的基序由位于中央的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸、5′端二个嘌呤、3′端二个嘧啶组成的六碱基序列。有三项重要发现极大地、有效地促进了人工合成ODN的迅速发展。其一，以硫代磷酸酯(Phosphorothionate)为支架的ODN有很强的抗核酸酶作用，从而保持其活性；其二，刺激人免疫反应最强的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸基序为5′GTCGTT 3′，刺激鼠免疫反应最强的基序为5′GTCGTT 3′；第三，最有效的ODN一般含有2-3个所述的基序，含有3个所述基序的ODN并不能进一步增强其活性，而只含有1个基序的ODN的免疫活性又太低。因此，人工合成的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸-ODN大都是在22个碱基以上，由硫代磷酸化修饰、含有2-3个5′GTCGTT 3′基序。
北京万赛生物医药技术发展有限公司自成立之始，不失时机地倾力研究胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸-ODN的化学、免疫和毒理，取得大量有价值的资料。依上述三项原则，合成了数十种序列不同的ODN之后，最终筛选出作用较强的ISM系列作为免疫刺激剂进一步开发。研究结果表明，ISM颇具临床潜力，显示出较好的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种免疫调节分子，它具有功能基序5′GTCGTT 3′。
优选地，本发明的免疫调节分子是以硫代磷酸酯为支架的寡脱氧核苷酸。
更优选地，本发明的免疫调节分子中含有2-3个所述的功能基序。
最优选地，本发明的免疫调节分子具有SEQ ID NO.1～14中的任意一个所述的序列。
本发明还提供了上述免疫调节分子在制备用于治疗和/或预防免疫性疾病的药物中的应用。
优选地，上述的药物还含有其它具有治疗和/或预防疾病功能的活性成分。更优选地，所述的活性成分是疫苗。特别优选地，所述的疫苗是下述疫苗中的一种或多种甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、流感疫苗、艾滋病疫苗、脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、肺炎疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗。
优选地，上述的免疫性疾病是肿瘤、自身免疫病、病毒感染性疾病或细菌感染性疾病。
本发明还提供了一种合成上述的免疫调节分子的方法，其中包括下面的A组或者B组步骤A组a)将带保护的脱氧核糖核苷酸单体脱保护；b)与新加入的碱基进行耦联反应；c)封闭碱基上的未反应的5’-OH；d)使核苷酸间的亚磷酸三酯进行氧化反应，生成磷酸三酯；e)合成循环。
B组a)将带保护的脱氧核糖核苷酸单体脱保护；b)与新加入的碱基进行耦联反应；c)将碱基间磷酸上的一个氧用硫取代；d)封闭碱基上的未反应的5’-OH；e)合成循环。
实验证明，ISM有激活细胞免疫的作用、促进巨噬细胞的吞噬作用。ISM作为佐剂与抗原类物质合用时，也能加强特异性细胞免疫反应、巨噬细胞的吞噬作用。ISM的特点在于加强细胞免疫，尤其在免疫力低下时更具有现实意义，针对广大免疫力低下人群具有治疗的效应。一般的抗原物质主要是激发生物机体的体液免疫途径，而ISM则会激发细胞免疫，因此可与疫苗同时应用。
具体实施例方式
下面以实施例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。
实施例1 ISM系列寡核苷酸的合成及纯化原理采用亚磷酸三酯固相仪器合成法，一个核苷上的活性3’-磷酸基团与另一个核苷上的5’-OH耦联。前者是在溶液中传送的单体，后者被固定在固相载体上，核苷酸间的键因此形成。为了下一步耦联，使DNA链增长，必须有另外三个化学反应。用这种方法，每完成一个合成循环，就增加一个核苷单体。所需要的序列及长度由合成仪来控制。
当链完成时，粗品DNA(寡核苷酸)必须从载体上切割下来，并脱去保护基，然后还需要合适的分离纯化方法，才能得到所需纯度的DNA产品。
合成方法原料结合有所要合成的目的物3’末端碱基的可控孔玻璃珠(controled pore glass，ISM)、四种带保护的脱氧核糖核苷酸单体(A、T、C、G)、以及其他一些必需试剂。
a)脱保护，用三氯乙酸或者二氯乙酸将核苷酸单体上5’-OH末端用来封闭5’-OH的dmt基团脱掉，使5’-OH暴露出来，准备下一部反应。
b)耦联，核苷酸单体上的5’-OH暴露出来后，先加入四唑将其活化，然后同时再加入四唑和核苷酸单体，使活化的5’-OH与新加入的单体反应，这样就生成了多一个碱基的寡核苷酸链。
c)封闭，由于有机合成反应进行的不完全性，所以在上一步反应中，有部分5’-OH并未参与反应。为了保证合成序列的完整性、减少合成产物中的杂质，需要将这部分未反应的5’-OH封闭起来。乙酐和1-甲基咪唑同时输送到反应容器中，将反应生成一种强有力的乙酰化试剂。这种乙酰化试剂与未反应的5’-OH反应使其失活无法参加下一步反应，从而减少了终产物中的杂质。
d)氧化，耦联反应中生成的核苷酸间的键是一个亚磷酸三酯，亚磷酸酯键非常不稳定，很容易被酸和碱切断。因此，封闭后的亚磷酸三酯键需要立即被氧化成稳定的磷酸三酯。碘在碱性四氢呋喃溶液中作为一种温和的氧化剂，可以完成这步反应。
e)硫代，生物体内的很多酶都可以分解外来的DNA。但是，如果把碱基间磷酸上的一个氧用硫取代，生成硫代磷酸酯寡核苷酸，就可以增加DNA在生物体内的稳定性。二硫代四乙基硫脲在室温下可以完成这步反应。如果需要硫代的话，就要去掉氧化这一步，并且将硫代放到封闭之前进行。
f)合成循环，氧化后，核苷酸加成的一个循环就完成了，寡聚物的5’末端被保护基保护。通过第一步脱保护，然后重复后面的碱基加成，继续DNA合成的另一个循环，直到特定长度的DNA完全合成为止。结束合成时，通过仪器确定最后一个碱基5’末端保护基是保留还是除去。
切割和脱保护将反应后的容器取下，取出里面的ISM，按一定的比例加入浓氨水，在密闭容器中于55℃水浴保温8-15小时或80℃保温2-3小时。可以同时将DNA从固相载体上切割下来，并且切去碱基上的保护基。
定量和贮存通过测定260nm处的光吸收值就可以将其定量。
可以将氨解后的产品抽干放置于-20℃冻存，或者氨解后直接冻存在-20℃。
分离与纯化氨解后的样品使用0.45um的滤膜过滤除去ISM后，就可以使用制备型HPLC将其分离纯化。
流动相0.1M的醋酸三乙胺，与乙腈组成混合流动相，梯度洗脱就可以达到分离纯化的目的。根据不同的序列以及长度，需要微调乙腈的起始以及终止浓度，可以分离得到纯度大于95％的产品。
ISM的质量标准a)保证寡核苷酸序列的正确性。寡核苷酸的序列分析方法主要包括改进的Maxam-Gilbert化学测序法、质谱法、紫外或HPLC碱基分析法；b)理化特性的测定。对寡核苷酸的长度、序列、均一性、修饰基团等理化特性进行分析，便于安全有效地使用，分析方法主要包括高效液相色谱(HPLC)法、毛细管电泳(CE)法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法、紫外分光光度法；
c)生物学活性的测定，一般包括细胞培养、转染、断续培养、评价药物作用等步骤；d)安全性的评价，除了保证无病毒、无菌、无致热原、无致敏原等一般安全要求外，还要保证无致突变、无致癌、无致畸等要求；e)稳定性的评价，要使用理化、生化和免疫化学分析技术对活性成分的理化及生物学活性等方面的变化情况进行全面的检测，并准确检测在储存过程中由于氧化、聚合或降解等所造成的变化，方法包括电泳(PAGE)、高分辨率的HPLC、CE以及MS、NMR分析等。
上述质量控制项目的标准如表1所示。
表1 ISM常规质量控制项目检测项目 检测方法 标准规定寡核苷酸的序列分析改进的Maxam-Gilbert化样品应与对照品一致学测序法质谱法 样品应与对照品一致与靶基因的杂交性质紫外分光光度法 50-70℃纯度分析 高效液相色谱法 不低于95.0％毛细管电泳法或SDS- 不低于95.0％PAGE法紫外分光光度法样品应与对照品一致修饰基团的结合率 离子交换高效液相色谱法不低于90％失败序列 IP-HPLC法或CE法 不超过5％PH值 《中国药典》的附录方法 应为6.0-8.0溶液的澄清度与颜色 《中国药典》的附录方法 应符合规定水分 卡氏水分测定法不超过1.0％无菌试验 无菌试验方法 应符合规定本发明的免疫调节分子中的特定功能基序之间可以有若干种不同的连接方式。按照上述方法制备出的优选的免疫调节分子及其序列如表2所示。
表2优选的免疫调节分子编号 结构(5’→3’)24301TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT22301TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT22302TCGTCGTTTTGTCGTTGTCGTT20301TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT22303TCGTCGTTTTCGTTTTGTCGTT22304TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT22305TCGTCGTTTTGTCGTTTTCGTT20302GCGTCGTTGTCGTTGTCGTT19301TGTCGTTGTCGTTGTCGTT23301TGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT14201TCGTCGTTGTCGTT21301TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT22306TCGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT18301TCGTCGTTTTGTCGTTTT上述免疫调节分子的命名原则如下●自左向右的首起两位数字表示该产物核苷酸数目；●自左向右第3位数字表示该产物中包含功能基序的数目；●自左向右的最后两位为该产物的自然编码。
ISM具有明显的免疫刺激和免疫佐剂效应。我们对它的功效进行了深入的研究。实验中以ISM24301为主要实验物，并与其它ISM进行了比较。实验中分为ISM单独应用和与抗原联合应用两部分。
实施例2 ISM免疫刺激作用的功效实验为了了解ISM单独用药的免疫刺激作用，将24个连续碱基T(TTTTTTTT……)的无效序列与ISM给每只小鼠肌肉注射20μg，隔10天注射一次，连续注射3次以后，采集血清测γ-干扰素、总IgG；或制备脾细胞悬浮液作淋巴细胞转化实验；或收集腹腔巨噬细胞进行其吞噬功能的检测。
ISM增强动物的体液免疫反应γ-干扰素的检测实验方法与原理用抗小鼠γ-干扰素包被的ELISA试剂盒检测小鼠血清中的γ-干扰素含量。
干扰素是由病毒等诱导剂作用于寄生细胞而产生的一类具有生物活性的糖蛋白，有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫反应等活性。现已发现干扰素有多种，γ-干扰素是抗原刺激下淋巴细胞所产生的。干扰素具有很强的抗病毒活性，而且一种干扰素能够抑制多种病毒的增殖，在医学上是一类广谱的抗病毒药物。干扰素可治疗肝炎、流行性感冒等常见病毒性疾病，也有抗癌细胞增殖的作用，并已应用于乳腺癌、骨髓癌等多种癌症的治疗。
实验分组与结果如表3所示。
表3实验分组与结果分组例数OD值均数±标准差 配对t-test P值正常对照8 0.06350±0.03338524T-正常对照0.79324T对照 8 0.06800±0.031094ISM-正常对照0.006ISM243018 0.19825±0.091470ISM-24T0.007结论24T对照组与正常对照组比较产生的γ-干扰素增多在统计学上没有显著性意义(P＞0.05)；ISM24301与正常对照组、24T对照组比较产生的γ-干扰素增多在统计学上具有显著性意义(P＜0.05)。
血清总IgG的检测实验方法与原理用单向免疫扩散试验来定量测定小鼠血清中的IgG。
单向免疫扩散试验是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。
实验分组与结果如表4所示。
表4实验分组与结果
结论ISM24301与24T对照组比较引起的总的IgG的产生量增多在统计学上没有显著性的意义(P＞0.05)。
ISM增强动物的非特异性淋巴细胞转化率实验方法与原理T细胞能被非特异的物质如有丝分裂原ConA所激活而向淋巴母细胞转化。用MTT检测法在光学显微镜下计数转化后的淋巴细胞数。MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲簪(fromazan)产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪(490nm和630nm双波长)测量，做为MTT法的检查指标。
实验分组与结果如表5所示。
表5实验分组与结果
结论ISM24301与24T对照组比较引起的淋巴细胞转化数量的增多在统计学上具有显著性的意义(P＜0.05)，表明ISM有激活细胞免疫的作用。
ISM增强动物的巨噬细胞吞噬功能实验方法与原理巨噬细胞具有较强的吞噬功能，常用比细菌大的细胞性抗原作为被吞噬颗粒，如鸡红细胞。其检测原理是将受检细胞与适量的颗粒抗原——鸡红细胞混合后，置37℃保温0.5～1h，其间时加振摇，最后离心取测定细胞制成涂片，染色镜检，分别计数出吞噬百分数和吞噬指数。
实验分组与结果如表6所示。
表6实验分组与结果分组例吞噬百分数(％) 吞噬指数 配对t-test数均数±标准差 均数±标准差 P值正常对照1045.8800±15.779041.4440± 吞噬百吞噬指0.86411分数 数ISM243015 80.7320±12.254634.1140± 0.017 0.031.38996ISM223015 71.4520±20.635043.9620± 0.018 0.052.09611ISM203015 58.3360±16.015594.5640± 0.230 0.1042.56135ISM223035 66.5080±16.627705.8320± 0.050 0.0082.34878ISM203025 57.8840±15.957695.1800± 0.162 0.1473.00227结论ISM20301、ISM20302与正常对照动物比较吞噬百分数和吞噬指数在统计学上没有显著性意义(P＞0.05)；ISM24301、ISM22301、ISM22303与正常对照动物比较吞噬百分数和吞噬指数在统计学上具有显著性意义(P＜0.05)，表明它们可以促进巨噬细胞的吞噬作用。
ISM对免疫抑制模型动物的免疫增强作用实验方法与原理给每只小鼠一定剂量的环磷酰胺造成免疫缺陷，观察免疫刺激分子ISM各个不同序列在免疫低下动物身上的免疫反应强度。用MTT检测法在光学显微镜下计数转化后的淋巴细胞数。结果可用酶标检测仪(490nm和630nm双波长)测量，做为MTT法的检查指标。
实验分组与结果如表7所示。
表7实验分组与结果分组例(μg/只)MTT沉淀配对t-test数CYISM OD值均数±标准差 P值缺陷对照7 200 0.04880±0.035808 与免疫缺陷比较ISM243015 20300.39280±0.161083 0.012ISM223015 20300.24180±0.128085 0.052ISM203015 20300.29340±0.111285 0.019ISM223035 20300.20340±0.101318 0.051ISM203025 20300.30480±0.269402 0.124注CY环磷酰胺，隔日给药三次，抗原、ISM于CY给药后第2天、第10天给药两次，第17天采血。
结论在免疫低下条件下，ISM各种不同序列引起的淋巴细胞转化数量不同，其中ISM24301、ISM20301与对照动物比较在统计学上具有显著性意义(P＜0.05)；ISM22301、ISM22303与对照动物比较在统计学上接近有显著性意义(P＝0.05)；ISM20302与对照动物比较在统计学上没有显著性意义(P＞0.05)。说明ISM有激活细胞免疫的作用。
实施例3 ISM作为佐剂加强特异性免疫反应的功效实验与抗原类物质合用增强动物的体液免疫反应特异性抗体、特异性抗体亚类的检测实验方法与原理1.用不同剂量配伍的乙肝抗原与免疫刺激分子(ISM)免疫小鼠后一个月左右采集血清，分装保存。用酶联免疫吸附法检测乙肝表面抗体及其亚类IgG1和IgG2α的表达强度。
2.酶联免疫吸附法的检测原理是把受检标本血清(测定其中的抗体HBsAb)与固相载体表面的抗原(HbsAg)起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅程度定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
3.特异性抗体的IgG1和IgG2α两种亚类数量的比例关系代表不同的免疫途径被启动，如果Ig Gt/Ig G2α比值大于1，说明TH2型免疫途径占优势，以体液免疫为主；如果Ig G1/Ig G2α比值小于1，说明TH1型免疫途径占优势，以细胞免疫为主。
实验分组与结果如表8-10所示。
表8特异性抗体(HBsAb)的检测结果分组 例 Ag(μg)ISM(μg)OD值均数±标两组独立样本数准差T-test P值Ag18 1 0 0.0905± 与Ag1比较0.06339 0.0019124301-59 1 5 0.61394±6.1462E-60.38822 0.0015
24301-10 9 1 10 0.41772± 1.17243E-5，0.1234522303-5 8 1 50.41256±0.2226822303-10 9 1 10 0.32539±0.08453Ag5 9 5 00.14183± 与Ag5比较0.06298 5.49071E-624301-5 5 5 50.6763± 5.08655E-70.19604 0.0085724301-10 8 5 10 0.74181±9.86676E-50.2058222303-5 9 5 50.68989±0.5453422303-10 9 5 10 0.83894±0.40192注Ag为重组乙肝疫苗，给药方式为胫骨前肌肌肉注射给药。下列各表相同。
结论在抗原剂量相同的情况下，ISM各组均较抗原对照组产生的抗体数量多，且在统计学上具有显著性意义(P＜0.05)。
表9 ELISA法检测特异性抗体(HBsAb)亚类的OD值比值(Ig G1/IgG2α)(动物分组同上)Ag1 24301-5 24301-10 22303-5 22303-102.9543570.626417 0.869876 0.876999 0.79635412.3908 0.550573 0.91494 0.991916 0.75746515.427140.856306 0.868001 0.769936 0.6022342.3802940.542002 0.668952 1.597459 0.803871
0.840074 0.7773270.9070570.7905940.615856.920872 0.7114720.5246261.1102640.7865294.558888 0.62672 0.6759370.6974780.8178289.11708740.4606510.7591790.7131280.4497840.64357 0.575682表9(续)Ag5 24301-5 24301-1022303-5 22303-102.657157 1.1421941.0941060.9786620.9531382.916078 0.9823170.6660921.3258980.8668344.52005 0.9263090.8251 0.9157830.8165337.179487 1.3170370.9759110.8271110.91452410.815 0.9520411.1416960.7657237.448276 0.8873851.2171520.9333249.550082 0.9452140.9522491.10327823.23404 1.0666310.9385140.8266431.2319950.702096结论抗原对照组Ag1和Ag5组内绝大多数动物Ig G1/Ig G2α比值都大于1，说明抗原给药只引起TH2型的体液免疫反应；而抗原与ISM联合给药各组内绝大多数动物Ig G1/Ig G2α比值都小于1，说明抗原与ISM联合给药引起了TH1型的细胞免疫反应。
表10不同ISM序列的特异性抗体检测分组例Ag ISMOD值均数±标准差 配对T-test P值数Ag 105μg0 0.19200±0.113069与Ag比较ISM243015 5μg20μg 1.43160±0.5661300.012ISM223015 5μg20μg 0.57260±0.2293220.031
ISM2030155μg20μg0.43740±0.191341 0.032ISM2230355μg20μg0.36760±0.043793 0.019ISM2030255μg20μg0.61580±0.187161 0.023结论合用不同的ISM各序列与单用抗原比较产生的特异性抗体数量增多均在统计学上具有显著性意义(P＜0.05)γ-干扰素的检测实验方法与原理用抗小鼠γ-干扰素包被的ELISA试剂盒检测小鼠血清中的γ-干扰素含量。
实验分组与结果如表11所示。
表11实验分组与结果分组 例数Ag ISMOD值均数±标准配对t-test P差值Ag 10 5μg0 0.30015±V-ISM50.075492 0.002ISM24301-5 10 5μg5μg 0.42515±V-ISM300.0000.106407ISM24301-3010 5μg30μg 0.70670± ISM5-ISM300.084270 0.000注给药程序----隔周给药两次后过一周采血。
结论合用小剂量ISM24301(5μg)比单用抗原引起的γ-干扰素分泌增多在统计学上具有显著性意义(P＜0.05)；合用大剂量ISM24301(30μg)比单用抗原引起的γ-干扰素分泌增多在统计学上具有极其显著性的意义(P＜0.001)；合用大剂量ISM24301(30μg)比合用小剂量ISM24301(5μg)引起的γ-干扰素分泌增多在统计学上具有极其显著性的意义(P＜0.001)血清总IgG的检测实验方法与原理1.用单向免疫扩散试验来定量测定小鼠血清中的IgG。
实验分组与结果如表12所示。
表12实验分组与结果分组例 抗原(μg) ISM(μg) 沉淀环直径(mm)均数 配对t-test数 ±标准差P值Ag 6 5 0 13.200±0.305ISM243016 5 2010.683±1.2656 0.000结论合用ISM24301比单用抗原引起的总的IgG的产生量增多在统计学上具有极其显著性的意义(P＜0.001)。
与抗原类物质合用增强动物的非特异性淋巴细胞转化率实验方法与原理T细胞能被非特异的物质如有丝分裂原ConA所激活而向淋巴母细胞转化。用MTT检测法在光学显微镜下计数转化后的淋巴细胞数。MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲簪(fromazan)产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪(490nm和630nm双波长)测量，做为MTT法的检查指标。
实验分组与结果如表13所示。
表13实验分组与结果分组例数抗原(μg)ISM(μg)MTT沉淀 配对t-testOD值均数 P值±标准差Ag 8 50 0.37700±0.209145 0.036ISM243018 520 0.74738±0.295753
结论合用ISM24301比单用抗原引起的淋巴细胞转化数量的增多在统计学上具有显著性的意义(P＜0.05)。
与抗原类物质合用增强动物的巨噬细胞吞噬功能实验方法与原理巨噬细胞具有较强的吞噬功能，常用比细菌大的细胞性抗原作为被吞噬颗粒，如鸡红细胞。其检测原理是将受检细胞与适量的颗粒抗原——鸡红细胞混合后，置37℃保温0.5～1h，其间时加振摇，最后离心取测定细胞制成涂片，染色镜检，分别计数出吞噬百分比和吞噬指数。
实验分组与结果如表14所示。
表14实验分组与结果分组 例数 抗原 ISM 吞噬百分数(％) 吞噬指数(μg)(μg) 均数±标准差 均数±标准差正常对照N 800 47.000± 0.7750±10.0780 0.33428Ag 850 56.850± 1.5537±12.5633 0.75432ISM24301 8520 74.588± 3.3088±16.1745 1.23268配对t-test P值吞噬百分数----N-Ag 0.219；Ag-ISM 0.045；吞噬指数N-Ag 0.17；Ag-ISM 0.004。
结论Ag组与正常对照组比较，吞噬百分数和吞噬指数的P值都大于0.05，说明抗原与正常对照相比引起巨噬细胞吞噬功能的增强在统计学上没有显著性意义；ISM24301组与Ag组比较，吞噬百分数和吞噬指数的P值都小于0.05，说明合用ISM24301与单用抗原比引起巨噬细胞吞噬功能的增强在统计学上具有显著性意义。
与抗原类物质合用在免疫低下动物身上的免疫增强作用实验方法与原理给每只小鼠一定剂量的环磷酰胺造成免疫缺陷，然后对比抗原Ag和免疫刺激分子ISM。
在此条件下的免疫反应强度。用酶联吸附反应试剂盒检测HbsAb的表达强度。
实验分组与结果如表15所示。
表15实验分组与结果分组 例数 (μg/只)HBsAb配对CY Ag ISM OD值均数 t-test±标准差 P值Ag7 20 5 00.06386±0.012802 0.023ISM24301 7 20 5 28 0.26943±0.183126注CY环磷酰胺，隔日给药三次，抗原、ISM于CY给药后第2天、第10天给药两次，第17天采血。
结论在免疫缺陷条件下，合用ISM24301较单用抗原引起的特异性抗体增强在统计学上具有显著性意义(P＜0.05)。
参考文献1.Tohru Tokunaga，Hirshi Yamamoto，JNCI，1984，72，955-962.
2.JOSEPH P.MESSINA，GARY S，GILKESON，and DAVID S.PISETSKY，JOURNAL OF IMMUNOLOGY，1991，147，1759-17633.Saburo Yamamoto，Toshiko Yamamoto，Shizuo Shimada，Micrpbiol.Immunol，1992，36(9)，983-997.
序列表<110>北京万赛生物医药技术发展有限公司<120>新型的免疫刺激分子及其制备方法<160>14<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3tcgtcgtttt gtcgttgtcg tt 22<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tcgtcgttgt cgttgtcgtt20
<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5tcgtcgtttt cgttttgtcg tt 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7tcgtcgtttt gtcgttttcg tt 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gcgtcgttgt cgttgtcgtt20<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>9tgtcgttgtc gttgtcgtt 19
<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>10tgtcgttttg tcgttttgtc gtt23<210>11<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>11tcgtcgttgt cgtt 14<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12tgtcgtttgt cgtttgtcgt t 21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13tcgtcgtttg tcgtttgtcg tt 22<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>14tcgtcgtttt gtcgtttt 18
权利要求
1.免疫调节分子，其特征在于，它具有功能基序5′GTCGTT 3′。
2.根据权利要求1所述的免疫调节分子，其特征在于，它是以硫代磷酸酯为支架的寡脱氧核苷酸。
3.根据权利要求1所述的免疫调节分子，其特征在于，所述的功能基序的数目为2-3个。
4.根据权利要求1所述的免疫调节分子，其特征在于，它具有SEQ IDNO.1～14中的任意一个所述的序列。
5.权利要求1～4中的任意一项所述的免疫调节分子在制备用于治疗和/或预防免疫性疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物还含有其它具有治疗和/或预防疾病功能的活性成分。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的活性成分是疫苗。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的疫苗是下述疫苗中的一种或多种甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、流感疫苗、艾滋病疫苗、脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、肺炎疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的免疫性疾病是肿瘤、自身免疫病、病毒感染性疾病或细菌感染性疾病。
10.一种合成免疫调节分子的方法，其中包括下面的A组或者B组步骤A组a)将带保护的脱氧核糖核苷酸单体脱保护；b)与新加入的碱基进行耦联反应；c)封闭碱基上的未反应的5’-OH；d)使核苷酸间的亚磷酸三酯进行氧化反应，生成磷酸三酯；e)合成循环。B组a)将带保护的脱氧核糖核苷酸单体脱保护；b)与新加入的碱基进行耦联反应；c)将碱基间磷酸上的一个氧用硫取代；d)封闭碱基上的未反应的5’-OH；e)合成循环。
全文摘要
本发明提供了一种免疫调节分子，它具有功能基序5′GTCGTT 3′。免疫调节分子优选地是以硫代磷酸酯为支架的寡脱氧核苷酸，更优选地含有2－3个所述的功能基序。本发明的免疫调节分子最优选地具有SEQ ID NO.1～14中的任意一个所述的序列。本发明还提供了上述免疫调节分子的制备方法及其在制备用于治疗和/或预防免疫性疾病的药物中的应用。
文档编号A61K39/12GK1660881SQ20051000191
公开日2005年8月31日 申请日期2005年1月12日 优先权日2005年1月12日
发明者李求是 申请人:北京万赛生物医药技术发展有限公司