一种ctla4抗体、其药物组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种CTLA4抗体、其药物组合物及 其用途。具体地，本发明涉及一种CTLA4的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002] 细胞毒性T淋己细胞相关抗原-4(c}ftotoxic TIympho巧te sociated antigen4, 亦简称为CTLA4)与CD28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达具有十分 相近的关系，都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活T细胞表面。但是作为淋己细 胞激活的共刺激信号，CTLA4与CD28分子的功能是相反的，CTLA4与B7结合后能抑制小鼠 和人T细胞的激活，在T细胞活化中起负调节作用。
[0003] CTLA4mAb或CTLA4配体可W阻止CTLA4与其天然配体结合，从而封闭CTLA4对 T细胞负性调节信号的传导，增强T细胞对各种抗原的反应性，在送方面体内与体外研究 结果基本一致。目前已有CTLA4mAb处于临床试验阶段用于治疗前列腺癌，膀脫癌，结肠直 肠癌，胃肠道癌，肝癌，恶性黑色素瘤等（GrossoJF.，化re-KunkelMN.，CTLA-4blockade intumormodels:anoverviewofpreclinicalandtranslationalresearch.Cancer Tmmun 2013 ; 13:5.E；pub2013Jan22)。
[0004] 白细胞介素2(比-2)由T细胞产生，是调节T细胞亚群的生长因子，也是调控免 疫应答的重要因子，并可促进活化B细胞增殖，参与抗体反应、造血和肿瘤监视。重组的人 IL-2已经被美国抑A批准用于治疗恶性肿瘤（包括黑色素瘤、肾肿瘤等），同时正在进行 治疗慢性病毒感染的临床研究（Qiavez,A.R.,etal.,Pharmacologica血inistrationof interleukin-2.AnnNYAcadSci，2009. 1182:p. 14-27)。体外实验中，CTLA4mAb可特异 地解除CTLA4对机体免疫抑制，激活T细胞，诱导IL-2产生，在抗肿瘤及寄生虫等疾病的基 因治疗中有广泛应用前景。
[0005] CTLA4及CTLA4mAb作为T细胞功能状况的重要影响因素，通过干预机体免疫微环 境，可对疾病产生特异性治疗作用，并发挥较高疗效，补充传统用药的不足，由此开辟基因 治疗的新途径。CTLA4及CTLA4mAb应用于试验及临床各阶段；如在自身免疫性疾病中有效 抑制哮喘动物模型的气道高反应性、阻止风湿性疾病的发展W及在同种异体移植中介导机 体免疫耐受等。但同时，尽管生物基因治疗在短期临床试验研究中未发现不良反应，我们亦 应注意到其长期应用所存在的潜在影响，如CTLA4mAb过度阻断CTLA4-B7信号则可导致自 身免疫性疾病的发生。由于抗体可W特异结合其配体并导致祀细胞溶解或阻断病理进程， 所W抗体尤其人源性抗体药物的开发利用对人类恶性肿瘤及其他免疫性疾病临床治疗有 重要意义。
[0006] 目前，尚需要开发新的阻断CTLA4与B7的结合的抗体及其人源化抗体。
【发明内容】
[0007] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统表达出重 组的CTLA4作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明 人通过进行对大量样本的筛选，得到了一种杂交瘤细胞株能够分泌产生与CTLA4特异性结 合的特异性单克隆抗体，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断CTLA4与B7的结合。并进 一步制得了人源化抗体。由此提供了下述发明：
[0008]本发明的一个方面涉及一种杂交瘤细胞株LTOOl(CTLA4-8D2)，其于2014年6月 18日保藏于中国典型培养物保藏中必（CCTCC)，保藏编号为CCTCCN0:C2014113,保藏地址 为中国.武汉.武汉大学，邮编；430072。
[0009] 本发明的另一方面涉及本发明的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0010] 本发明的再一方面涉及选自如下的单克隆抗体：
[0011] (1)重链可变区的氨基酸序如SEQIDNO;6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO;8 所示；
[0012] (2)重链可变区的氨基酸序如SEQIDNO=IO所示，轻链可变区的氨基酸序列如 沈QIDNO; 12所示；
[0013] (3)重链可变区的氨基酸序如SEQIDNO;14所示，轻链可变区的氨基酸序列如 沈QIDNO; 16所示；和
[0014] (4)重链可变区的氨基酸序如SEQIDNO;18所示，轻链可变区的氨基酸序列如 沈QIDNO; 20所示。
[0015] 根据本发明任一项所述的单克隆抗体，其中，其重链恒定区为小鼠抗体的重链恒 定区或人抗体的重链恒定区，其轻链恒定区为小鼠抗体的轻链恒定区或人抗体的轻链恒定 区。
[0016] 本发明的再一方面涉及一种分离的核酸序列或者核酸序列组合，其编码本发明任 一项所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区；具体地，所述核酸序列或核酸序列组 合选自如下的（1)至（4);
[0017] (1)沈Q ID N0;5(编码重链可变区），沈Q IDN0;7(编码轻链可变区）；
[001引 （2)SEQIDNO;9(编码重链可变区），SEQIDNO;11 (编码轻链可变区）；
[0019] (3)SEQID NO; 13 (编码重链可变区），SEQIDNO; 15 (编码轻链可变区）；和
[0020] (4)沈QIDNO; 17 (编码重链可变区），沈QIDNO; 19 (编码轻链可变区）。
[0021] 本发明的再一方面涉及一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其 中，所述单克隆抗体为本发明中任一项所述的单克隆抗体，所述偶联部分为选自放射性核 素、药物、毒素、细胞因子、酶、英光素、和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为 藍麻毒素；更具体地，所述偶联部分为藍麻毒素A链。
[0022] 本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有本发明中任一项所述的单克隆抗 体或者本发明的单克隆抗体偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体或辅料。
[0023] 本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明的单克隆 抗体偶联物在制备预防和/治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述肿瘤选 自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀脫癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
[0024] 本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明的单克隆 抗体偶联物在制备如下药物中的用途：
[0025] 阻断CTLA4与B7结合的药物、调节（例如下调）CTLA4活性或CTLA4水平的药物、 解除CTLA4对机体免疫抑制的药物、激活T淋己细胞的药物或者提高T淋己细胞中IL-2表 达的药物。
[0026] 本发明的再一方面涉及一种预防和/治疗和/或辅助治疗肿瘤的方法，包括使用 有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或者本发明的单克隆抗体偶联物的步骤；具体 地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀脫癌、结肠直肠癌、胃肠道癌和肝癌。
[0027] 本发明的再一方面涉及一种在体内或体外方法，包括使用有效量的本发明中任一 项所述的单克隆抗体或者本发明任一项所述的单克隆抗体偶联物的步骤，所述方法选自如 下：
[0028] 阻断CTLA4与B7结合的方法、调节（下调）CTLA4活性或CTLA4水平的方法物、解 除CTLA4对机体免疫抑制的方法、激活T淋己细胞的方法或者提高T淋己细胞中IL-2表达 的方法。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，所述方法是非治疗目的的。
[0030] 在本发明中，术语ECg。是指半最大效应浓度（concentrationfor50 %of maximaleffect)，是指能引起50 %最大效应的浓度。
[0031] 本发明中，如果没有特别说明，所述B7为B7-1和/或B7-2 ;其具体蛋白序列为现 有技术中已知序列，可W参考现有文献或者GenBank中公开的序列。例如，B7-1 (CD80,NCBI GeneID:941) ；B7-2(CD86,NCBIGeneID:942)〇
[0032] 发明的有益效果
[0033] 本发明的单克隆抗体8D2能够很好地特异性与CTLA4结合，并且能够十分有效地 阻断化TA4与B7的结合，特异地解除CTLA4对机体免疫抑制，激活T淋己细胞。
【附图说明】
[0034] 图1;CTLA4ECD-mFc融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品 及其上样量依次为；M;markerl0UL;CTLA4ECD-mFc融合蛋白1Ug;CTLA4ECD-mFc融合蛋 白 2Ug;CTLA4ECD-mFc融合蛋白 3U邑。
[0035] 图2 ;8D2抗体的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品及其上样量依 次为；M:markerlO U L ;还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体0. 3 U g ;非还原型蛋白电泳上 样缓冲液2UL ;非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体0. 3U邑。
[0036] 图3 ;8D2重组抗体（8D2巧e))的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样 品及其上样量依次为；M:markerlOUL;