一种lak细胞的诱导培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体的说是设及一种LAK细胞的诱导培养方法。
【背景技术】
[0002] LAK细胞即淋己因子激活的杀伤细胞，其是将外周血淋己细胞在体外经淋己因子 白介素-2 (比-2)激活3~5天而扩增为具有广谱抗瘤作用的一种杀伤细胞。 阳003]细胞治疗是继手术、放疗和化疗之后的有一种肿瘤治疗方法，它一般作为手术、放 化疗的辅助手段，延长患者的寿命，清除体内手术后残余的癌细胞。细胞治疗主要包括LAK 细胞治疗、CTL细胞治疗、CIK细胞治疗W及NK细胞治疗等。LAK细胞培养成本相对较低， 且细胞容易诱导和扩增，已成为临床免疫细胞治疗的主要细胞。
[0004] 然而，临床上采用LAK细胞治疗肿瘤时，需LAK细胞的数量应达到1〇1°数量级左 右，而普通的LAK细胞诱导培养方法扩增的数量有限，很难达到临床回输的要求；同时所诱 导培养的LAK细胞中的效应细胞亚群数量有限，杀伤祀细胞的能力较差。因此，必需寻找用 另一种能增强LAK细胞的增殖活性，最好同时能增强LAK细胞的杀伤能力的免疫细胞培养 方法。
【发明内容】
阳0化]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种LAK细胞的诱导培养方法，使得所述方法 能够显著提高LAK细胞的数量。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种LAK细胞的诱导培养方法，使得所述方法能够 显著增加LAK细胞中效应细胞亚群的数量，增强LAK细胞的杀伤能力。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 一种LAK细胞的诱导培养方法，包括：
[0009] 步骤1、从外周血分离出单个核细胞，同时制备胶原支备用；
[0010] 步骤2、将步骤1胶原支架平铺到细胞培养容器中，然后用免疫细胞培养基重悬单 个核细胞并接种到平铺有胶原支架的细胞培养容器中，同时补加IL-2、比-15W及0KT-3细 胞因子进行培养，定期补充疫细胞培养基和各细胞因子。
[0011] 本发明主要引入了细胞=维培养的技术思维来解决现有免疫细胞LAK细胞的技 术问题，=维培养是指将具有=维结构的载体与各种不同的种类的细胞在体外共同培养， 使细胞能够在载体的=维立体空间结构中迁移、生长，构成=维的细胞载体复合物。
[0012] 单层细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往 和体内情况不相符；动物实验虽在体内进行，但体内多种因素制约W及体内和外界环境相 互影响而不能观察到研究者最为关屯、的中间过程。因此，现有技术提出了=维细胞培养技 术模拟体内的微环境，填补了单层细胞培养和动物实验的鸿沟，主要用于医学领域的理论 研究。而本发明针对现有LAK细胞培养方式的缺点，将胶原支架引入LAK细胞的培养中， 利用胶原支架进行LAK细胞的=维培养，同时配合适宜的细胞因子，由此促进LAK细胞的增 殖，W及增加了其中效应细胞亚群的数量，增加了杀伤活性。
[0013] 在本发明中，所述外周血分离出单个核细胞可参照本领域已有的分离方法，本发 明优选为：
[0014] 外周血离屯、收集下层血细胞加生理盐水稀释，加入淋己分离液后离屯、，弃上层液 体，加水生理盐水洗涂，再次离屯、后去上清，获得单个核细胞。
[0015] 更进一步优选为：
[0016] 将外周血在400-500g离屯、力下离屯、5-lOmin，离屯、结束后将下层血细胞转移到 50血离屯、管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释。
[0017] 另取一支新的sepmate离屯、管（购自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己细胞分 离液（购自STEMCE化公司）12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离屯、管，600-800g离 屯、15-20minD
[001引离屯、后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗嫌1次，离屯、，得到PBMCd阳019] 作为优选，制备胶原支架具体为： 阳020] 将胶原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即为胶原支架，消毒后，用免疫细胞培养 基浸泡，置于4°C冰箱待用。
[002U更优选为，将胶原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即为胶原支架，利用紫外线照 射胶原支架材料，同时用75 %的酒精浸泡支架材料20-60分钟进行消毒，用免疫细胞培养 基浸泡2-4小时，置于4°C冰箱待用。
[0022] 进一步优选地，所述免疫细胞培养基为X-VIVO15培养液。
[0023] 作为优选，步骤2所述进行培养为在37°C、5%二氧化碳的环境中培养14天。
[0024] 作为优选，步骤2所述IL-2因子浓度为100-500U/ml，具体可W选择100、200、 250、300、350、400、450 或 500U/ml。
[0025] 作为优选，步骤2所述比-15因子浓度为10-100yg/ml，具体可W选择10、20、30、 40、50、60、70、80、90 或 100yg/ml。
[0026] 作为优选，步骤2所述0KT-3因子浓度为10-100yg/ml，具体可W选择10、20、30、 40、50、60、70、80、90 或 100yg/ml。
[0027] 作为优选，步骤2所述接种的接种密度为1X106-2XIO6个细胞/ml。
[0028] W本发明所述方法进行LAK细胞的诱导培养，相对于现有的诱导培养方法，本发 明能够将LAK细胞数量扩增到400XIO6左右，较现有技术中的LAK细胞量60X10 6左右极 显著提高了LAK细胞数量，而且同时可W提高LAK细胞中效应细胞亚群的数量，增强LAK细 胞的杀伤能力。
[0029] 由W上技术方案可知，本发明在LAK细胞的诱导培养引入了胶原支架进行=维培 养，同时配合细胞因子的加入，由此解决了传统培养方法扩增的数量有限、效应细胞亚群数 量低、细胞杀伤活性不高的问题，满足临床上对于LAK细胞的需求。
【附图说明】
[0030] 图1所示为本发明方法诱导培养的LAK细胞和现有方法诱导培养的LAK细胞的增 殖曲线图；
[0031] 图2所示为本发明方法诱导培养的LAK细胞亚群流式检测结果，Al表示CD3+亚 群细胞的流式检测图，A2表示CD3+CD4+亚群的流式检测图，A3表示CD3+CD8+亚群的流式 检测图，A4表示CD3+CD56+亚群的流式检测图；
[0032] 图3所示为现有技术方法诱导培养的LAK细胞亚群流式检测结果，Al表示CD3+亚 群细胞的流式检测图，A2表示CD3+CD4+亚群的流式检测图，A3表示CD3+CD8+亚群的流式 检测图，A4表示CD3+CD56+亚群的流式检测图。
【具体实施方式】
[0033] 本发明实施例公开了一种LAK细胞的诱导培养方法。本领域技术人员可W借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的产品及方 法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0034] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种LAK细胞的诱导培 养方法进行详细说明。
[0035] 实施例1:本发明所述诱导培养方法
[0036] 1、胶原支架材料的制备
[0037] 将胶原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即为胶原支架，利用紫外线照射胶原支架 材料，同时用75%的酒精浸泡支架材料20-60分钟进行消毒，用X-VIVO15培养液浸泡3小 时，置于4°C冰箱待用。
[0038]2、外周血来源的PBMC的制备
[0039] 将抗凝管中的外周血转移到离屯、管中，400-500g离屯、5-lOmin，离屯、结束后将下 层血细胞转移到50血离屯、管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释。
[0040] 另取一支新的sepmate离屯、管（购自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己细胞分 离液（购自STEMCE化公司）12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离屯、管，600-800g离 屯、15-20min。
[0041] 离屯、后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涂1次，离屯、，得到PBMC。 阳0创 3、PBMC在胶原支架上诱导成LAK细胞
[0043] 将胶原支架平铺在细胞培养瓶底；用X-VIVO15培养基重悬细胞，按照1. 5XIO6/ ml的密度接种在铺有胶原支架的细胞培养瓶中，同时补加300U/ml的a-2,50iig/ml的 比-15和60yg/ml的0KT-3,在37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养。定期在倒置显微镜下 观察细胞的状态，每隔1-2天对细胞进行补液狂-VIVO15培养基和各细胞因子），培养14 天后，收集LAK细胞。 W44] 现有技术：同实施例1，区别在于未平铺胶原支架。
[0045] 实施例2:本发明所述诱导培养方法
[0046] 1、胶原支架材料的制备
[0047] 将胶原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即为胶原支架，利用紫外线照射胶原支架 材料，同时用75%的酒精浸泡支架材料20-60分钟进行消毒，用X-VIVO15培养液浸泡2小 时，置于4°C冰箱待用。 W4引 2、外周血来源的PBMC的制备 W例将抗凝管中的外周血转移到离屯、管中，400-500g离屯、5-lOmin，离屯、结束后将下 层血细胞转移到50血离屯、管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释。
[(K)加]另取一支新的sepmate离屯、管（购自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己细胞分离液（购自STEMCE化公司）12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离屯、管，600-800g离 屯、15-20min。
[0051] 离屯、后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涂1次，离屯、，得到PBMC。 阳05引 3、PBMC在胶原支架上诱导成LAK细胞
[0053] 将胶原支架平铺在细胞培养瓶底；用X-VIVO15培养基重悬细胞，按照1Xl〇6/ml /ml的密度接种在铺有胶原支架的细胞培养瓶中，同时补加50