Gadd45g基因及其表达产物在诱导肿瘤细胞衰老中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了GADD45G基因及其表达产物在诱导肿瘤细胞衰老中的应用。具体地，本发明提供了一种GADD45G基因、蛋白或其促进剂的用途，用于制备诱导肿瘤细胞尤其是肝癌细胞衰老的药物组合物。此外，本发明还提供了GADD45G基因蛋白或其促进剂用于抑制JAK-STAT3信号通路从而进一步抑制肿瘤细胞生长或增殖。本发明方法揭示了GADD45G基因作为抑癌基因的作用机制，并能将该机制广泛应用于肿瘤尤其是肝癌的治疗。
【专利说明】GADD45G基因及其表达产物在诱导肿瘤细胞衰老中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤治疗领域。具体地，涉及GADD45G基因、蛋白或其促进剂通过诱导 肿瘤细胞衰老从而抑制肿瘤细胞生长中的应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌是一种恶性程度较高以及预后差的恶性肿瘤，其在全球死亡率和发 病率分别列所有肿瘤的第4位和第7位，尤其中国是肝癌的高发病地区。因其初期症状不 明显，检测出时病人已多处于晚期，而晚期因癌细胞扩散和转移而导致预后不良，所以肝 癌的防治十分重要。研究表明，当体细胞发生遗传改变时，往往能造成细胞衰老，从而抑制 肿瘤发生；因此，细胞衰老是机体保持稳态的一种调节机制。细胞发生恶性转化需要克服细 胞衰老的阻碍。
[0003] 对于已发生转化的细胞或肿瘤细胞而言，诱导细胞衰老相关机制的研究，对于肿 瘤临床治疗具有十分重要的意义。因此，本领域迫切需要开发一种能诱导肿瘤细胞衰老从 而抑制肿瘤生长或扩增的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种GADD45G基因、蛋白或其促进剂在诱导肿瘤细胞衰老从而抑制 肿瘤细胞生长或扩增的用途。
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种GADD45G基因、蛋白或其促进剂的用途，用于制备 诱导肿瘤细胞衰老的药物组合物。
[0006] 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自以下肿瘤：肝癌、肺癌、胃癌、大肠癌、卵巢 癌、胰腺癌。
[0007] 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自肝癌。
[0008] 在另一优选例中，所述的GADD45G基因核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示，其编码 的蛋白序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0009] 在另一优选例中，所述的GADD45G来自哺乳动物，较佳地，来源于大鼠、小鼠、人， 更佳地，来源于人。
[0010] 在另一优选例中，所述的GADD45G基因、蛋白或其促进剂包括的GADD45G基因表达 产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
[0011] 在另一优选例中，所述的GADD45G促进剂为MG-132。
[0012] 在另一优选例中，所述的药物组合物包括所述GADD45G基因、蛋白或其促进剂以 及药学上可接受的载体。
[0013] 本发明的第二方面，提供了一种用于诱导肿瘤细胞衰老的药物组合物，所述的药 物组合物包括GADD45G基因、蛋白或其促进剂以及药学上可接受的盐。
[0014] 在另一优选例中，所述的GADD45G促进剂包括的GADD45G基因表达产物、促进型 miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
[0015] 在另一优选例中，所述的GADD45G促进剂为MG-132。
[0016] 本发明第三方面，提供了一种筛选制备诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物的方法， 包括步骤：
[0017] (a)在测试组中，向细胞培养体系添加测试化合物，并观察测试组中所述细胞 GADD45G的表达量和/或活性；在对照组中，向相同的培养体系不添加测试化合物，并观察 对照组中所述细胞的GADD45G的表达量和/或活性；
[0018] 其中，如果测试组中的GADD45G的表达量和/或活性大于对照组，则说明该化合物 是对GADD45G有促进作用的用于诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物。
[0019] 在另一优选例中，所述的步骤还包括：
[0020] (b)对（a)中获得的候选化合物，还进一步测试其对JAK-STAT3的抑制作用。
[0021] 在另一优选例中，步骤（b)中还包括：在测试组中，向肿瘤细胞培养体系添加测试 化合物，并观察所述的肿瘤细胞的生长情况和/或细胞量；在对照组中，向相同培养体系不 添加测试化合物，并观察所述的肿瘤细胞的生长情况和/或细胞量；
[0022] 其中，若测试组中衰老的细胞比例显著大于对照组，和/或若测试组中的细胞量 显著少于对照组，则说明，该化合物是用于诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物。
[0023] 本发明第三方面，提供了一种JAK-STAT3抑制剂的用途，用于制备诱导肿瘤细胞 衰老的药物组合物。
[0024] 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自肝癌、肺癌、胃癌、大肠癌、卵巢癌、胰腺癌。
[0025] 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自肝癌。
[0026] 在另一优选例中，所述的JAK-STAT3来自哺乳动物，较佳地，来源于大鼠、小鼠、 人，更佳地，来源于人。
[0027] 在另一优选例中，所述的药物组合物包括JAK-STAT3抑制剂以及药学上可接受的 载体。
[0028] 在另一优选例中，所述的JAK-STAT3抑制剂包括GADD45G基因、蛋白或其促进剂和 /或shP2基因、蛋白或其促进剂。
[0029] 在另一优选例中，所述的GADD45G基因、蛋白或其促进剂包括的GADD45G基因表达 产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
[0030] 本发明第三方面，提供了一种体外非治疗性的诱导肿瘤细胞衰老的方法，向细胞 培养体系中加入GADD45G基因、蛋白或其促进剂，从而诱导肿瘤细胞的衰老。
[0031] 本发明第四方面，提供了一种诱导肿瘤细胞衰老从而治疗肿瘤的方法，向所需要 的对象施用安全有效量的GADD45G基因、蛋白或其促进剂；和/或向所需要的对象施用安全 有效量的JAK-STAT3抑制剂。
[0032] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1显示了 GADD45G在肝癌中低表达。其中：图IA的qRT-PCR结果显示GADD45G 在人肝癌细胞系及永生化肝细胞系THLE-2中的表达情况。图IBqRT-PCR结果显示GADD45G 在DEN药物诱导小鼠肝细胞性肿瘤模型中，癌及癌旁组织中的表达情况。图IC qRT-PCR 结果显不GADD45G在人肝癌临床样本的癌及癌芳组织中的表达情况。（***P〈0. 001)图ID Western blotting结果显示GADD45G在人肝癌临床样本的癌及癌旁组织中的表达情况。
[0034] 图2显示了 GADD45G与肝癌的分化呈负性相关：免疫组化评分显示，临床肝癌样本 中GADD45G表达强弱与肝癌分化等级的相关性（**P〈0. 01)。
[0035] 图3显示了 GADD45G条件表达载体的建立。
[0036] 图4显示了过表达GADD45G诱导细胞衰老。其中，图4A过表达GADD45G及对照组 的SA- β -gal染色结果。图4B qRT-PCR结果显示过表达GADD45G及对照组中IL-8的表达 情况。图4C Annexin V/7-AAD染色检测过表达GADD45G及对照组的细胞凋亡情况。图4D BrdU染色检测过表达GADD45G及对照组的细胞增殖情况。（*P〈0. 05, **P〈0. 01)
[0037] 图5显示了过表达GADD45G诱导Sk-H印1细胞衰老。其中，图5A Dox诱导过表达 GADD45G及对照组Sk-H印1细胞的SA- β -gal染色结果。图5BqRT-PCR结果显示Dox诱导 过表达GADD45G及对照组中IL-6的表达情况。图5C qRT-PCR结果显示Dox诱导过表达 GADD45G及对照组中IL-8的表达情况。图Western blotting检测显示Dox诱导过表达 GADD45G及对照组中衰老标志物γ -H2AX及GADD45G的表达情况。
[0038] 图6显示了 GADD45G在体内抑制肿瘤生长。其中，图6A过表达GADD45G及对照组 Sk-H印1细胞在体内的肿瘤形成情况（*P〈0. 05)。图6B过表达GADD45G及对照组Sk-H印1 细胞形成的肿瘤生长状况（**P〈〇. 01)。图6C H&E染色及免疫组织化学检测过表达GADD45G 及对照组Sk-H印1细胞所形成的肿瘤中细胞增殖标志物Ki-67的表达情况。（X400)
[0039] 图7显示了在Sk-H印1细胞中GADD45G诱导细胞衰老不通过p53/p21或pl6/Rb通 路。其中，图7A转有SV40-LT及对照质粒的Sk-Hepl经doxorubicin处理24小时后，Western blotting检测显示p53及p21的表达情况。图7BTet-GADD45G-Sk-H印1及对照细胞转有 SV40-LT及对照质粒后，经Dox诱导表达4天后，SA- β -gal染色检测各细胞衰老情况。图 7C Western blotting 检测显示 siRNA 干扰 p21、p27、p53 或 Rb 后，Tet-GADD45G-Sk-H印 1 细胞中P21、p27、p53或Rb的表达情况。图7D SA-P-gal染色检测siRNA干扰p21、p27、 p53或Rb后，Dox诱导GADD45G表达的细胞的衰老比率情况。图7E MTT检测siRNA干扰 p21、p27、p53或Rb后，Dox诱导GADD45G表达的细胞的存活比率情况。
[0040] 图8显示了 GADD45G诱导肝癌细胞衰老不通过p53/p21或pl6/Rb通路。其中， 图8A在LPC-H-Ras V12细胞中，Dox诱导GADD45G表达后细胞克隆形成情况（2000, 1000 和500个细胞每孔)。图8B在LPC-H-Ras V12细胞中，Dox诱导GADD45G表达后SA-β -gal 染色检测细胞衰老情况。图8C在Tet-GADD45G-H印3B细胞中，siRNA干扰pl6后Dox诱导 GADD45G表达3天，SA- β -gal染色检测细胞衰老情况。图8D在Tet-GADD45G-H印3B细胞 中，siRNA 干扰 pl6 后 Dox 诱导 GADD45G 表达 3 天，Western blotting 检测 pl6 及 GADD45G 的表达情况。
[0041] 图9显示了 GADD45G抑制Jak2, Tyk2和Stat3的活化。其中，图9A Dox诱 导表达 GADD45G 后，Western blotting 检测 Sk-H印 1、SMMC-7721 及 H印3B 细胞中 p-Stat3 (Tyr705)，Stat3 及 GADD45G 的表达情况。图 9BTet-GADD45G-Sk-H印 1 细胞经 Dox 处 理不同时间后，Western blotting 检测 p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、p_Tyk2 (Tyrl054/1055)、 Tyk2、p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表达情况。
[0042] 图10显示了 Na3V04能够抑制GADD45G造成的细胞衰老。其中，图10ATet-GADD45G Sk-H印1细胞经不同浓度的Na3V04 (100 μ Μ, 250 μ Μ, 500 μ Μ, 1000 μ Μ)处理0· 5小时后， Dox诱导GADD45G表达4天，SA-β -gal染色检测细胞衰老情况。图IOB Tet-GADD45G Sk-H印1 细胞经不同浓度的 Na3V04 (100 μ Μ, 250 μ Μ, 500 μ Μ, 1000 μ Μ)处理 0· 5 小时 后，Dox 诱导 GADD45G 表达 4 小时，Western blotting 检测 p_Stat3(Tyr705)、Stat3、 p-Tyk2 (Tyrl054/1055)、Tyk2、p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表达情况。
[0043] 图11显示了 Shp抑制剂介导GADD45G对JAK-Stat3通路的抑制。其中，图IIA Dox 诱导 GADD45G 表达不同时间点后，Western blotting 检测 p_Shp2 (Tyr580)、Shp2 及GADD45G表达情况。图IlB Dox诱导GADD45G表达并用NSC-87877(10yM)处理4小 时后，Western blotting 检测 p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、p_Tyk2 (Tyrl054/1055)、Tyk2、 p-Jak2 (Tyrl007/1008)、Jak2 及 GADD45G 的表达情况。
[0044] 图12显示了敲除Shp2能够抑制GADD45G介导的JAK-Stat3通路活性抑制。其 中，图12A在Tet-GADD45G-Sk-H印1细胞中，siRNA干扰Shp2表达后，Dox诱导GADD45G表 达 4 小时，Western blotting 检测 p_Stat3 (Tyr705)、Stat3、Shp2 及 GADD45G 的表达情况。 图12B在Tet-GADD45G-Sk-H印1细胞中，siRNA干扰Shp2表达后，Dox诱导GADD45G表达4 天，SA-β -gal染色检测细胞衰老情况。图12C在Tet-GADD45G-Sk-H印1细胞中，siRNA干 扰Shp2表达后，Dox诱导GADD45G表达24小时，PI染色检测细胞周期。（**P〈0. 01)
[0045] 图13显示了组成性活化Stat3能够抑制GADD45G介导的细胞衰老和增殖抑 制。其中，图13A Tet-GADD45G-Sk-H印1经转导Ca-Stat3表达及对照质粒后，Dox诱导 GADD45G 表达 4 小时，Western blotting 检测 p_Stat3(Tyr705)、Stat3 及 GADD45G 的表 达情况。图13B Tet-GADD45G-Sk-H印1经转导Ca-STAT3表达及对照质粒后，Dox诱导 GADD45G表达4天，SA-β-gal染色检测细胞衰老情况。图13C Tet-GADD45G-Sk-H印1经 转导Ca-Stat3表达及对照质粒后，Dox诱导GADD45G表达4天，PI染色检测细胞周期。图 13D Tet-GADD45G-Sk-H印1经转导Ca-Stat3表达及对照质粒后，Dox诱导GADD45G表达4 天，qRT-PCR检测端粒酶hTERT的表达情况。（*P〈0. 05, **P〈0. 01)
[0046] 图14显示了组成性活化Stat3能够在体内抵抗GADD45G介导的肿瘤生长抑制 作用。其中，图14A稳定转染Ca-Stat3或对照质粒的Tet-GADD45G-Sk-H印1皮下荷瘤， 经Dox诱导GADD45G的表达后肿瘤形成情况。图14B稳定转染Ca-Stat3或对照质粒的 Tet-GADD45G-Sk-H印1皮下荷瘤，经Dox诱导GADD45G的表达后肿瘤生长状况。图14C各组 荷瘤组织的H&E染色及免疫组化检测各组荷瘤组织的p-Stat3、Ki-67的表达情况。（X400)
【具体实施方式】
[0047] 本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现了 GADD45G基因对肿瘤细胞尤其是 肝癌细胞的抑制作用是通过诱导肿瘤细胞的衰老而得到的。促进GADD45G基因的表达和/ 或活性有助于诱导肿瘤细胞的衰老，从而抑制肿瘤细胞的生长。此外，本发明人还发现了 GADD45G基因通过shp2介导的JAK-STAT3通路的抑制，从而诱导肿瘤细胞的衰老。在此基 础上，完成了本发明。
[0048] GADD45G
[0049] GADD45家族蛋白能够诱导细胞的凋亡，控制细胞的命运。近年来的研究表明， GADD45家族GADD45A、GADD45B和GADD45G虽然蛋白同源性较高，但是功能仍然不近相同。
[0050] 在肝癌细胞H印G2中，体外实验表明GADD45家族蛋白皆能抑制细胞增殖，提示其 作为抑癌基因在发生发展中起较为重要作用。
[0051] GADD45G在多种肿瘤中表达下调，机制涉及启动子甲基化或转录后修饰改变。 GADD45G表达的下调与多种肿瘤发生发展密切相关，被认为是一潜在的抑癌基因。
[0052] 但是，目前GADD45G对肝癌的生物学效应以及其中的作用机制仍然不完全清楚。 本研究通过实验发现,GADD45G对肿瘤的抑制作用是通过对肿瘤细胞衰老的诱导而完成的， 旨在探讨GADD45G对肝癌细胞生长的影响及其体内、外生物学效应和相关机制。
[0053] 在本发明中，术语"本发明蛋白"、"本发明多肽"、"GADD45G蛋白"、"GADD45G多肽" 可互换使用，都指具有人蛋白GADD45G氨基酸序列的蛋白或多肽。应理解，所述术语还包括 GADD45G的活性片段和衍生物。
[0054] 在本发明中，术语"本发明基因"、"本发明多核苷酸"指编码GADD45G蛋白或 其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。人GADD45G基因位于染 色体9q22. I_q22. 2 ;其编码序列长度为480bp。GADD45G基因的核酸序列如SEQ ID N0.:l(Genbank ID:NM_006705.3，CDS:lll-590)所示，Gene ID:10912,其编码的蛋白序列 如 SEQ ID NO. :2,（Genbank ID:NP_006696. 1)所示：
[0055] 如本文所用，术语"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物 质，原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯 化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。
[0056] 如本文所用，"分离的GADD45G蛋白或多肽"是指GADD45G蛋白基本上不含天然与 其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术 纯化GADD45G蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本 发明中，GADD45G蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0057] 本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多 肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0058] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0059] 编码GADD45G的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多 肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列（和任选的附加编码序列）以及 非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还 包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0060] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0061] 本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个 核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术（如PCR)以确定 和/或分离编码GADD45G蛋白的多核苷酸。
[0062] 本发明的人GADD45G核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或 人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅 读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0063] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 [0064] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0065] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引 物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方 法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0066] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GADD45G蛋 白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
[0067] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组 的GADD45G蛋白。一般来说有以下步骤：
[0068] (1).用本发明的编码人GADD45G蛋白的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核 苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0069] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0070] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0071 ] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人GADD45G编码DNA序列和合适的转 录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组 技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表 达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0072] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋 白（GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0073] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0074] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞 如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、C0S、或293细胞的动物细胞等。
[0075] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl 2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0076] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0077] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用 蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。
[0078] JAK-STAT3
[0079] JAK-STAT信号通路主要参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等多个重要的 生物学过程。它主要由三个成员组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子 STAT。
[0080] 其中，JAK是一类非跨膜型酪氨酸激酶，其蛋白家族共包括4个成员：JAKl、JAK2、 JAK3以及Tyk2。STAT则被称为"信号转导子和转录激活子"，即其同时具有信号转导及转 录激活的重要作用。目前已发现六个STAT家族成员，即STAT1-STAT6。
[0081] 促进剂和药物组合物
[0082] 利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与GADD45G蛋白发生相互作 用的物质，尤其是促进剂等。
[0083] 本发明GADD45G蛋白的促进剂，当在治疗上进行施用（给药）时，可促进GADD45G 蛋白的表达和/或活性，进而诱导肿瘤细胞的衰老。在另一优选例中，所述的GADD45G促进 剂包括的GADD45G基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分 子化合物。一种优选的GADD45G促进剂为MG-132。
[0084] 通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的 病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限 于）：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
[0085] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明GADD45G蛋白或其 促进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可 以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行 制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、 溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微 克-10毫克/千克体重。
[0086] 筛选药物的方法
[0087] 本发明还提供了一种筛选制备诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物的方法，包括步 骤：
[0088] (a)在测试组中，向细胞培养体系添加测试化合物，并观察测试组中所述细胞 GADD45G的表达量和/或活性；在对照组中，向相同的培养体系不添加测试化合物，并观察 对照组中所述细胞的GADD45G的表达量和/或活性；
[0089] 其中，如果测试组中的GADD45G的表达量和/或活性大于对照组，则说明该化合物 是对GADD45G有促进作用的用于诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物。
[0090] 本发明筛选药物的方法还包括：
[0091] (b)对（a)中获得的候选化合物，还进一步测试其对JAK-STAT3的抑制作用。
[0092] 在另一优选例中，步骤（b)中还包括：在测试组中，向肿瘤细胞培养体系添加测试 化合物，并观察所述的肿瘤细胞的生长情况和/或细胞量；在对照组中，向相同培养体系不 添加测试化合物，并观察所述的肿瘤细胞的生长情况和/或细胞量；
[0093] 其中，若测试组中衰老的细胞比例显著大于对照组，和/或若测试组中的细胞量 显著少于对照组，则说明，该化合物是用于诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物。
[0094] 通用方法
[0095] I. 1 材料
[0096] 人肝癌细胞株H印3B、PLC/PRF/5、SK-H印1、SUN475以及THLE-2人正常肝细胞株 (CRL-2706)来自ATCC，人肝癌细胞株HuH-7购自日本Riken，人肝癌细胞株SMMC-7721购 自中科院细胞库，人肝癌细胞株HCC-LM3、MHC-97H购自中山医院肝癌研究所，LPC-H-Ras V12小鼠肝肿瘤细胞（CCTCC N0:C2010115)。pTRIPZ Tet-on表达质粒来自Thermo公司，其 中 pTRIPZ-Con (空载）载体中，红色突光蛋白（Turbo Red Fluorescent protein，tRFP)能 够被强力霉素诱导表达；cFUGW-Ca-Stat3及pT/CMV-SV40-LgT质粒均购自Addgene公司。 细胞培养液 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、DMEM:F12 (1:1)以及胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS)购自美国HyClone公司。噻唑兰（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, MTT)、碘化丙陡（Propidium Iodide, PI)、7_氨基放线菌素 D(7_Aminoactinomycin D, 7-AAD)、强力霉素（doxycycline, Dox)、噪呤霉素和Na3VO4购自美国sigma公司； NCS-87877购自德国Merck公司。质粒小抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公 司；LipofetAMINE 2000, optiDMEM 和总 RNA 提取试剂 TRIzol 购自美国 Invitrogen 公司； 限制性内切酶，T4连接酶，高保真酶PrimeStar?，RNA反转试剂盒PrimeScript? RT Kit 和以 SYBY Green 为染料用于实时荧光定量 PCR (Quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 的 SYBR Premix Ex Taq? 试剂盒购自大连 TaKaRa。APC(allophycocyanin)_Annexin V 抗 体购于美国eBioscience公司。细胞衰老染色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。 兔抗人GADD45G多克隆抗体、兔抗人Rb多克隆抗体、兔抗人p53单克隆抗体、鼠抗人p21/ ⑶KNlA单克隆抗体、兔抗人p27多克隆抗体、鼠抗人a -Tubulin单克隆抗体、兔抗人pl6 多克隆抗体、兔抗人Tyk2多克隆抗体和兔抗人Shp2多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公 司；兔抗人￥托4多克隆抗体、兔抗人灯-67多克隆抗体、兔抗人？-允1^2〇>1' 1°°7/1°°8)多克 隆抗体和兔抗人Jak2多克隆抗体购自美国Epitomics公司；兔抗人p-Stat3 (Tyr7°5)多克 隆抗体、兔抗人p-Tyk2(T yr1(l54/1°55)多克隆抗体、兔抗人p-Shp2(Tyr 58°)多克隆抗体和鼠抗 人Stat3单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。肝癌芯片及组织样本 HLiv-HCC150CS-01 75对，150点肝癌芯片购于上海芯超公司；其余45对肝癌及癌旁组织样 本来源于江苏省启东市肝癌防治研究所，用于RNA的提取以及蛋白检测。本实验所用BALB/ c雄性裸鼠，6周龄，体重20g左右，皆购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于华东 师范大学动物房。
[0097] I. 2GADD45G真核表达质粒的构建
[0098] 从GenBank中检索获得人源GADD45G的编码序列，取其上、下游序列各约20bp为 引物，同时在引物两端引入限制性内切酶AgeI和EcoRI (上游引物SEQ ID NO. :3:5'-CG GACCGGTGCCACCATGACTCTGGAAGAAGTCCG-3'；下游引物 SEQ ID N0.:4:5'-GCCGAATTCTCACT CGGGGAGGGTGATGCTGGGC-3'）。提取THLE-2细胞(人肝永生化细胞）的mRNA，然后逆转录得 到全基因组cDNA，以此为模板，做PCR扩增反应：98°C预变性30s ;98°C 10s，60°C 15s， 72°〇458共30个循环；最后721：延伸51^11。扩增产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳后回收 目的片段。PCR产物目的片段经胶回收后，与pTRIPZ载体一并用限制性内切酶AgeI和 EcoRI进行双酶切反应，4h后再次琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，得到产物行酶连反应，反 应体系为 pTRIPZ0.5yL (含 300ng DNA)，外源 DNA 插入片段 4.5yL (含 400ng DNA)和 Solution I 5yL，16°C水浴中过夜连接，然后转化大埃希菌Stble3,均勻涂于含氨节青霉 素 （amp i c i 11 in, Amp)的LB平板上，37 °C培养过夜。挑取阳性菌落，加入含有Amp抗性的LB 液体培养液中，37°C，275r / min摇菌15h，提取质粒后再酶切鉴定，后送至上海英骏生物有 限公司测序，将测序正确的克隆采用无内毒素质粒提取试剂盒抽提质粒，存放于-20°C冰箱 中保存。
[0099] 1. 3病毒制备和细胞感染
[0100] 接种细胞数约为3. 5X IO5个/孔(使用不加抗生素的培养基）的慢病毒包装293T 细胞于6孔板中，24h培养后将载体质粒pTRIPZ-Con (空载)和pTRIPZ-GADD45G (含目的基 因载体）分别与辅助质粒PSPAX2及pMD2G(共4μ g ;质量比，载体：psPAX2 :pMD2G=3:2:1) 相互混合，加入 250 μ L optiDMEM 里，然后将 10 μ L LipofetAMINE 2000 亦放入 250 μ L optiDMEM中，静置3min，混合，室温放置30?40min，使表达质粒与脂质体充分混匀，随后将 混合液加至293T细胞中。48h后，收取含有病毒的上清，500 X g离心5min，0. 45 μ m的滤网 过滤。将处于对数生长期的待感染的目的细胞铺至24孔板，细胞密度为30%，贴壁培养24h 后准备感染。在病毒上清液中，加入凝聚胺（polybrene;终质量浓度为8yg/mL)，混匀后， 加入待感染细胞中（每孔300 μ L，），重复感染2次，每次12?16h，采用终浓度为5 μ g/mL 的嘌呤霉素筛选病毒感染后的目的细胞1周，获得稳定转染质粒的细胞系。
[0101] I. 4BrdU法检测细胞增殖
[0102] 6孔板中接种满度为30%?40%目的细胞，过夜后去上清液，换条件培养基，处理 72h后按照BrdU流式检测试剂盒（BD公司）说明书进行BrdU掺入及流式检测。
[0103] I. 5MTT法检测细胞增殖
[0104] 取对数生长期的目的细胞，按I X IO4个/mL的密度200 μ L每孔接种于96孔板。 过夜后，去上清液，换含有0. 5 μ g/mL Dox和10%FBS的DMEM处理细胞72h后于每孔中加入 MTT溶液20 μ L (5ng / mL)，37°C条件下培养3h，弃去上清液，每孔加入DMS0150 μ L，混匀， 利用分光光度计于540nm波长处测定各孔吸光度（D)值。
[0105] 1.6细胞凋亡检测
[0106] 6孔板中接种满度为30%?40%目的细胞，过夜后去上清液，换条件培养姐，处 理72h后用胰酶消化，经PBS冲洗后，500Xg离心收集细胞，以ImL染色缓冲液（binding buffer)悬浮细胞，并移人流式管中，再500Xg离心收集细胞，以100 μ L染色缓冲液悬浮 并移人流式管中避光加入2. 5 μ LAPC-Annexin V以及0. 1 μ L7-AAD，混匀反应30min，补充 100?200 μ L染色缓冲液，上流式细胞仪（FACSCalibur?流式细胞仪，Becton Dickinson) 检测细胞凋亡。
[0107] 1.7细胞周期检测
[0108] 取对数生长期的目的细胞，按5 X IO4个/mL的密度2mL每孔接种于6孔板中。过 夜后去除上清液，细胞换条件培养基培养96h后用胰酶消化，经PBS冲洗后，500Xg离心 5min收集细胞。除上清液，加预冷的70%乙醇重悬细胞，于-20° C长期固定。待细胞染色 时，500 Xg离心5min收集细胞，用ImL的PBS洗细胞一次，加入IOOyL含PI (50yg/mL) 和RNase A (100 μ g/mL)的PBS重悬细胞，室温避光孵育30min。在加入200 μ L PBS后，上 流式细胞仪检测细胞检测周期。
[0109] 1. 8衰老相关半乳糖苷酶染色
[0110] 6孔板中接种满度为30%?40%目的细胞，过夜后去上清液，换条件培养基培养细 胞，72h后，用PBS洗涤2次，染色固定液固定15min，再用PBS洗涤3次，加入衰老相关半乳 糖苷酶染色（senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal)染色液 lmL，37°C 条件下隔绝CO2染色过夜后于倒置显微镜（Zeiss)明场观察。
[0111] I. 9qRT-PCR检测目的基因 mRNA的表达
[0112] 利用TRIzol试剂提取目的细胞总RNA，逆转录mRNA得到cDNA。IL-8上游引物：5 ，-ACCACCGGAAGGAACCATCTCAC-3'（SEQ ID NO. :5)，下游引物：5'-AGCACTCCTTGGCMAACTGCAC -3'（SEQ ID NO. :6) ;IL-6 上游引物：5'-GAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGA-3'（SEQ ID NO. :7)， 下游引物：5' -GTTGGGTCAGGGGTGGTTATT-3'（SEQ ID NO. :8) ;GADD45G 上游引物：5' -GTCTA CGGAGTCAGCCAAAGTC-3'（SEQIDN0·:9)，下游引物：5'-AAAGCCTGGATCAGCGTAAAAT-3'（SEQ ID NO. :10) ;hTERT 上游引物：5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'（SEQ ID NO. :11)，下游引物： 5' -GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'（SEQ ID NO. :12);内参照 GAPDH 上游引物：5' -CATGAGAAGT ATGACAACAGCCT-3'（SEQIDN0·:13)，下游引物：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'（SEQID NO. : 14)(引物均由上海英骏生物技术有限公司合成）。然后采用SYBR方法，按SYBR Premix Ex Taq? 试剂盒的要求在 Real-time7300PCR 仪（ABI7300，Applied Biosystem)上进行 PCR 扩增。结果采用相对定量法比较mRNA的表达差异，利用Ct值计算，以表示目的基 因 mRNA的相对表达量，Λ ACt = (Ct目的基因一Ct GAPDH)实验组一（Ct目的基因一Ct GATOH)对照组。
[0113] 1. 10蛋白质印迹法检测哀老相关蛋白的表达
[0114] 收取目的细胞，冰冷PBSlmL洗涤2次，加适量的蛋白裂解液，冰上裂解细胞lh，其 中每隔20min吹打一次，然后12000 X g4°C离心30min，上清即为裂解所得蛋白，每孔上样总 蛋白50 μ g，经12%的SDS-PAGE电泳分离后转移至醋酸纤维膜，转膜90min后，用5%的BSA 封闭60min，加入1:1000稀释的一抗，4°C过夜；TBST缓冲液充分漂洗后加入I :5000稀释 的HRP标记的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗，室温反应2h，TBST洗膜3次，增强型化学发光试 剂（ECL)显色，由ChemiDoc?XRS成像系统（Bio-Rad)获取条带图像。
[0115] 1.11克隆形成实验
[0116] 取对数生长期的目的细胞，按IX IO3个/mL、0. 5X IO3个/mL和0. 5X IO3个/mL密 度2mL每孔接种于35mm皿中，铺板均勻。24小时贴壁后各组分别给予或不给予Dox处理。 每3d换一次培养液，培养7d后去除细胞培养液，PBS洗两次。甲醛固定30min，用自来水洗 5min后利用结晶紫染色lh，再次用自来水洗去背景，过夜晾干后于扫描仪扫描。
[0117] I. 12RNA 干扰
[0118] 取对数生长期的目的细胞，按5X104个/mL的密度2mL每孔接种于6孔板中。24h 后去除上清液，换为ImL DMEM培养基培养lh。准备两个已加入250yLopti-DMEMRNase Freel. 5mL EP管，一管加入终浓度为IOOpM的目标siRNA，另一管加入5μ L的脂质体 LipofectamineTM2000,室温静置5min。充分混匀后，室温静置45min。将500 μ L转染混 合物均匀滴加到细胞培养孔中，前后移动培养皿，混合均匀。6 h后去除上清液换成完全 DMffl培养基。p21特异siRNA随机混合物(货号:EHU003861). p27特异siRNA混合物(货 号:EHU025821). p53特异siRNA混合物(货号:EHU123221)、Rb特异siRNA混合物(货 号:EHU023531)购自 Sigma 公司、Shp2_l 特异 siRNA (货号：SASI_Hs02_00334550)及 Shp2-3 特异 siRNA (货号：SASI_Hs02_00334551)均购自 Sigma 公司；pl6 特异 siRNA 序列 为CGCACCGCCTAGTTACGGT，由上海吉玛制药技术有限公司合成。
[0119] 1.13荷瘤实验
[0120] 实验一：过表达GADD45G皮下荷瘤情况
[0121] 每只BalB/C裸鼠右下侧腿周皮下接种含5X IO6个导入不同质粒的SK-H印1细胞 的200 μ L PBS (每组10只）。每组又随机分为两组，一组给予含2 μ g/mL Dox的水，另一组 正常给水。观察50d，每隔3d观察一次肿瘤大小。
[0122] 实验二：过表达组成性活化的Stat3对GADD45G细胞成瘤影响
[0123] 每只BalB/C裸鼠右下侧腿周皮下接种含6X IO6个导入不同质粒的SK-H印1细胞 的200 μ L PBS (每组16只）。每组又随机分为两组，一组给予含2 μ g/mL Dox的水，另一组 正常给水。观察50d，每隔3d观察一次肿瘤大小。
[0124] 1.14 免疫组化（IHC)
[0125] 取新鲜的肿瘤组织放入4%福尔马林（PFA)中，室温24h后于4°C保存。按照常规 石蜡包埋的方法进行包埋、切片（4 μ m厚)、烤片、脱蜡。然后将贴有切片的载玻片放入PH=6 的0. OlM的柠檬酸缓冲液中，微波炉中火加热lOmin，再用大火加热IOmin冷却至室温。于 蒸馈水中处理一次，5min。在放入3%H 202，10min。蒸馈水中处理一次，5min，再用PBS洗二 次。小心去除液体，用10%TBST配置的BSA封闭，lh。加入适量比例的一抗，4°C过夜，PBS洗 三次，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37°C孵育lh，PBS洗三次。DAB显色，自来水冲洗 3min后，苏木素染色2min，自来水冲洗15min。中性树胶封片。于正置显微镜下观察分析。
[0126] 本发明的有益效果
[0127] 1.本发明应激蛋白GADD45G基因或其表达产物可诱导肿瘤细胞衰老，可用于抑制 肿瘤细胞尤其是肝癌细胞的生长或增殖。
[0128] 2. GADD45G基因或其表达产物通过JAK-STAT3通路诱导细胞衰老，而非通过常规 细胞衰老途径。
[0129] 3.通过上调Shp2抑制JAK-STAT3通路是诱导细胞衰老的关键因素。
[0130] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0131] 实施例1GADD45G基因在肝癌与其癌旁组织之间表达比较，及其表达与临床病理 评分之间的关系
[0132] I. 1检测了 8个肝癌细胞系中GADD45G的表达情况，以SV-40转化的永生化正常肝 细胞系THLE-2的GADD45G表达为参照。
[0133] 结果显示，8个肝癌细胞系中GADD45G的转录水平均明显低于THLE-2细胞系（图 1A，Ρ〈0· 05)。
[0134] 1.2以DEN药物诱导小鼠肝细胞性肿瘤作为模型，分别提取小鼠肝癌及癌旁组织 RNA，GADD45G转录水平亦是在肝癌中显著下降（图1Β，Ρ〈0. 05)。分别提取了 45对以及12 对人肝癌和癌旁组织的RNA和蛋白，发现在人肝癌中GADD45G转录（图1C，Ρ〈0. 001)和蛋白 水平显著低于癌旁组织（图1D)。
[0135] 1. 3分析GADD45G的表达是否与临床病理评分相关
[0136] 经过分析发现GADD45G的表达与性别，年龄以及肿瘤大小没有统计学的差异(表 1)。
[0137] 表1组织芯片中GADD45G表达情况一览表
[0138]
【权利要求】
1. 一种GADD45G基因、蛋白或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备诱导肿瘤细胞衰 老的药物组合物。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GADD45G来自哺乳动物。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GADD45G基因、蛋白或其促进剂包括 的GADD45G基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合 物。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括所述GADD45G基因、 蛋白或其促进剂以及药学上可接受的载体。
5. -种用于诱导肿瘤细胞衰老的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括 GADD45G基因、蛋白或其促进剂以及药学上可接受的盐。
6. -种筛选制备诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物的方法，其特征在于，包括步骤： (a) 在测试组中，向细胞培养体系添加测试化合物，并观察测试组中所述细胞GADD45G 的表达量和/或活性；在对照组中，向相同的培养体系不添加测试化合物，并观察对照组中 所述细胞的GADD45G的表达量和/或活性； 其中，如果测试组中的GADD45G的表达量和/或活性大于对照组，则说明该化合物是对 GADD45G有促进作用的用于诱导肿瘤细胞衰老的候选化合物。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤还包括： (b) 对（a)中获得的候选化合物，还进一步测试其对JAK-STAT3的抑制作用。
8. -种JAK-STAT3抑制剂的用途，其特征在于，用于制备诱导肿瘤细胞衰老的药物组 合物。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的JAK-STAT3抑制剂包括GADD45G基 因、蛋白或其促进剂和/或shP2基因、蛋白或其促进剂。
10. -种体外非治疗性的诱导肿瘤细胞衰老的方法，其特征在于，向细胞培养体系中加 入GADD45G基因、蛋白或其促进剂，从而诱导肿瘤细胞的衰老。
【文档编号】A61K38/19GK104225621SQ201310242123
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月18日 优先权日:2013年6月18日
【发明者】刘永忠, 杨兆娟, 张力, 马爱辉 申请人:上海市肿瘤研究所