循环肿瘤细胞代谢活动检测装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及生物与医学检测领域。更具体地，本实用新型涉及人外周血中循环肿瘤细胞代谢活动的检测装置。本实用新型的装置可对人外周血中捕获到的CTC进行代谢功能分型，并用于预测这些CTC的恶性程度。
【背景技术】
[0002]人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)是指从肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。由于超过90%的癌症死亡是由转移造成的，而CTC是肿瘤转移的直接来源，因此从血液中分离CTC并对其进行分子检测越来越引起人们的重视。
[0003]目前对CTC的检测主要是对癌症患者外周血中的全体CTC进行计数，最具代表性的技术是目前唯一获得美国FDA批准的CellSearch系统，它被批准用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中CTC的。这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒对癌症患者7.5毫升血液中CTC进行捕获，然后通过细胞固定、透膜、以及三重的免疫荧光染色(DAP1、CK、⑶45)，将DAPI+/CK+/⑶45-且符合一定形态学标准的细胞定义为CTC并计数。临床试验(Cristofanilli M, Budd T, Ellis MJ, etal.N.Engl.J.Med.2004, 351, 781-791 ；Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, et al.Clin.Cancer Res.2007, 13, 920-928 ；Cohen SJ，Punt CJA，Iannotti N，et al.J.Cl in.0ncol.2008，26，3213-3221)发现转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌患者7.5毫升血液中检测到5个及以上的CTC预后较差，反之则预后较好，因此美国FDA在2004、2007与2008年分别批准CellSearch系统用于转移性乳腺癌、结直肠癌与前列腺癌的预后评估、无进展生存期和总生存期的预测，我国国家食品药品管理局在2012年8月批准CellSearch系统用于乳腺癌的预后评估。
[0004]然而，仅对全体CTC进行计数无法全面准确的反映肿瘤病灶当前的状态以及转移的风险，其原因在于研究发现CTC具有很大的功能异质性，相当一部分CTC处于凋亡状态，只有很小一部分CTC能够实现转移，这与临床上观察到的是一致的，因此临床上需要真正关注的是那一小部分具有高度活力与转移潜能的CTC。目前已有研究以活CTC (通过活细胞染料或分泌蛋白来确定细胞活性)数目或者活CTC占总CTC的比例为标志物进行临床研究探索CTC的应用领域，但细胞活性本身仍然与肿瘤细胞的恶性程度相关性较低，目前尚缺乏对CTC功能进行检测以确定CTC恶性程度与转移可能性的技术与设备。
[0005]因此，本领域迫切需要开发能够有效、快速地检测具有高度活性与恶性程度的CTC的技术。
【发明内容】
[0006]本实用新型的目的就是提供一种有效、快速地检测肿瘤患者血液中游离的CTC的恶性程度的检测装置。
[0007]本实用新型提供了一种用于检测循环肿瘤细胞代谢活动的装置，所述装置包括:
[0008](a)鱼骨形芯片；
[0009](b)微孔阵列芯片；和
[0010](c)第一容器，以及置于所述第一容器中的带有可检测标记物的葡萄糖类似物。
[0011]在另一优选例中，所述的装置还包括:(d)任选的用于捕获循环肿瘤细胞的磁珠，所述磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体；和
[0012](e)任选的磁场装置，所述磁场装置包括永久磁铁或电磁铁。
[0013]在另一优选例中，所述的装置还包括:
[0014](f)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂(如牛血清白蛋白)。
[0015]在另一优选例中，所述的装置还包括:
[0016](g)第三容器，以及位于所述第三容器内的用于区分循环肿瘤细胞和白细胞的抗体，例如针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如ant1-CD45-FITC)。
[0017]在另一优选例中，所述的装置还包括:
[0018](h)第四容器，以及位于所述第四容器内的用于识别死细胞的死细胞染料(如EthD-1，ethdium homodimer-1)。
[0019]在另一优选例中，所述的鱼骨型芯片具有以下结构:芯片设有一个入口和一个出口，通道呈连续的S型，宽度1±0.2mm，通道间间隔1±0.2mm，直边长30_70mm，一共5_15条直边。
[0020]在另一优选例中，所述的鱼骨型芯片具有以下结构特征:芯片的横截面呈现周期性的凹凸结构，由两层光刻胶构成，上层的鱼骨图形呈周期性排列，鱼骨宽度为125±20μπι，水平夹角为45±5°，周期性间隔为75±10μπι。
[0021]在另一优选例中，所述的磁珠的粒径为1-1000纳米，更佳地为10-500纳米。
[0022]在另一优选例中，所述的磁珠的粒径为1-1000微米，更佳地为10-500微米。
[0023]在另一优选例中，所述的磁珠的粒径为1-20毫米，更佳地为1-5毫米。
[0024]应理解，在本实用新型范围内中，本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附图说明】
[0025]图1显示了本实用新型装置的示意图。
[0026]图2显示了本实用新型一个实例中，鱼骨型芯片的结构示意图。该芯片设有一个入口和一个出口，通道呈连续的S型。直边长50mm，一共9条直边。
[0027]图3显示了图2所示芯片的通道。其中通道宽度1mm，通道间间隔1mm。
[0028]图4显示了图2所示芯片的横截面。其中芯片的横截面呈现周期性的凹凸结构，由两层50 μπι的SU8光刻胶制备而成，上层的鱼骨图形呈周期性排列，鱼骨宽度为125 μm，水平夹角为45°，周期性间隔为75 μπι。
【具体实施方式】
[0029]本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够有效、快速地检测血液中极稀有的CTC的恶性程度的装置和方法。利用该装置，一方面尽可能保持CTC的活力，减少或避免在富集分离过程中对CTC的损失，另一方面通过特殊处理使得处于休眠状态的CTC转变为非休眠状态，进而通过测定细胞摄取葡萄糖的水平，从而高效、快速而准确地检测出具有高活力和/或转移潜能的CTC。在此基础上完成了本实用新型。
[0030]具体地，利用本实用新型，基于例如免疫磁珠等方法捕获CTC，并通过微控阵列芯片与磁场的使用避免在对CTC的代谢活性检测过程中由于更换溶液、清洗等操作导致CTC的损失或受损。此外，由于CTC的体外分离过程常造成其处于生长抑制、低代谢活性的状态，因此通过复苏处理等步骤营造恢复或促使CTC的生长增殖，进而使其恢复到较好的状态下进行葡萄糖摄取的检测，从而使得检测结果更准确和可靠。
[0031]术语
[0032]如本文所用，术语“2-NBDG”指(2_(N-(7_nitrobenz-2-oxa-l，3-diazol_4-yl)amino)-2-deoxyglucose)即(2_ (N_ (7_ 硝基苯并 _2_ 卩惡 _1，3_ 二卩坐 _4_ 基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)，它是一种带有荧光标记的葡萄糖类似物。
[0033]循环肿瘤细胞CTC
[0034]循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cell)是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。
[0035]在本实用新型中，适用于本发明方法的CTC细胞没有特别限制，可以是源自各种不同实体瘤的肿瘤细胞。代表性