专利名称：细胞性免疫的诱导方法以及被诱导了细胞免疫的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞免疫的诱导方法及被诱导了细胞免疫的细胞。进一步说明为与以前的疫苗相比，通过使疏水化多糖类与抗原构成的复合物与抗原呈递细胞在体外进行反应，能使细胞免疫特别是对抗原显示特异性细胞杀伤性T细胞(以下简称为CTL)受到激活、诱导。
背景技术：
众所周知，CTL以其T细胞受体为介导，特异性识别癌细胞或病毒感染细胞，进行破坏、杀伤，对于体内癌或病毒，它作为机体防御系统是非常重要的。近年来研究发现，CTL的T细胞受体不直接识别表达于感染了癌或病毒的细胞表面上的特异性抗原，而是识别Ⅰ类MHC抗原以及结合于其上的特异抗原的寡肽(其特异抗原的“CTL抗原决定基”)复合体。其中，Ⅰ类MHC抗原被表达于巨噬细胞、树状细胞这一抗原呈递细胞和癌细胞或病毒感染细胞自身的表面。
认为这种MHCⅠ抗原/源于特异抗原的寡肽复合体是经过以下修饰加工过程生成的。即、抗原蛋白在细胞质内合成后，其中的一部分由细胞内蛋白酶复合体分解为寡肽。然后，其中的一部分(9-10个氨基酸残基)进一步被内质网膜上的输送蛋白、TAP(Transporter in antigenprocessing)，从细胞质输送到内质网内。其中，与MHCⅠ抗原亲和性强的优先与MHCⅠ抗原结合，呈现于细胞表面。
因此，通过排除癌细胞或病毒感染细胞或自身抗原反应性淋巴细胞，达到治疗或预防癌、病毒疾病或自我免疫疾病这一目的，为了人为地活化CTL，有必要用表达了特异抗原的癌细胞或病毒感染细胞自身进行机体免疫，或将特异抗原或源于该特异抗原的寡肽导入抗原呈递细胞的上述加工修饰过程，使之作为与Ⅰ类MHC抗原形成的复合体进行表达。
实际上，为开发这种“CTL活性疫苗”，人们尝试进行了如下研究。1)将特异抗原蛋白质密码的基因导入病毒载体等、2)用某种方法将含有若干CTL抗原决定部位、一定大小的特异抗原蛋白质导入细胞质内、3)9-10个氨基酸的寡肽直接结合于抗原呈递细胞的Ⅰ类MHC抗原上。其中，上述氨基酸来源于能够成为CTL表位的特异抗原。
在这些方法中，1)方法相当于所谓的基因治疗。一般来说，关于该法的效果、安全性尚未达到能确切评价的地步。另外，关于3)方法，虽然在动物实验中其效果得到了确认，但当应用于人时，认为存在一些实际问题。即、患者每个人所带的Ⅰ类MHC抗原的种类多种多样，因此有必要覆盖对应于这种多样性而产生的多样性CTL表位。换言之，必须搞清楚对应于各个Ⅰ类MHC抗原的高亲和性寡肽的氨基酸序列，并进一步实现将对应于Ⅰ类MHC抗原的特制物作为医药品，可以想象其实际开发会相当困难。
一方面，方法2)有若干具体实施例，在效果、安全性上能够满足要求，并且认为更有可能开发成对应于各个患者的、有实用性的CTL活性化疫苗。实际上，将特异性抗原蛋白质以寡肽形式给予机体，在激活特异性CTL时，多数情况下作为与某种佐剂的混合物给药。例如有イスコム(ISCOM)(Takahashi et al.,Nature,344,873-875,1990)、QS-21(Newman et al.,J.Immunol.,148,2357-2362,1992)、甘露聚糖包裹脂质体(WO92/4887公报)、AF(Raychaudhuri et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89,8308-8312,1992)等物质。
关于多糖类-胆固醇诱导体，都知道它能够作为脂质体包裹剂(特开昭61-69801号公报)以及脂肪乳剂包裹剂(特开昭63-319046号公报)使用。另外，如上所述，用含有甘露醇的多糖包裹的癌细胞抗原或病毒抗原-脂质体复合物、也就是将(抗原)蛋白质脂质体化或脂肪乳剂化后，再用多糖类-胆固醇诱导体包裹所产的物质也具有CTL诱导活性(参照WO92/4887公报)。
另外，只由多糖类-胆固醇和(抗原)蛋白质构成的复合体也能成为有用的疫苗(参照WO98/9650公报)。
发明公开本发明者就更有效地诱导细胞免疫的方法进行了锐意研究。研究结果发现使疏水化多糖类和抗原蛋白形成的复合物在体外与抗原呈递细胞反应，能更有效地激活细胞免疫，引起机体防御反应，遂促成了本发明。其中，上述疏水化多糖类是在天然多糖中导入烷基或胆固醇基而成。
即、根据本发明，能够提供诱导了细胞免疫的细胞，该细胞通过在体外使疏水化多糖类和抗原蛋白形成的复合物与抗原呈递细胞反应而制成。
按照本发明的优选方式，能够提供以下的上述细胞上述细胞，其中抗原呈递细胞是树突细胞(dendritic cell)；上述细胞，其特征在于疏水化多糖类是导入烷基或甾醇残基的多糖类；上述细胞，其特征在于多糖类具有用以下基团表示的基团，即这一基团为每100个构成多糖类的糖单位平均0.5-5个糖单位的一级羟基用下式表示-O-(CH2)mCONH(CH2)nNH-CO-O-R(式中R为烷基或甾醇残基，m为0或1,n为任意正整数)；上述细胞，其特征在于甾醇残基为胆固醇残基；上述细胞，其特征在于多糖为茁霉聚糖或甘露聚糖；上述细胞，其特征在于抗原是蛋白质，它作为寡肽提呈于Ⅰ类MHC抗原、诱导细胞杀伤性T细胞；上述细胞，其特征在于抗原是癌细胞抗原、病毒抗原或自身抗原反应性T细胞受体；上述细胞，其特征在于抗原是ErbB-2蛋白质；以及上述细胞，它作为非口服制剂使用。
从另一方面看，根据本发明可以提供细胞免疫的诱导方法，其特征在于使疏水化多糖和抗原的复合物在体外与抗原呈递细胞反应。根据本发明的理想方案，能够提供上述方法，其特征在于疏水化多糖和抗原的复合物在诱导细胞免疫时使用足够的量；上述方法，其中该方法从体内取出抗原呈递细胞，用疏水化多糖类和抗原的复合物与抗原呈递细胞反应后，再返回到体内；以及上述方法，通过非口服给予的方式，返回到体内。
附图简述
图1显示的是从小鼠取出的CD4阳性T细胞群及CD8阳性T细胞群的增殖情况。纵轴分别表示用CHP-HER2、CHP-CAB处理以及未经处理的小鼠树突细胞群，横轴表示的是摄入3H胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷)的量。
图2显示的是用CHP-HER2、CHP-CAB处理正常人树突细胞时，由CTL克隆引起的细胞杀伤活性。纵轴分别表示用CHP-HER2、CHP-CAB处理的正常人树突细胞，其中，纵轴上方两项的细胞含有HLA-A2402，下方两项的细胞含有HLA-A0201。横轴表示的是在Cr51游离实验中，由CTL克隆引起的细胞杀伤活性。
图3显示的是用CHP-HER2、HER2、CHP-CAB、CAB、HER2p63-71处理正常人树突细胞后的、CTL克隆的增殖情况。纵轴表示分别用CHP-HER2、HER2、CHP-CAB、CAB、HER2p63-71(阳性对照)处理或未经处理的树突细胞，横轴表示CTL克隆的增殖。
图4显示的是对小鼠进行树突细胞群免疫时、各个个体肿瘤细胞的增殖曲线。其中，上述小鼠接种了表达人ErbB-2d的小鼠肿瘤细胞CMS7HE，树突细胞群为经由胆固醇化茁霉聚糖和癌基因产物人ErbB-2d蛋白质的复合物等处理的树突细胞。纵轴表示在测定肿瘤的长径和短径后，计算出的肿瘤的大小尺寸(mm3)，横轴表示肿瘤接种天数。图中，DC(CHP-HER2)、DC(CHP-CAB)(对照组)以及DC分别表示在免疫经CHP-ErbB2、CHP-CAB处理及未处理的树突细胞群后小鼠的数据，Notreatment表示未免疫小鼠的数据。
实施发明的最佳形态以下详细说明本发明。在本发明中，所谓[佐剂]指的是以修饰针对抗原的免疫应答为目的、与抗原一同使用的物质，通常用于产生抗体和增强细胞免疫，但有时也包含被用于免疫应答负变化的物质。
(1)抗原本发明的抗原指多肽、多肽复合物、糖蛋白、核酸等诱导免疫的物质。即便是病理学目标成分的一部分也可以，另外，也可以是新生组织或病毒感染细胞等患病组织表达的抗原。在本发明中，所使用的蛋白质作为寡肽提呈于抗原蛋白质、Ⅰ类MHC抗原，诱发CTL。
抗原蛋白质只要含有相应的抗原决定基即可，对于其起源、纯度并不作特殊限定。优选的抗原蛋白质为通过基因重组制成的抗原蛋白质。只要含有抗原决定基，对抗原蛋白质的分子量也不作特别限定，但一般为500-100,000，优选为2,000-100,000。肽断片优选使用氨基酸数为30个以上的。作为具体例子，可举出含有以下蛋白质全体及部分序列的蛋白质，它们是癌基因产物、ErbB-2(有时略称HER2)蛋白质、来源于病毒的蛋白质或T细胞受体，如自身抗原反应性T细胞受体等。
(2)疏水化多糖类疏水化多糖类的制备方法及疏水化多糖类聚合物微粒子的制备方法可以使用秋吉等的方法(Akiyoshi et al.,Maeromolecules,26,3062-3068(1993),Akiyoshi et al.,J.Proc.Japan.Acad.,71,71B,15(1995)、特开昭61-69801号公报、特开平3-292301号公报、特开平7-97333号公报)。
疏水化多糖类中的多糖是指单糖残基相互以糖苷结合而成的高分子物质，糖类成分由单糖类如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖等、双糖或低聚糖类诱导而成。糖类单位可以是1,2-、1,3-、1,4-或1,6-糖苷结合。进而，也可以是α-或β-型结合中的任意一种。结合链既可以在直链上，也可以在支链上。糖类成分理想为葡萄糖，具体可举出天然或合成的茁霉聚糖、葡聚糖、直链淀粉、支链淀粉及甘露聚糖，理想为使用甘露聚糖或茁霉聚糖。
在本发明，上述多糖类中导入疏水基，制成疏水化多糖类。作为疏水化多糖类，也可以是以特开平7-97333号公报记载的衔接物为媒介结合而成的物质。
作为疏水基一般可举出烷基或甾醇，理想为甾醇残基。作为疏水化率，例如每100个糖平均结合0.5-5个烷基或甾醇，理想为1-5个，或按重量比为结合5％以下的烷基或甾醇，但对此未作特别限定，根据抗原分子量和等电点，可使用封入率高的比例。另外，作为甾醇残基，例如可举出胆固醇、豆固醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、麦角甾醇残基等，理想为胆固醇。作为烷基，例如可举出十二烷基、十八烷基、棕榈酰基等，特别是碳数在20个以下，理想为10-18个碳的烷基。烷基是直链或支链的任意一种均可。
本发明中的疏水化多糖类是多糖类的一级羟基和上述疏水基通过任意连接基而结合成的物质。作为该连接基，例如可举出下式所示的物质。
-(CH2)mGONH(CH2)nNH-CO-O-(式中，m表示的是0或1、n是任意整数，优选为1-8的整数)另外，每一个多糖类的羟基上，也可以结合两个以上甾醇残基或烷基。
(3)用疏水化多糖类封入抗原的方法疏水化多糖类与抗原形成的复合物的分离、纯化通过在室温下混合疏水化多糖类的聚合物微粒子和抗原，然后用胶体层析法处理进行(Nishikawa,Macromolecules,27,7654-7659(1994))。
例如，如以下2篇文献(J.Am,,.Chem.Soc.,118,6110-6115(1996)、Macromolecules,27,7654-7659(1994))记载的那样，以疏水化多糖类抗原=0.1～100∶1的重量比混合，能制成直径约5-50nm粒径的复合体。
这样得到的疏水化多糖类和抗原的复合物能够直接用于本发明，根据需要也可按照常法进行灭菌等的操作。
(4)抗原呈递细胞所谓抗原呈递细胞是指向淋巴细胞传达侵入机体的异物的情报，促进该细胞活动的物质，并以此为契机免疫系统开始发挥作用。例如，可以举出树突细胞(dendritic cell)、吞噬细胞、B细胞、肝脏枯伯-细胞、胸腺上皮细胞等。Ⅱ类主要组织相容性复合物(MHC)及Ⅰ类主要组织相容性复合物(MHC)被表达于这些细胞上。作为该抗原呈递细胞，例如可举出脊椎动物、优选为哺乳动物、更优选为人来源的细胞。
关于取得树突细胞的方法，例如从动物(如小鼠)取出骨髓细胞，在粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)等的存在下，用抗体等培养制备的骨髓干细胞群数日后得到。另外，按照Ficoll方法，通过分离培养人末梢血单核细胞，在GM-CSF及白介素(IL-4)的存在下，培养附着细胞数天后也可得到。
(5)使复合物与抗原呈递细胞(树突细胞)反应的方法在上述(4)得到的树突细胞中，加入在上述(3)得到的疏水化多糖类与抗原复合物的混悬液进行培养，使之反应。优选的蛋白浓度为100μg/ml,1～50℃温度下，优选为37℃左右，培养1～48小时。
(6)细胞免疫的诱导通过上述复合物与树突细胞的反应，细胞免疫被诱导。此时，用足量的上述复合体诱导细胞免疫。细胞免疫是否被诱导，通过混合培养树突细胞和T细胞群(例如CD4阳性T细胞群、CD8阳性T细胞群)、为识别肽而制成的CTL克隆(例如为识别具有HER2的63-71号氨基酸序列的肽而制成的HER2p63-71这种CTL克隆，其中，HER2对Ⅰ类MHC有特异性作用)，再用放射性同位素标记后，能够确认T细胞群的树突细胞的杀伤力和刺激增殖能力。
关于由上述复合物诱导细胞性免疫的作用机制，尚不明确，但推测该作用是经历了在 中记述的常规Ⅰ类MHC抗原/抗原寡肽复合体加工途径。对此，可以通过使用药剂同时进行处理，能够观察到。其中，该药剂能选择性抑制该途径的各个过程。
1)能动性抑制吞噬作用的细胞松弛素D(Cytochalasin D)(例如30μg/ml)、2)蛋白质体抑制剂Lactacystin(例如100μg/ml)、3)抑制Ⅰ类MHC抗原的新生物合成的环己酰亚胺(例如10μg/ml),4)用抑制蛋白质从内质网(ER)向高尔基体转移的Brefeldin A(例如，5μg/ml)这种药剂预先处理树突细胞1至3小时、进而在与复合体反应时也进行同样处理，与未处理组相比，由上述T细胞群杀伤能力的减弱程度推测所经历过的反应途径。另外，也可以进行对照实验，即不用复合体而直接使用作为抗原抗原决定部位的寡肽与树突细胞反应，则观察不到上述抑制效果。
进而，由T细胞群杀伤能力不受下述抑制剂影响的结果推测由上述复合物诱导细胞免疫的作用机制并非经过常规反应途径以外的途径。其中，该常规途径是由于上述复合物的蛋白质缓释作用引起。这些抑制剂是5)能被动地抑制macropinocytosis的阿米洛剂(例如，0.2mM)、以及6)氯喹(例如，30μM)进行处理，其中，该抑制剂能抑制寡肽在Ⅱ类MHC抗原上的结合，而上述寡肽是在内体内，由蛋白质分解产生的。
另外，通过将上述5)得到的细胞返回到体内，能够诱导体内的细胞免疫。
例如，诱导了细胞免疫的树突细胞在维持其活性的状态下(例如，在含有通常使用的缓冲液和血液成分等的液体中)，用注射等的方法，能返回到体内(例如，血液和骨髓中)。例如，可按照下述3个文献(NATUREMEDICINE,Canser Res.,4(3),328-332(1998),Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92,8078-8082(1995),Canser Res.,56,2479-2483(1996))记载的方法，将其返回到体内。
涉及本发明的诱导了细胞免疫的细胞，能够与含有普通缓冲液(例如，HBSS、PBS等)、生理盐水、血液成分的溶液一起，以非口服的方式给予。作为给予方法，主要以注射和点滴等非口服方法给予，但并不限定于这些方法。
另外，涉及本发明的免疫诱导细胞的用量根据患者的年龄、体重、症状、疾病的严重程度等有所不同，因此，最终应该由临床医师来确定其使用量，一般来说对于一个患者，每隔数日及/或数周给予一次或数次，给予的细胞数为103个～1010个。
实施例以下，通过实施例具体说明本发明。但本发明的范围并不限定于这些实施例。
实施例1胆固醇化甘露聚糖或茁霉聚糖与癌基因产物ErbB-2蛋白质形成的复合物的制备疏水化多糖按秋吉等(Akiyoshi et al.,Maeromolecules,26,3062-3068,(1993))的方法合成。其结果，作为胆固醇化甘露聚糖(以下简称为“CHM-55-2.3”)，在分子量约55,000的甘露聚糖上(Sigma公司)，每100个单糖平均导入约2.3个胆固醇残基。另外，作为胆固醇化茁霉聚糖(以下简称为“CHP-108-0.9”)，在分子量约为108,000的茁霉聚糖上(林原生物化学研究所)，每100个单糖平均导入约0.9个胆固醇残基。在水溶液中，每一个集合体，平均7个分子的胆固醇残基汇聚形成的疏水性区域约有7个。
将上述疏水化多糖溶解于DMSO后，经PBS(pH7.9)透析，进一步用探针型超声波仪(TOMI精工制URP)，在40W超声波处理10分钟。将该物以1.2μm、0.45μm、0.2μm大小的滤膜顺序过滤，以此得到疏水化多糖微粒体水溶液。用苯酚硫酸法定量各溶液中疏水化多糖的浓度，结果CHP-108-0.9为9.62mg/ml、CHM-55-2.3为6.97mg/ml。
一方面，使用大肠杆菌表达重组蛋白质，作为抗原蛋白使用。其中，上述重组蛋白质为在癌原基因人ErbB-2蛋白质的氨基酸土、相当于1至147部分的多肽(Coussens et al.,230,1132,1985)N末端融合了组氨酸六聚物的重组蛋白质。即、使用下面显示的寡核苷酸引物2个，用PCR法扩增cDNA。其中，该cDNA含有编码相当于人ErbB-2蛋白质的氨基酸1至147多肽的部分。
TS1:5’-GGATCCATATGGCTGGCGGCCT-3’(序列表的序列号1)TS2:5’-CGACTGGATCCTATGTGAGACTTC-3’(序列表的序列号2)将所得到的449bp的DNA片段用内切酶NdeⅠ及BamHⅠ切断。进一步用限制性酶NdeⅠ及BamHⅠ切割表达质粒载体pET15b(Novagen公司)。这样，用连接酶试剂盒将cDNA的PCR DNA片段连接于约5.7kbp的NdeⅠ-BamHⅠ片段上，其中NdeⅠ-BamHⅠ来源于所制成的pET15b，将大肠菌BL21(DE3)(Novagen公司)进行转化。选择氨苄西林耐药的克隆后，按照Novagen公司附带的操作说明，纯化重组蛋白质。一般情况下，由1升培养基培养的重组体能得到约20mg的重组蛋白质。
经上述操作得到的疏水化多糖类水溶液中，加入人ErbB-2重组蛋白质溶液(PBS/6M尿素中含有2.0mg/ml的蛋白质)，进行混合，得到含有无色透明的疏水化多糖和抗原的复合体的水溶液(5mg/ml CHM或CHP,0.25mg/ml人ErbB-2重组蛋白质)。进行DLS(Dinamic LoghtScattering)测定，结果得到粒径约250nm、k2/k12=0.156的复合微粒子。以下将胆固醇化甘露聚糖和ErbB-2蛋白质的复合物略记为[CHP-ErbB2]、胆固醇化茁霉聚糖和ErbB-2蛋白质的复合物略记为[CHP-ErbB2]。
一方面，在不合疏水化多糖的同一缓冲液中，使人ErbB-2重组蛋白质不溶，析出沉淀。
作为免疫实验的阴性对照，使用碳酸酐酶Ⅱ(Signa公司，下文简记为CAB)制备，疏水化多糖和蛋白质的复合物。下文中，将胆固醇化的甘露聚糖和CAB的复合物称为“CHM-CAB”，将胆固醇化的茁霉聚糖和CAB的复合物称为“CHP-CAB”。
实施例2经胆固醇化茁霉聚糖和癌基因产物人ErbB-2蛋白质复合物处理的树突细胞群对于T细胞活性化的影响效果(T细胞增殖刺激活性)。
用实施例1制成的CHP-ErbB-2混悬液作为蛋白质，对5只雌性BALB/c小鼠，每间隔1周皮下注射免疫2次，每只小鼠注射20μg。从最终免疫算起，一周后，从免疫细胞中取出脾脏细胞，用尼龙羊毛柱选择性分离出T细胞。用抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体以及作为补体源的家兔血清处理所得到的T细胞群，制备成CD4阳性T细胞群、CD8阳性T细胞群及CD4和CD8 T细胞的混合群。
一方面，自6只雌性BALB/c小鼠取出骨髓细胞，用抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗B细胞抗体以及作为补体源的家兔血清进行处理，制成骨髓干细胞群。在GM-CSF(100单位/ml)存在下，将得到的细胞群培养6天，制成骨髓来源的树突细胞群。在所得到的树突细胞群内加入CHP-ErbB-2混悬液或CHP-CAB混悬液，调整至蛋白质浓度为100μg/ml，混合培养3小时后，洗净树突细胞群，继续培养18小时。
然后，将上述由CHP-ErbB-2混悬液免疫的CD4阳性T细胞群、CD8阳性T细胞群及其混合群和经丝裂霉素C处理的上述树突细胞群混合培养，72小时后，加入3H胸腺嘧啶脱氧核苷，观察T细胞群的增殖。
其结果如图1所示，由CHP-ErbB-2混悬液免疫的CD4阳性T细胞群、CD8阳性T细胞群及其混合群全都与CHP-ErbB-2处理过的树突细胞群反应、显示了细胞增殖作用，但经CHP-ErbB-2处理的树突细胞群以及未经处理的树突细胞群，对于T细胞群的增殖刺激无任何作用。另外，图中ErbB-2用HER2表示。
实施例3经胆固醇化茁霉聚糖和癌基因产物人ErbB-2蛋白质复合物对于正常人末梢血来源的抗原提呈能的效果(细胞损伤活性)通过Ficoll法，分离具有HLA-A2402(识别HER2p63-71)或HLA-A0201的正常人末梢血单核细胞。将细胞在塑料表面皿上培养2小时后，除去悬浮细胞，在GM-CSF(1000unit per ml)及IL-4(100unit perml)存在下，共培养10天附着的细胞。培养后，回收悬浮细胞，作为骨髓来源的树突细胞使用。
在所得到的树突细胞中加入CHP-ErbB-2或CHP-CAB混悬液，蛋白量都调整为100μg/ml的最终混浊度，培养3小时。细胞清洗2次后，进一步培养16小时后，用Sodium Cr51(50μl:100mCi)标记，进行细胞损伤性试验。作为效应细胞，使用了以CD8阳性HLA-A2402限制性识别相同肽的CTL克隆。其中，CD8阳性HLA-A2402是用自家树突细胞致敏诱导确立的。自家树突细胞为用ErbB2p63-71肽冲击具有HLA-A2402的正常人末梢血淋巴细胞而成。
其结果如图2所示，CTL克隆优先杀伤HLA-A2402来源的树突细胞，其中，HLA-A2402经CHP-ErbB2混悬液处理。但是，用CHP-CAB混悬液处理的、来源于同一个人的树突细胞和用CHP-ErbB2混悬液处理的树突细胞，其中该树突细胞由不具备HLA-A2402(具有HLA-A0201)的正常人的细胞制成，以及用CHP-CAB混悬液处理的该树突细胞，均未显示杀伤活性。
实施例4对树突细胞CTL克隆激活的效果(CTL克隆增殖刺激活性)，该树突细胞来源于正常人末梢血并且经胆固醇化茁霉聚糖与癌基因产物人ErbB-2蛋白质的复合物处理。
将树突细胞与CHP-ErbB2混悬液、CHP-ErbB2蛋白质单独、CHP-CAB混悬液、CAB蛋白质单独，共同培养3小时，上述几种液体中蛋白质的浓度调整至100μg/ml，其中，上述树突细胞是从具有HLA-A2402的人末梢血单核细胞并按上述方法制备而成。培养后，清洗，继续培养15小时。
将同一个人来源的树突细胞作为刺激细胞，探讨该细胞对于上述ErbB2 p63-71肽特异性CD8阳性HLA-A2402限制性CTL克隆的刺激能力。该其中，上述树突细胞经过这些树突细胞以及ErbB2经p63-71肽的冲击。
结果如图3所示，经CHP-ErbB2混悬液处理的树突细胞以及用来源于ErbB2的p63-71肽冲击的树突细胞与未经处理的树突细胞相比，优势性刺激CTL克隆，使之增殖。这一结果清楚地表明CHP-ErbB2蛋白质的机能为使ErbB2蛋白质摄取入树突细胞后，与树突细胞上的HLA-A2402分子一起将来源于同一种蛋白的p63-71肽提呈于蛋白质。
实施例5用胆固醇化茁霉聚糖和癌基因产物人ErbB-2蛋白质复合物处理的树突细胞群的抗癌效果按实施例2记述的方法，制成来源于骨髓的树突细胞群。在所得到的树突细胞群内加入75μg/ml蛋白量的CHP-ErbB2混悬液或CHP-CAB混悬液，混合培养3小时后，清洗树突细胞群，继续培养18小时。
对1群4只雌性BALB/c小鼠，皮下接种重组细胞CMS7HE。其中，该重组细胞为按照普通方法、在同系小鼠纤维肉芽肿细胞株(参照Deleoet al.,J.Exp.Med.,146,720,1977)上表达了选择标记的neo基因和人ErbB2的重组细胞。从肿瘤细胞接种第10天后，以1周的间隔，皮下接种以上述方法处理的树突细胞群4×105个，进行免疫。
随时间测定接种的肿瘤大小，结果如图4所示，观察到在用CHP-ErbB2处理过的细胞群，全部4只经免疫后小鼠的肿瘤增殖受到抑制以及完全消失(第4图的DC(CHP-HER2))。一方面，在用CHP-CAB处理过的树突细胞群以及未经处理的树突细胞群，被免疫的小鼠没观察到抑制肿瘤增殖的效果(第4图的D-C(CHP-CAB)以及DC)，提示该免疫操作在体内的抗原特异性及其抗癌效果。
产业上利用的可能性本发明中，诱导了细胞免疫的抗原呈递细胞比以前的疫苗能更有效地诱导细胞免疫、作为细胞治疗法也是很有用的。
序列表<110>三菱化学公司<120>诱导细胞免疫的方法和诱导了细胞免疫的细胞<130>99343M<160>2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ggatccatat ggctggcggc ct 22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2cgactggatc ctatgtgaga cttc 2权利要求
1．细胞免疫被诱导的细胞，通过在体外使疏水化多糖类和抗原的复合物与抗原呈递细胞进行反应而制备。
2．权利要求1记载的细胞，其中抗原呈递细胞是树突细胞。
3．权利要求1或2记载的细胞，其特征在于疏水化多糖类是导入烷基或甾醇残基的多糖类。
4．权利要求1至3中任意一项记载的细胞，其特征在于疏水化多糖类是具有以下基团的多糖类每100个构成多糖类的糖单位，平均0.5-5个糖单位的1级羟基用下式表示-O-(CH2)mCONH(CH2)nNH-CO-O-R式中R表示烷基或甾醇残基、m为0或1,n为任意正整数。
5．权利要求3或4记载的细胞，其特征在于甾醇残基是胆固醇残基。
6．权利要求1-5中任意一项记载的细胞，其特征在于多糖类是茁霉聚糖或甘露聚糖。
7．权利要求1-6中任意一项记载的细胞，其特征在于抗原是蛋白质，该蛋白质作为寡肽提呈于Ⅰ类MHC抗原、诱导细胞杀伤性T细胞。
8．权利要求7记载的细胞，其中抗原是癌细胞抗原、病毒抗原或自身抗原反应性T细胞受体。
9．权利要求8记载的细胞，其特征在于抗原是ErbB2蛋白质。
10．权利要求1-9中任意一项记载的细胞，其特征在于作为非口服制剂使用。
11．细胞性免疫的诱导方法，其特征在于，使疏水化多糖类和抗原的复合物在体外与抗原呈递细胞反应。
12．权利要求11或12记载的方法，其特征在于，用于诱导细胞免疫的疏水化多糖类和抗原的复合物的量足够多。
13．体内细胞免疫的诱导方法，其特征在于，从体内取出抗原呈递细胞，使疏水化多糖类和抗原的复合物与抗原呈递细胞反应后，再返回到体内。
14．权利要求13记载的方法，其中通过非口服给予的方式，将抗原呈递细胞返回到体内。
全文摘要
通过使疏水多糖类和抗原的复合物与树突细胞等抗原呈递细胞在体外进行反应,诱导了细胞免疫的细胞。其中,多糖类为结合了烷基或甾醇的多糖。被诱导了细胞免疫的抗原呈递细胞与以前的疫苗相比,比后者更能高效率诱导细胞免疫,对于细胞疗法有用。
文档编号A61K39/00GK1321189SQ9981169
公开日2001年11月7日 申请日期1999年9月30日 优先权日1998年10月2日
发明者珠玖洋, 砂本顺三 申请人:三菱化学株式会社