犬埃里希体120－kda免疫优势抗原性蛋白和基因的制作方法

专利名称：犬埃里希体120－kda免疫优势抗原性蛋白和基因的制作方法
背景技术：
发明领域本发明总的涉及寄生菌的分子生物学领域，特别是立克次体型疾病和埃里希菌的制剂。更具体的，本发明涉及犬埃里希体120-kDa免疫反应性蛋白质基因的分子克隆和特征确定。
相关领域描述埃里希体亚种是专性胞内革兰氏阴性菌，它寄居在造血细胞的核内体中，并感染各种动物宿主，包括人、家畜和野生犬科动物、鹿、马、羊、牛和野生啮齿动物等。埃里希体族的每个成员都有其自己的特定靶细胞向性。埃利希种属的大多数种是单核细胞向性(犬埃里希体(E.canis)、恰菲埃里希体(E.chaffeensis)、腺热埃里希体(E.sennetsu)、里氏(E.risticii)和小鼠埃里希体(E.muris))或粒细胞向性(人粒细胞埃里希体、马埃里希体(E.equi)、嗜吞噬细胞埃里希体(E.phagocytophila)和尤氏埃里希体(E.ewingii))，除了在宿主内皮细胞中生长的反刍类考德里氏体(Cowdria ruminantium)和边缘无形体(anaplasma marginale)，一种红细胞寄生生物外。
虽然在本世纪早期已描述了埃里希体，但它们并未引起注意，因为它们在美国被视为仅对兽医学重要的病原体，直到这十年来。对埃里希体重新引起兴趣是由于出现了感染人的埃里希体。近10年来，美国发现了两种新的人埃里希氏属病原体(恰菲埃里希体和人嗜吞噬细胞埃里希体样生物体)(Bakken JS 1994，Chen SM.1994.JCM，Fishbein DB，1987，Maeda，K.，1987)。犬埃里希体，该属的原型菌种，是犬埃里希病的致病因子，实际上5种埃里希体中仅一种天然感染犬。犬埃里希病是一种由棕色犬虱(Rhipicephalus sanguineus)传播的全球性疾病(Groves MG，1975，Lewis GE Jr，1977)。犬埃里希体导致轻度的短暂性急性热病，而且可发展成严重疾病和致命的综合征(热带犬全血细胞减少症)(Buhles WC，1974，Greene CE和J.W.Harvey.1984，Walker，JS 1970)。每年全球在治疗感染了犬埃里希体的宠物和工作犬上要花费数百万美元。而且犬埃里希体还对公共卫生造成了威胁。近来，从人中分离到了犬埃里希体或一种抗原性难以区分的生物体(Perez M，1996)。
了解犬埃里希体的基因和抗原组成对于研究犬埃里希体的发病机制和开发有效疫苗是至关重要的。犬埃里希体和恰菲埃里希体在遗传学和抗原性上密切相关(Anderson BE，1991，1992，Chen SM，1994.Am J Trop Med Hyg)。因此，犬埃里希体可能是一种用于研究单核细胞向性埃里希体亚种，包括恰菲埃里希体发病机制的合适模型。
现有技术的缺陷在于，没有对犬埃里希体的免疫反应性基因进行克隆并确定特征。另外，现有技术的缺陷还在于，没有这些犬埃里希体免疫反应性基因的重组蛋白质。本发明填补了本领域该长期以来的需要和愿望。
发明简述在本发明的一个实施例中，提供了一种基因，它编码犬埃里希体的120kDa免疫反应性蛋白质。优选的，该蛋白质具有SEQ ID NO8的氨基酸序列，而且该基因具有SEQ ID NO7的核酸序列。
在本发明的一个优选例中，提供了一种表达载体，该载体含有一个基因，它编码犬埃里希体的120kDa免疫反应性蛋白质，而且当该载体被引入细胞时，能表达该基因。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种重组蛋白质，该蛋白质含有SEQ IDNO8的氨基酸序列。优选氨基酸序列是由SEQ ID NO7的核酸序列编码的。优选的，该重组蛋白质含有14个串联重复单元，各具有36个氨基酸。较更优选的，该重复单元是亲水的。而更优选的，该重组蛋白质是一种抗原。
在本发明的一个优选例中，提供了一种产生重组蛋白质的方法，包括步骤获得含有一表达区的载体，该表达区含有编码氨基酸序列SEQ ID NO8的(核酸)序列，该序列和一启动子可操纵性连接；将载体转染入细胞；并在有效表达表达区的条件下培养细胞。
在某些实施例中，可描述本发明抑制人体内犬埃里希体感染的方法，包括步骤鉴定怀疑接触过或被犬埃里希体感染的个体；并施给剂量能有效抑制犬埃里希体感染的含有犬埃里希体120kDa抗原的组合物。该抑制可通过任何方法，如刺激个体的体液或细胞免疫应答，或用其它方法，如抑制120kDa抗原的正常功能，或甚至与该抗原竞争同个体内某些药剂发生相互作用。
本发明的其它和进一步的方面、特征和优点将在下面公开给出的，对本发明的优选例的描述中变得明显。
附图简述因此，将获得并详细理解本发明上述特征、优点和目的中的内容，以及其它将变得清楚的内容，更具体的、对本发明上面简述的内容将参考某些在附图中说明的实施例。这些图是说明书的一部分。然而要注意的是，


了本发明的优选例，因此不应认为是对其范围的限制。
图1显示了恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因(方框)的寡核苷酸引物的DNA序列和位置和该基因旁侧的DNA序列(线)。对于分别在120kDa蛋白基因上游和下游的DNA序列，引物的位置表示成-和+。组合每个正向引物(SEQ ID NO1-3)和每个反向引物(SEQ ID NO4-6)，形成9对引物，用来PCR扩增犬埃里希体120kDa蛋白基因。
图2A显示了犬埃里希体120kDa蛋白基因重复单元的琼脂糖凝胶电泳。首先用EcoR I消化pCA120，以释放插入物，然后在不同时间点用Spe I消化。图2B显示了DNA印迹法，确定了重复数。来自A区凝胶的DNA经Spe I消化35分钟，转移到尼龙膜上，与异羟基洋地黄毒甙元标记的寡核苷酸探针杂交，该探针和犬埃里希体120kDa蛋白质基因重复区上游的DNA序列退火。ND＝未消化的DNA。
图3显示犬埃里希体120kDa蛋白质基因(SEQ ID NO7)的DNA序列，和推测的氨基酸(SEQ ID NO8)。下划线的是重复1、3、5、7、9、11和13的核酸。
图4显示了犬埃里希体120kDa基因重复单元的系统发育树。标尺代表DNA序列中的差异百分数。
图5显示了犬埃里希体的120kDa蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO10)和恰菲埃里希体的120kDa蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO9)的排列。竖线代表相同的氨基酸。点代表保守替换。
图6显示犬埃里希体和恰菲埃里希体120kDa蛋白质的表面概率和疏水性。箭头之间的区域代表重复域。两种蛋白中的所有重复都是亲水和表面暴露的。犬埃里希体120kDa蛋白质的第二个重复单元和恰菲埃里希体120kDa蛋白的第一个重复单元的峰在两个箭头之间，并在图7中被放大。
图7显示对犬埃里希体和恰菲埃里希体120kDa蛋白质的重复单元中的表面暴露的氨基酸的比较。图7A显示了氨基酸的表面概率。用图6的两个箭头表示对应区域。黑体字母表示犬埃里希体和恰菲埃里希体之间的保守氨基酸。图7B显示了A区所示的氨基酸序列的排列对比(SEQ ID NO11-12)。竖线代表相同氨基酸。点代表保守置换。
图8显示用Spe I部分消化的所有犬埃里希体菌株的犬埃里希体120kDa基因的琼脂糖凝胶电泳。首先用EcoRI消化重组的pCR2.1质粒，以从载体释放插入物，然后用Spe I部分消化。未消化的Oklahoma菌株120kDa基因DNA用EcoR I消化，但不用Spe I，以显示插入物的大小。
图9A显示大肠杆菌表达的犬埃里希体120kDa蛋白质的SDS-PAGE。1，GST融合蛋白；2，从GST融合蛋白上用纤维蛋白酶切下的犬埃里希体重组120kDa蛋白质。图9B显示了表达犬埃里希体120kDa蛋白的pGEX质粒的琼脂糖凝胶电泳。箭头指出了插入物。
图10显示了与犬埃里希体抗原(泳道1)和120kDa重组蛋白反应(泳道2，箭头)的小鼠抗-犬埃里希体120kDa重组蛋白血清的蛋白质免疫印迹。
图11显示了与重组的犬埃里希体120kDa蛋白质反应的，犬恢复期血清的蛋白质印迹。
发明详述根据本发明，使用本领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中被充分解释。见例如，Maniatis，Fritsch & Sambrook，“分子克隆实验手册”(1982)；“DNA克隆实践方法”，卷I和II(D.N.Glover编，1985)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编，1984)；“核酸杂交”[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1985)]；“转录和翻译”[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1984)]；“动物细胞培养”[R.I.Freshney编(1986)]；“固定化细胞和酶”[IRL Press(1986)]；3.Perbal，“分子克隆实践指南”(1984)。
因此，如果在本文中出现，下列术语具有以下定义。
本文所述的氨基酸优选是“L”构型。然而，可用“D”构型的残基取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保持所要的免疫球蛋白结合的功能特性。NH2指多肽氨基末端的游离氨基。COOH指多肽羧基末端的游离羧基。为了与标准多肽命名法，生物化学杂志，2433552-59(1969)保持一致，下表显示了氨基酸残基相应的缩写对应表符号氨基酸1-字母3-字母Y tyr酪氨酸G Gly甘氨酸F Phe苯丙氨酸M Met甲硫氨酸A Ala丙氨酸S Ser丝氨酸I Ile异亮氨酸L Leu亮氨酸T Thr苏氨酸V Val缬氨酸P Pro脯氨酸K Lys赖氨酸H His组氨酸Q Gln谷氨酰胺E Glu谷氨酸W Trp色氨酸R Arg精氨酸D Asp天冬氨酸N Asn天冬酰胺C Cys半胱氨酸必须注意，本文的所有氨基酸残基序列是用式子代表的，它的左右朝向是常规的氨基末端到羧基末端的方向。另外，应注意的是氨基酸残基序列开始或末尾处的横线表示与另一条一个或多个氨基酸残基的序列连接的肽键。上表将本文中出现的3-字母和1-字母符号相关联。
“复制子”是一种基因元件(如质粒、染色体、病毒)在体内起到DNA复制的自发单位作用；即能在其自身的控制下复制。“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体和粘粒，另一条DNA节段可与其结合，从而引起结合节段的复制。
“DNA分子”指脱氧核糖核酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)的聚合形式，不论单链形式还是双链螺旋。该术语仅指分子的一级和二级结构，不将其限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括尤其在线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论结构时，根据常规，本文仅给出沿DNA非转录链(即与mRNA序列同源的链)5’到3’方向的序列。
“复制起始点”指参与DNA合成的DNA序列。DNA“编码序列”是双链DNA序列，当置于合适的调控序列的控制下时，在体内被转录并翻译成多肽。5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定了编码序列的边界。编码序列可包括，但不限于原核序列、来自真核生物mRNA的cDNA、真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸信号、终止子等，提供了宿主细胞中编码序列的表达。
“启动子序列”是能在细胞中结合RNA聚合酶，并引发下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。为了限定本发明，启动子序列的边界在其3’端为转录起始位点，并向上游(5’方向)延伸包括引发可检测的超过背景水平的转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列中，可找到一发现转录起始位点，和蛋白结合域(共有序列)，负责RNA聚合酶的结合。真核启动子常常，但不是总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子含有Shine-Dalgarno序列和-10和-35共有序列。
“表达控制序列”是控制和调节另一DNA序列转录和翻译的DNA序列。当编码序列在细胞中的转录和翻译控制序列的“控制下”，RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后翻译成编码序列编码的蛋白质。
“信号序列”可包括在编码序列附近。该序列编码信号肽，该多肽的N-末端，与宿主细胞联系，指引该多肽到细胞表面或将多肽分泌到介质中，而且在蛋白离开细胞前，宿主细胞将信号肽切下。可发现信号序列与各种原核和真核生物天然的蛋白有关。
本文所用的术语“寡核苷酸”指本发明的探针，定义为含有两和多个，优选三个以上脱氧核糖核苷酸的分子。它的确切大小取决于许多因素，这些因素进而又取决于该寡核苷酸最终的功能和用途。
本文所用的术语“引物”指一条寡核苷酸，不论是天然的纯化的限制性消化物，或是合成产生的，当其置于引物延伸产物合成的条件下，能作为合成起始点。在存在核苷酸和诱导剂，如DNA聚合酶和合适温度和pH下合成的引物延伸产物与一核酸链互补。引物可以是单链的，而且必须足够长，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，为了诊断用途，由靶序列的复杂程度而定，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多的核苷酸，虽然它可含有较少的核苷酸。
本文选择的引物是“充分”和具体靶DNA序列的不同链互补。这意味着引物必须是充分互补，与它们各自链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，可将非互补的核苷酸片段与引物的5’末端结合，而引物剩余的序列和该链互补。另外，可将非互补碱基或较长的序列分散在引物中，只要引物序列和序列充分互补或与其杂交，从而形成延伸产物合成的模板。
本文所用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指酶，它们每种都能在特异性核苷酸序列处或附近切开双链DNA。
用外源或异源DNA“转化”细胞，当这样的DNA被引入细胞时。转化的DNA可以或可以不整合(共价连接)入细胞基因组。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化的DNA可维持在附加型元件，如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是一种其中转化DNA整合在染色体内，从而通过染色体复制被子代细胞继承的细胞。该稳定性可由真核细胞建立一群含有转化DNA的子细胞的细胞系或克隆的能力所证实。“克隆”是一个细胞或祖先通过有丝分裂产生的一群细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原代细胞克隆。
两条DNA序列当在确定长度的DNA序列至少约75％(优选至少约80％，和最优选至少约90％或95％)核苷酸匹配时，这两条DNA序列是“充分同源的”。可用在序列数据库中可得的标准软件，或在为特定系统确定的严格条件下进行的DNA杂交实验中，比较二序列来鉴定充分同源的序列。确定合适的杂交条件是本领域技术范围内的。见例如Maniatis等，见上；DNA克隆，卷I&II见上；核酸杂交，见上。
DNA构建物的“异源”区是较大DNA分子中一种可鉴定的DNA节段，发现它与自然中的较大分子无关。因此，当异源区编码一哺乳动物基因时，该基因两侧的DNA常常不是来源生物体基因组中该哺乳动物基因组两侧的DNA。在另一个例子中，编码序列是一种构建物，其中该编码序列本身在自然中未发现(如基因组编码序列含有内含子或具有与天然基因密码子不同的合成序列)。等位变体或天然发生的突变不会产生本文定义的DNA异源区域。
这些研究最常用的标记是放射性元素、酶、在暴露于紫外光时会发荧光的化学物质等。许多荧光物质是已知的，可用作标记。这些物质包括例如荧光素、罗丹明、金胺、Texas Red/AMCA蓝和Lucifer Yellow。特别的检测材料是在山羊中制备的抗-兔抗体，并和荧光素通过异硫氰酸偶联。
还可用放射性元素或酶标记蛋白质。可用任何现有计数程序检测放射性标记。优选同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
类似的可使用酶标记，并可用任何现在使用的显色、分光光度、荧光分光光度、电流分析或气流分析技术检测。酶和所选颗粒通过与桥联分子，如碳二亚胺、二硫氰酸、戊二醛等反应而偶联。可用于这些过程的许多酶是已知的。优选的是过氧化物酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。参见美国专利号3,654,090，3,850,752和4,016,043所公开的其它标记物质和方法。
在本领域中已开发和使用的特定试验系统称为受体试验。在受体试验中，将要分析的物质适当标记，然后用一定量的标记接种某种细胞测试集落，然后进行结合研究，来确定标记物质与细胞受体结合的程度。用该方法，可确定物质之间亲和力的差异。
在本领域中有用的一种试验称为“顺/反”试验。简单说，该试验使用两种基因构建物，其中一种通常是质粒，当它被转染入合适细胞系时，可连续表达感兴趣的特定受体，而第二种是在受体/配体复合物控制下能表达报道物，如荧光素酶的质粒。因此例如，如果需要评价作为某特定配体的受体的化合物，可构建质粒之一，使得该受体在所选细胞系中表达，而第二种质粒具有和荧光素酶基因连接的启动子，其中插入了对特定受体的反应元件。如果测试的化合物是该受体的刺激物，配体将和该受体复合，而产生的复合物将与反应元件结合，引发荧光素酶基因转录。然后用光度测量产生的化学发光，获得剂量反应曲线，并与已知配体比较。美国专利号4,981,784详细描述了上述方法。
本文所用的术语“宿主”指不仅包括原核生物，还包括真核生物，如酵母、植物和动物细胞。可用编码本发明犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白的重组DNA分子或基因，使用本领域技术人员已知的技术转化宿主。尤其优选的是采用载体(该载体含有编码本发明犬埃里希体120kDa的免疫反应性蛋白基因的编码序列)转化原核生物。
原核宿主可包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)和枯草芽胞杆菌。真核宿主包括毕赤酵母等酵母菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
一般与宿主联用含有启动子序列(促使插入DNA片段充分转录)的表达载体。表达载体通常含有一复制起始点、启动子、终止子和能在转化细胞中提供表型选择性的特异性基因。可根据本领域已知方法发酵或培养转化的宿主，以实现最佳细胞生长。
本发明包括一种足够纯的、编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的DNA，该DNA的一条链在高度严格条件下，将和含有SEQ ID NO6的至少15个连串核苷酸序列的探针杂交。本发明的DNA编码的蛋白质和图3(SEQ ID NO7)中列出的核酸具有至少80％(优选85％，更优选90％，最优选95％)相同的序列。更优选的，该DNA包括SEQ ID NO8的编码序列或该序列的简并变体。
与本发明的DNA杂交的探针优选包括SEQ ID NO8中列出的核苷酸编码序列或其互补序列的至少20个，优选至少40个，更优选50个，最优选100个连串核苷酸序列。这样的探针可用于检测人细胞中犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质基因的表达，使用的方法包括步骤(a)使从人细胞获得的mRNA与标记的杂交探针接触；和(b)检测探针和mRNA的杂交。
本发明还包括一种足够纯的DNA，它含有SEQ ID NO8中列出的核苷酸区域的至少15个，优选20个，更优选30个，更优选50个，最优选全部的连串核苷酸序列。
“高度严格”指以高温和低盐浓度为特征的DNA杂交和洗涤条件，如65℃，盐浓度约0.1xSSC的洗涤条件，或功能相当的条件。例如，高度严格条件可包括在约50％甲酰胺的存在下，约42℃杂交；用含有1％SDS的约2xSSC在约65℃第一次洗涤；然后用约0.1xSSC在约65℃第二次洗涤。
“基本纯的DNA”指没有DNA天然存在环境的一部分的DNA，可通过分离(部分或完全纯化)该环境中的某些分子，或通过改变所称DNA的旁侧序列而得到。因此术语包括例如掺入载体、自身复制的质粒或病毒中、或掺入原核或真核生物的基因组DNA中；或作为分离分子(如聚合酶链式反应(PCR)或限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在，独立于其它序列之外的重组DNA。它还包括重组DNA，它是编码其它多肽序列，如融合蛋白的杂交基因的一部分。还包括重组DNA，它包括SEQ ID NO8中列出的核苷酸的一部分，它编码一种编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的基因的另一种剪接变体。
该DNA可具有与SEQ ID NO8中列出的核苷酸编码序列至少约70％，优选至少75％(如，至少80％)；和最优选至少90％相同的序列。两条序列之间的相同性是相匹配或相同位置数的直接函数。当两条序列中的一个亚基位置为同一单体亚基占据，例如，如果两条DNA分子中的某给定位置都为腺苷酸占据，那么它们在该位置是相同的。例如，如果在长度为10个核苷酸的序列中，有7个位置和第二条10个核苷酸序列中相应位置是相同的，那么这两条序列具有70％相同的序列。比较序列的长度一般至少是50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少75个核苷酸，最优选至少100个核苷酸。通常用序列分析软件(如Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 Unversity Avenue，Madison，WI 53705的序列分析软件包)测量序列相同性。
本发明包括一个载体，它含有一条编码一基因的DNA序列，该基因编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质，所述载体能在宿主中复制，它包括可操纵连接的；a)复制起始点；b)启动子；和c)编码所述蛋白质的DNA序列。优选的，本发明的载体含有SEQ ID NO8中所示DNA序列的一部分。“载体”可定义为可复制性核酸构建物，如质粒或病毒核酸。可用载体扩增和/或表达编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的核酸。表达载体是一种复制构建物，其中编码多肽的核酸序列与能影响多肽在细胞中的表达的合适的控制序列可操纵性连接。对控制序列的需要视所选的细胞和所选的转化方法而不同。一般，控制序列包括转录启动子和/或增强子，合适的mRNA核糖体结合位点，和控制转录终止和翻译的序列。可用本领域技术人员熟知的方法构建含有合适转录和翻译控制信号的表达载体。见例如，Sambrook等，1989，分子克隆实验手册(第二版)Cold Spring，Harbor Press，N.Y.所述的技术。如果转录控制序列有效控制该基因的转录，基因及其转录控制序列就称为“可操纵性连接”。本发明的载体包括但不限于，质粒载体和病毒载体。本发明优选的病毒载体是衍生自反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40病毒或疱疹病毒的载体。
“基本纯的蛋白质”指与至少一部分天然伴随成分相分离的蛋白质。通常，当某蛋白质从与其在体内天然相伴的蛋白质或其它天然存在的有机分子中分离出至少60％重量时，它是基本纯的。优选的，制备物的纯度至少是75％，更优选至少90％，最优选至少99％(重量)。可通过从天然来源抽提；通过编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的重组核酸的表达；或通过化学合成蛋白质，获得足够纯的犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质。可用任何合适的方法，如柱层析(例如，使用对犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质特异性的抗体进行免疫亲和层析)，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或HPLC分析测定纯度。当蛋白质与其天然状态时伴随的至少某些污染物中相分离时，它是基本无天然伴随的成分的。化学合成的、或在不同于天然起源细胞的细胞系统中产生的蛋白质，从定义上讲，是基本没有其天然伴随成分的。因此，足够纯的蛋白质包括在大肠杆菌、其它原核生物中或其它天然不存在的生物体中合成的真核蛋白质。
除了基本上全长的蛋白质外，本发明还包括犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质(SEQ ID NO7)的片段(如抗原性片段)。本文所用的“片段”用于多肽时，一般是长度至少10个残基，更优选至少20个残基，和优选至少30个(如50个)残基，但小于全长的完整序列。可用本领域技术人员已知的方法产生犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的片段，例如通过酶性消化天然存在或重组的犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质，通过使用编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的确定片段的表达载体的重组DNA技术，或通过化学合成。可用本文所述的方法评价候选片段显示犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质特性(如与犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质特异性抗体结合)的能力。可用纯化的犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质或犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的抗原性片段产生新的抗体，或测试已存在的抗体(如在诊断试验中作为阳性对照)，使用本领域技术人员已知的标准方法。本发明包括用犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质或犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的片段作为如兔免疫原，产生多克隆抗血清。可筛选该方法产生的单克隆抗体识别重组犬埃里希体cDNA克隆，和将它们和已知cDNA克隆相鉴别的能力。
本发明还包括犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的片段，它是由至少一部分SEQ ID NO7(如可变mRNA剪接或可变蛋白质加工的产物，或其中序列的一个节段已缺失的)所编码的。可将该片段或完整的犬埃里希体120kDa蛋白质与另一多肽如(如作为标记、配体的多肽或能提高免疫原性的蛋白)共价连接。
词组“药物学上可接受的”指当施给人时，不会产生过敏或类似的不良反应的分子或组合物。含有作为活性成分的蛋白质的水相组合物的制备是本领域熟知的。通常，将这些组合物制备成可注射的溶液或悬液；还可制备成可在注射前溶解或悬浮于液体中的固态形式。也可乳化该制备物。
可将蛋白以中性或盐形式配制在组合物中。药物学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，并和无机酸，如盐酸或磷酸，或乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等有机酸形成。还可与无机碱，如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和有机碱，如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等衍生的游离羧基形成盐。配制后，以与剂量配方兼容的方式，和治疗有效量施用这些溶液。以各种剂型，如可注射溶液施用这些制剂。
对于水溶液肠胃外施药，如需要可适当缓冲该溶液，首先用足够的盐水或葡萄糖将稀释液变成等渗。这些具体水溶液特别适合静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，本领域技术人员，根据本文公开内容将了解可使用的无菌水相介质。例如，可将一剂量溶于1毫升等渗NaCl溶液中，加到1000毫升皮下灌注液或注射到预定输液位点(见例如“Remington药物科学”15版，1035-1038页和1570-1580)。根据待治疗个体的情况，必须对剂量作某些改动。负责施药的人员将在任何情况下确定该个人的合适剂量。
如本领域熟知的，某给定多肽的免疫原性可能变化。因此，常必须将免疫原(如本发明的多肽)和一载体偶联。示范性和优选的载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)和人血清白蛋白。其它载体可包括各种淋巴因子和佐剂，如IL2、IL4、IL8等。
偶联多肽与载体蛋白质的方法是本领域熟知的，包括戊二醛、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双-二氮杂二氨基联苯。还可理解的是，该肽可与一蛋白质通过本领域熟知的基因工程技术偶联。
如本领域还熟知的，可使用非特异性的免疫应答刺激剂(称为佐剂)来增强具体免疫原的免疫原性。示范性和优选佐剂包括完整的BCG、Detox(RIBI，ImminochemResearch Inc.)ISOMS和氢氧化铝佐剂(Superphos，Biosector)。
制备含有作为活性成分的肽序列的疫苗是本领域普遍熟知的，如美国专利号4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792和4,578,770所例举的，在此全部引入以供参考。通常，将这些疫苗制成溶液或悬液等可注射剂还可制备成在注射前可溶于或悬浮于液体中的固体形式。也可乳化该制备物。常用药物学上可接受并和活性成分兼容的赋形剂混合该活性免疫原性成分。合适的赋形剂有例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。另外如需要，疫苗可含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂或增强疫苗效力的佐剂。
120kDa蛋白质是埃里希氏亚种的可能粘合素，而且在犬埃里希体的密集核心细胞表面上差异表达。通过PCR，使用衍生自犬埃里希体基因两侧DNA序列的引物扩增犬埃里希基因。对犬埃里希体基因克隆，测序，并在大肠杆菌中过度表达。犬埃里希体的120kDa蛋白质含有14个串联重复单元，各含36个氨基酸。这些重复的DNA序列彼此之间有94％的同源性。重复单元是亲水的，通过概率分析，预测可能是暴露于表面的。犬埃里希体120kDa蛋白质的全部氨基酸序列和恰菲埃里希体120kDa蛋白有30％的同源性。两个菌种的120kDa蛋白质的重复区共享预测是暴露于表面的共同氨基酸序列。重组犬埃里希体120kDa蛋白质能和犬埃里希氏病的狗恢复期的血清反应。
本发明针对编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的基因，和该基因编码的重组蛋白质。在本发明的一个实施例中，提供了编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的基因。优选蛋白质具有SEQ ID NO8的氨基酸序列，基因具有SEQ IDNO7的核酸序列。在本发明的一个优选例中，提供了一种表达载体，它含有编码犬埃里希体120kDa免疫反应性蛋白质的基因，能在该载体被引入细胞时，表达该基因。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种重组蛋白质，它含有SEQ ID NO8的氨基酸序列。优选氨基酸序列是由SEQ ID NO7的核酸序列编码的。优选该重组蛋白质含有14个串联重复单元，各含有36个氨基酸。更优选的，该重复单元是亲水的。更优选的，该重组蛋白是一抗原。
在本发明的一个优选例中，提供了一种产生重组蛋白质的方法，包括步骤获得一种载体，该载体含有表达区，该表达区含有与启动子可操纵相连接的，编码SEQ ID NO8的氨基酸序列的核酸序列；和在能有效表达该表达区的条件下培养细胞。
本文所用的术语“互补序列”是指能和第一核酸序列杂交，在严格条件下形成双链分子的核酸链。严格条件是使两条高度同源的核酸序列杂交，但排除随机序列杂交的条件。例如，低温和/或高离子强度的杂交被称为低严格度，而高温和/或低离子强度的杂交被称为高严格度。可理解可将所需严格性的温度和离子强度应用于特定长度探针，序列的长度和碱基内容和杂交混合物中甲酰胺的存在。
本文所用的术语“工程改造的”或“重组的”细胞将指在其中已引入重组基因如编码恰菲埃里希体抗原的基因的细胞。因此，工程改造的细胞可和不含重组引入的基因的天然细胞不同。因此，工程改造的细胞是具有人工引入的一个或多个基因的细胞。重组引入的基因可以是cDNA基因或基因组基因拷贝的形式，或可包括位于启动子附近，但天然不伴随所引入基因的基因。另外，可将该重组基因整合入宿主基因组，或可将其包含于载体、或细菌基因组中，转染入宿主细胞。
给出下列例子，用于说明本发明的各种实施例，而不意味以任何方式限制本发明。
实施例1埃里希体Dr.Jacqueline Dawson(Centers of Disease Control，Atlanta，GA)提供了犬埃里希体的Oklahoma菌株。Dr.Edward B.Breitschwerdt(College ofVeterinary Medicine，North Calorina State University，Raleigh，NC)提供了犬埃里希体的Florida株，和三种North Carolina分离物(Demon，DJ和Jake)。Dr.R.E.Corstvet(Louisiana State University，Baton Rouge，Louisiana)提供了犬埃里希体Louisiana株。在DH82细胞(一种犬巨噬细胞样细胞系，DawsonJE，1991)中培育埃里希体。当100％细胞被埃里希体感染时，用细胞刮棒收集DH82细胞。17,400xg离心细胞20分钟。用Braun-Sonic2000超声发生器以40W，在冰上粉碎沉淀两次。将细胞裂解液加到42％-36％-30％renografin的不连续梯度上，然后80,000xg离心60分钟。收集重带和轻带中的埃里希体(Weiss E，1975)，并用蔗糖-磷酸-谷氨酰胺缓冲液(SPG，218mM蔗糖、3.8mM KH2PO4、7.2mM K2HPO4、4.9mM谷氨酰胺，pH7.0)离心洗涤。
实施例2DNA制备物根据厂商说明，使用IsoQuick核酸抽提试剂盒(ORCA Research Inc.，Bothell，WA)从renografin密度梯度纯化的埃里希体制备了犬埃里希体的基因组DNA。用高纯度质粒分离试剂盒(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)纯化了质粒DNA。用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.，Santa Clarita，CA)纯化了PCR产物。
实施例3犬埃里希体120kDa蛋白质基因的PCR扩增根据恰菲埃里希体120-kDa蛋白质基因(SEQ ID NO1-6，图1)的DNA序列设计了引物(Yu，X-J1996)。用PCR，经30轮，94℃30秒，52℃1分钟和72℃2分钟扩增了犬埃里希体120kDa蛋白质基因。将PCR扩增的产物克隆入pCR2.1 TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
实施例4DNA测序用ABI Prism377DNA测序仪(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Foster City，CA)对DNA测序。
实施例5犬埃里希体120kDa蛋白质基因的单向缺失用Spe I限制性内切酶部分消化，从犬埃里希体120kDa蛋白质基因的5’端除去重复区域。首先用Xba I完全消化pCR120质粒，它在犬埃里希体120kDa蛋白质基因5’末端附近的质粒序列上有一个独特切割位点。然后，用Spe I部分消化该质粒。Spe I在犬埃里希体120kDa蛋白质基因的每个重复中都有一独特切割位点，但在重复区外，包括质粒载体序列外没有切割位点。为了确保合适的代表性部分消化，每5分钟从消化混合物中取出一等分。加入EDTA至最终浓度为50mM，并70℃加热10分钟停止消化。用Xba I完全消化和用Spe I部分消化后，除去了XbaI和各SpeI切割位点之间的不同数量的重复单元，产生具有不相容末端(3’端的XbaI和5’端的SpeI)缺失质粒DNA。然后用Klenow片段处理限制性酶消化的混合物，以填充末端。然后通过在琼脂糖凝胶电泳分离该限制性混合物，从内部重复中除去质粒，因为它们的分子量大小差异显著。用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGENInc.，Santa Clarita)从凝胶中抽提出缺失质粒的混合物，并用T4连接酶自连接。将缺失质粒转化入大肠杆菌菌株DH5α，并根据其大小选择，用于测序。另外，用外切酶III和Erase-a-Base系统(Promega，Madison，WI)根据厂商指示从3’末端单向缺失犬埃里希体120kDa蛋白质基因的重复区。
实施例6犬埃里希体120kDa蛋白质基因中重复数的确定将PCR扩增的所有犬埃里希体的120kDa蛋白质基因克隆入pCR2.1克隆载体(Invitrogen)。如上所述首先用EcoR I完全消化重组质粒，然后用Spe I部分消化。在1％琼脂糖凝胶上分离消化的混合物，并真空转移到尼龙膜上。使尼龙膜上的DNA条带和犬埃里希体120kDa蛋白质基因重复区上游的序列的寡核苷酸探针杂交。用异羟基洋地黄毒甙元-11-dUTP和DIG寡核苷酸加尾试剂盒(BoehringerMannheim Co.，Indianapolis，In)根据制造商的方法标记DNA探针。
实施例7基因分析用Wisconsin GCG软件包(Genetic Computer Group，Inc.，Madison，WI)和DNASTAR软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)分析了DNA序列和推定的氨基酸序列。用PSORT程序(万维网网址URLhttp//psort.nibb.ac.jp，用McGeoch(D.J.McGeoch，Virus Research，3，271，1985)的方法，和von Heijine(vonHeijing G.，1986.Nucl.Acids Res.，14，4683.)预测信号序列的存在，用Klein等(P.Klein，M.Kanhisa和C.Delisi，Biochem.Biophys.Acta.815，468，1985)的方法检测了可能的跨膜功能域)分析了该推测蛋白质的信号序列。
实施例8大肠杆菌中犬埃里希体120kDa蛋白质基因的表达由于在120kDa蛋白质基因和pGEX载体的多个克隆位点的DNA序列中没有匹配的限制性切割位点，妨碍了将犬埃里希体120kDa蛋白质基因直接克隆入pGEX表达载体中(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用PCR和正向引物(SEQID NO13)和反向引物(SEQ ID NO14)扩增了犬埃里希体120kDa蛋白质基因从核苷酸175到核苷酸1793的编码区域。将PCR产物克隆入pCR2.1 TA克隆载体(Invitrogen)，在插入物两端获得EcoR I切割位点。用EcoR I切开重组pCR2.1质粒的插入物，在琼脂糖凝胶中与质粒DNA分离。用QIAquick凝胶抽提试剂盒(QIAGEN Inc.，Santa Clarita)从琼脂糖凝胶中抽提出该插入物，并克隆入用EcoRI消化的pGEX载体中。在大肠杆菌BL21株中表达作为GST-融合蛋白质的犬埃里希体蛋白质。用谷胱甘肽琼脂糖4B珠(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)亲和纯化GST-融合蛋白质。用纤维蛋白酶从GST-融合蛋白质上切下犬埃里希体120kDa重组蛋白质。
实施例9小鼠的免疫用重组犬埃里希体120kDa蛋白质免疫小鼠，产生抗血清。将重组的p120蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，用于第一次注射；与弗氏不完全佐剂混合，用于随后注射。用50微克120kDa蛋白质和GST的重组融合物腹膜内和皮下免疫小鼠4次。
实施例10犬埃里希体120kDa蛋白质基因的检测用DNA印迹法尝试检测犬埃里希体120kDa蛋白质基因。用PCR引物对pxcf3b(SEQ ID NO3)和pxar4(SEQ ID NO5，图1)扩增了恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因，1.2kb的DNA片段，对其用异羟基洋地黄毒甙元-d-UTP标记，并作为探针用DNA印迹检测犬埃里希体中的同源基因。DNA印迹揭示，恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因探针在该探针和恰菲埃里希体基因组DNA强烈杂交的条件下不能与EcoR I消化的犬埃里希体基因组DNA杂交。该结果表明犬埃里希体120kDa蛋白质基因和同源的恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因有很大的不同。
虽然犬埃里希体和恰菲埃里希体的120kDa蛋白质基因总体的相似性很低，但可以相信，它们可能含有一些保守区域，可用来设计PCR引物，用来扩增两种120kDa蛋白质基因。因此，进一步用PCR扩增了犬埃里希体(Oklahoma株)中的120kDa蛋白质的同源基因。之前，已用恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因引物和该基因旁侧序列的引物对恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因进行了测序(图1)。三种正向引物(SEQ ID NO1-3)和3种反向引物(SEQ ID NO4-6)配对，形成9对引物。PCR结果证明，犬埃里希体DNA不被恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因编码区内的引物所扩增。用引物对pxcf2-2和pxar3(衍生自恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因两侧的非编码DNA序列)扩增了犬埃里希体基因组DNA的2.5kb的DNA片段。
实施例11犬埃里希体120kDa蛋白质基因中重复单元数目的确定用DNA印迹显示在犬埃里希体120kDa蛋白质基因中有多少重复单元。对Oklahoma株120kDa蛋白质基因DNA序列的限制性酶分析证明所有重复都具有一独特的Spe I内切酶切割位点。用Spe I部分消化pCR120质粒中的插入物。Spe I部分消化犬埃里希体120kDa蛋白质基因的DNA产生3种DNA片段带有5’末端非重复序列的重复序列；内部重复；和带有3’末端非重复序列的重复序列。Spe I部分消化后，所有带有该基因5’末端非重复序列的DNA片段开始于相同点(基因5’端)，终止于不同的重复内。根据这些DNA片段对应其重复数的长度，在琼脂糖凝胶上分离这些片段。将DNA转移到尼龙膜上，用于和DIG-标记的寡核苷酸杂交。该寡核苷酸(SEQ ID NO15)衍生自重复区上游核苷酸38-59的DNA序列。因此，该寡核苷酸仅和具有基因5’端的DNA片段杂交，不和内部重复或具有基因3’端的重复杂交。该寡核苷酸探针检测到的条带数从而代表了重复数。DNA印迹揭示了犬埃里希体中具有108bp增加的14条条带的序列梯(图2)。这些结果表明，犬埃里希体具有各108bp的14个重复。
实施例12犬埃里希体120kDa蛋白质基因的DNA序列分析将PCR扩增的犬埃里希体DNA片段克隆入pCR2.1载体。得到的重组质粒称为pCA120。用pCA120质粒DNA作为模板，对犬埃里希体DNA插入物进行测序。利用T7和M13反向引物(与该插入物旁侧的载体DNA序列互补)初步获得了DNA序列。用沿插入物步行的引物和pCA120质粒中插入物的限制性内切酶或外切酶III单向缺失对DNA进行了亚序列测序。DNA序列分析证明该DNA插入物含有2064个核苷酸的开放阅读框(ORF)(SEQ ID NO7)，它编码688个氨基酸(SEQ ID NO8)。该开放阅读框称为犬埃里希体120kDa蛋白质基因。未发现靠近该基因5’端的大肠杆菌启动子的共有DNA序列。推测的氨基酸N-端和大肠杆菌信号肽没有共有序列。在犬埃里希体120kDa蛋白质基因中有14个串联重复。各重复由108个核苷酸组成，各编码36个氨基酸(图3)。所有重复的氨基酸同源性大于94％(图4)。在第一个重复之前是一个不完整的重复，具有7个氨基酸的缺失(图3)，和其它重复具有70％的同源性。
对GenBank数据库进行FastA程序检索揭示，犬埃里希体120kDa蛋白质基因和数据库中任何已知序列不具显著同源性。犬埃里希体和恰菲埃里希体的120kDa蛋白质(SEQ ID NO10)和(SEQ ID NO9)的氨基酸同源性是30％(图5)。120kDa蛋白质在其N-末端和重复区内更保守。犬埃里希体和恰菲埃里希体120kDa蛋白质N-末端的前32个氨基酸具有50％的氨基酸同源性。两菌种的120kDa蛋白质基因有58％的DNA序列同源性。对犬埃里希体120kDa蛋白质基因上游的340bp的非编码序列DNA进行了测序，发现埃里希体这两种菌种的毗邻120kDa蛋白质基因的非编码区具有84％的同源性。
实施例13犬埃里希体120kDa蛋白质的预测定位和抗原性用Lasergene软件的蛋白质程序(DNASTRA Inc.，Madison，WI)分析了犬埃里希体120kDa蛋白质基因推定氨基酸序列的疏水性、外露概率和抗原性。预测所有重复单元是亲水和暴露于表面的(图6)。比较犬埃里希体和恰菲埃里希体的120kDa蛋白质显示，预测两种蛋白中的所有重复单元是暴露于表面的。重复的表面暴露区域在两种埃里希体中具有相同的氨基酸(SEQ ID NO11-12，图7)。这些结果提示，犬埃里希体120kDa蛋白质是一种外膜蛋白质。重复中的亲水氨基酸可能是该蛋白质的表面暴露部分。
用预测可能抗原决定簇的Jameson-Wolf法分析蛋白质，表明犬埃里希体和恰菲埃里希体的120kDa蛋白质很可能都是高抗原性的(图6)。用Rothbard-Taylor法(它定位可能的T-淋巴细胞抗原决定簇)分析蛋白质，证明犬埃里希体120kDa蛋白质有一些预测的T-细胞表位，它们全部位于重复区外的序列上。相反，恰菲埃里希体120kDa蛋白质的每个重复具有两个T-细胞表位。
实施例14其它犬埃里希株中的同源基因用PCR扩增了其它犬埃里希体菌株的120kDa蛋白质基因。从所有犬埃里希体菌株，包括Florida、Louisiana株和三种Carolina犬分离物Demon、DJ和Jake中，用引物PXCf2-2和PXAr3扩增出了一个2.5kb DNA片段。对所有犬埃里希体菌株的120kDa蛋白质基因的该节段的5’和3’两末端测序。DNA序列分析证明，重复区上游和下游的DNA序列在所有的犬埃里希体菌株中是相同的。由于为了测序，基因必须缺失，所以未对所有犬埃里希体的完整重复区进行测序。仅对全部菌株的最后一个重复和DJ株的第一个重复进行了测序。DJ和Oklahoma株的第一个重复是相同的。所有菌株中，最后一个重复的序列是相同的。所有犬埃里希体菌株120kDa蛋白质基因的同源性由它们的相同Spe I限制性物理图进一步证实(图8)。
实施例15SDS-PAGE和蛋白质印迹在大肠杆菌中过度表达犬埃里希体120kDa蛋白质基因(图9)。1620bp DNA片段(包括120kDa蛋白质基因的全部重复区)编码的该重组蛋白质作为GST融合蛋白质进行表达。在SDS凝胶上，该融合蛋白质的估计分子大小大约140kDa，它比整个犬埃里希体120kDa蛋白质(从DNA序列推测的氨基酸，仅73.6kDa)预计的分子量大得多(图9)。对重组120kDa蛋白质的小鼠抗体与犬埃里希体120kDa蛋白质反应(图10)。犬抗犬埃里希体血清也和重组犬埃里希体120kDa蛋白质反应(图11)。
实施例16讨论虽然埃里希体亚种必然是胞内细菌，但是未鉴定到埃里希体的粘附素或侵袭素基因。之前已克隆并测序了恰菲埃里希体的120kDa蛋白质基因(Yu 1997)。最近，证明恰菲埃里希体的120kDa蛋白质是外膜蛋白质，它优先表达在恰菲埃里希体的致密核心超结构形式上，但不表达在网状细胞上。表达120kDa蛋白质的大肠杆菌非侵袭性、非粘附性菌株获得了粘附和进入培养的哺乳动物细胞的能力。这些结果提示，120kDa蛋白质可以是粘附素或侵袭素，因此它可以是一种候选的疫苗。
犬埃里希体和恰菲埃里希体是抗原性密切相关的菌株。犬埃里希体和恰菲埃里希体之间16S rRNA基因的同源性是98％，nadA基因是89％(Yu 1997)。由于120kDa蛋白质在恰菲埃里希体的粘附和进入上看起来是重要的，而且这两种埃里希体菌种是密切相关的，假设在犬埃里希体中存在恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因的同类物，并具有相似的生物学功能。用来自恰菲埃里希体基因的引物PCR扩增犬埃里希体120kDa蛋白质基因证实了该假设。然而，犬埃里希体120kDa蛋白质基因和恰菲埃里希体的同源基因的DNA同源性差别很大。犬埃里希体和恰菲埃里希体的120kDa蛋白质基因的同源性仅30％。这两种埃里希体菌种基因的低同源性可以解释，用恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因探针对犬埃里希体DNA进行DNA印迹分析不发生杂交，和用恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因编码区的引物不能PCR扩增犬埃里希体基因的原因。惊人的是，犬埃里希体和恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因两侧的非编码序列比120kDa蛋白质基因的编码序列更保守。从进化的观点来说，在选择压力下编码序列比非编码序列应更保守，因为后者中的突变不会影响生物体的生存。
虽然犬埃里希体和恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因同源性不显著，考虑到它们定位在各自基因组的相似位置；有30％同源性；尤其是它们在重复区具有共同基序时，相信犬埃里希体基因是恰菲埃里希体120kDa蛋白质的同源物。然而，恰菲埃里希体和犬埃里希体120kDa蛋白质基因中氨基酸序列和重复数是不同的。恰菲埃里希体120kDa蛋白质含有4个重复，每个有80个氨基酸，而犬埃里希体120kDa蛋白质基因含有14个重复，每个具有36个氨基酸。然而，两种蛋白质中的重复都是亲水的，而且预测是暴露于表面的。甚至，尽管重复数不同，两种蛋白质的重复中暴露于表面的区域总数是非常接近的。两种蛋白质的重复单元具有由共同的亲水氨基酸构成的相同基序，而且形成这些蛋白质表面暴露区的核心。两种蛋白质的重复单元富含丝氨酸和谷氨酸。丝氨酸和谷氨酸各占犬埃里希体重复单元的19％。谷氨酸和丝氨酸各占恰菲埃里希体重复单元氨基酸的22％和15％。虽然用PSORT蛋白质定位预测程序在犬埃里希体120kDa蛋白质的N-端氨基酸中未发现信号序列，然而相信犬埃里希体120kDa蛋白质是和恰菲埃里希体120kDa蛋白质相似的表面蛋白质，后者也没有信号序列(Yu，1997)。
和恰菲埃里希体120kDa蛋白质基因一样，犬埃里希体120kDa蛋白质的预测分子量也比SDS-PAGE的电泳迁移度估计的分子量要大得多。其它含有重复区域的蛋白质，包括边缘无形体(Anaplasma marginale)(Allred DR等，1990)，Plasmodium(Kemp DJ 1987)，金黄色葡萄球菌(Hollingshead，1986，Signas 1989)和人粒细胞向性埃里希体(HGE)100kDa和130kDa蛋白质(Storey JR 1998)也已报道了该相同现象。HGE 100和130kDa蛋白质的重复单元和恰菲埃里希体120kDa蛋白质具有共同的序列(Storey，1998)。犬埃里希体和恰菲埃里希体120kDa蛋白质的异常迁移不是由某些氨基酸的高百分数引起的，因为该蛋白质的分子量比预测氨基酸的总分子量大。120kDa蛋白质的异常迁移可能和蛋白质的翻译后修饰，如糖基化有关。犬埃里希体和恰菲埃里希体120kDa蛋白质的翻译后修饰目前正在研究中。由于恰菲埃里希体的120kDa蛋白质以不同于恰菲埃里希体的超结构形式差异表达，该蛋白可能在恰菲埃里希体感染的致病机制中起作用。犬埃里希体120kDa蛋白质基因是否在犬埃里希体的致密核心细胞中优势表达在研究中。虽然大多数犬埃里希体菌株的120kDa蛋白质基因未被完全测序，但假设120kDa蛋白质基因的序列在所有的犬埃里希体中相同是合理的，因为包括非重复区以及第一和最后一个重复的已知序列在犬埃里希体的各菌株中是相同的，而且所有犬埃里希体菌株具有相同的重复数。犬埃里希体的菌株中120kDa蛋白质基因DNA序列的高度同源性和相同的重复数表明，犬埃里希体的菌株在遗传学上比恰菲埃里希体多样化较少，后者120kDa蛋白质基因的重复数在菌株之间也不同。
本文引用了下列参考文献。
1.Allred，D.R.等，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873220-4。
2.Anderson，B.E.等，1991，临床微生物学杂志292838-2842。
3.Anderson，B.E.等，1992，系统细菌学国际杂志42299-302。
4.Bakken，J.S.，等，1994，JAMA 272212-8。
5.Buhles，W.C.Jr等，1974，传染病杂志130357-367。
6.Chen，S.M.，等，1994，临床微生物学杂志32589-95。
7.Chen，S.M，等，1994，Am J Trop Med Hyg 5052-58。
8.Dawson J.E.，等，1991，传染病杂志163564-567。
9.Fishbein，D.B.，等，1987 JAMA 2573100-4。
10.Greene C.E.，等，1984，犬埃里希病p545-561，在C.E.Greene(编)，犬和猫的临床微生物学和传染性疾病，W.B.Sauders Co.，Philadelphia。
11.Groves，M.G.，等，1975，美国兽医学研究杂志36937-40。
12.Hollingshead，S.K.，等，1986生物化学杂志2611677-86。
13.Kemp，D.J.，等，1987，微生物学年鉴41181-208。
14.Jameson，B.A.，等，1988 CABIO，4181-186。
15.Klein，P.，等，1985，Biochem.Biophys.Acta，815468-76。
16.Lewis，G.E.Jr等，1977，美国兽医学研究杂志381953-5。
17.Maeda，K.，N等，1987新英格兰医学杂志316853-856。
18.McGeoch D.J.，1985病毒学研究3，271-86。
19.Perez，M.，等，1996，临床微生物学杂志342133-9。
20.Rothbard，J.B.，等，1988 EMBO J 793-100。
21.Signas，C.，等，1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86699-703。
22.Storey，J.R.，等，1998，感染，免疫学661356-63。
23.von Heijine G.1986核酸研究144683-90。
24.Walker，J.S.，等，1970 J Am Vet Med Assoc.15743-55。
25.Yu，X-J.，等，1996，基因184149-54。
26.Yu X-J等，1997，FEMS微生物学通信15453-8。
本说明书提到的任何专利或出版物指出了本发明涉及的领域中技术人员的水平。这些专利和出版物在此引入以供参考，程度相同，如同各独立出版物是特别和单独表明引入以供参考的一样。
本领域技术人员将易于理解，本发明适用于实施提到的目的和获得提到的结果和优点，以及与之相关的。本文描述的实施例、方法、程序、处理、分子和特定的化合物以优选例为代表，是示范性的，而不意味着限制本发明的范围。本领域技术人员对其中所作的改变和其它用途都将包括在权利要求所述的本发明的范围内。
序列表<110>Walker，David H.
Yu，Xue-jie<120>犬埃里希体120kDa免疫优势抗原性蛋白基因<130>D6143PCT<140>
<141>1999-08-07<150>US 09/141,047<151>1998-08-27<160>15<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<222>-341..-321<223>用于扩增编码120kDa免疫反应性蛋白的基因的正向引物pxcf-2<400>1gaaacaatct accgggcata c 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<222>-110..-56<223>用于扩增编码120kDa免疫反应性蛋白的犬埃里希体基因的正向引物pxcf3<400>2gagaattgat tgtggagttg g 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<222>38..59<223>用于扩增编码120kDa免疫反应性蛋白的犬埃里希体基因的正向引物pxcf3b<400>3cagcaagagc aagaagatga c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<222>1258..1237<223>用于扩增编码120kDa免疫反应性蛋白的犬埃里希体基因的反向引物pxar5<400>4atctttctct acaacaaccg g 21<210>5<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<222>1454..1433<223>用于扩增编码120kDa免疫反应性蛋白的犬埃里希体基因的反向引物pxar4<400>5acataacatt ccactttcaa a 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<222>49..70<223>用于扩增编码120kDa免疫反应性蛋白的犬埃里希体基因的反向引物pxar3<400>6aaacaaaaaa atagcaagca a 21<210>7<211>2489<212>DNA<213>犬埃里希体<220>
<222>-340..2149<223>编码120kDa免疫反应性蛋白的基因的核苷酸序列<400>7aaacaatcta ccgggcatac ttcaacacaa tcagtatatt tgcatcttat 50gcacttatcg gtaacgaagt gtgtcattac agagttatta ataataaagt 100aaccattttt attgtaatgt tttttcttgc caagttcaat taatttattg 150tttacataag gtataaatgc ggattatggt taaattatgc atgtcgtaag 200tataaaataa gttgataagt gttttgttat atcctaatag atataggagg 250cattggttct atataaatgt tattttatga taaataatta atttttaaca 300ggatgaattt gtgcaatgta tttaaattaa gaggattttt atggatattg 350ataacaataa tgtgactaca tcaagtacgc aagataaaag tgggaattta 400atggaagtga ttatgcgtat attaaatttt ggtaataatt cagatgagaa 450agtaagcaat gaagacacta aagttcttgt agagagttta caacctgctg 500tgaatgacaa tgtaggaaat ccatcaagtg aagttggtaa agaagaaaat 550gctcctgaag ttaaagcgga agatttgcaa cctgctgtag atggtagtgt 600agaacattca tcaagtgaag ttgggaaaaa agtatctgaa actagtaaag 650aggaaagtac tcctgaagtt aaagcagaag atttgcaacc tgctgtagat 700ggtagtatag aacattcatc aagtgaagtt ggagaaaaag tatctaaaac 750tagtaaagag gaaagtactc ctgaagttaa agcagaagat ttgcaacctg 800ctgtagatga tagtgtggaa cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta 850tctgaaacta gtaaagagga aaatactcct gaagttaaag cagaagattt 900gcaacctgct gtagatggta gtatagaaca ttcatcaagt gaagttggag 950aaaaagtatc taaaactagt aaagaagaaa gtactcctga agttaaagca 1000gaagatttgc aacctgctgt agatgatagt gtggaacatt catcaagtga 1050agttggagaa aaagtatctg aaactagtaa agaagaaaat actcctgaag 1100ttaaagcgga agatttgcaa cctgctgtag atggtagtgt agaacattca 1150tcaagtgaag ttgggaaaaa agtatctgaa actagtaaag aggaaagtac 1200tcctgaagtt aaagcagaag atttgcaacc tgctgtagat gatagtgtgg 1250aacattcatc aagtgaagtt ggagaaaaag tatctgaaac tagtaaagag 1300gaaaatactc ctgaagttag agcagaagat ttgcaacctg ctgtagatgg 1350tagtgtagaa cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta tctgaaacta 1400gtaaagagga aagtactcct gaagttaaag cagaagattt gcaacctgct 1450gtagatagta gtatagaaca ttcatcaagt gaagttggga aaaaagtatc 1500tgaaactagt aaagaggaaa gtactcctga agttaaagca gaagatttgc 1550aacctgctgt agatggtagt gtagaacatt catcaagtga agttggagaa 1600aaagtatctg aaactagtaa agaggaaaat actcctgaag ttaaagcaga 1650agatttgcaa cctgctgtag atggtagtgt agaacattca tcaagtgaag 1700ttggagaaaa agtatctgaa actagtaaag aggaaaatac tcctgaagtt 1750aaagcggaag atttgcaacc tgctgtagat ggtagtgtag aacattcatc 1800aagtgaagtt ggagaaaaag tatctgaaac tagtaaggaa gaaagtactc 1850ctgaagttaa agcggaagat ttgcaacctg ctgtagatgg tagtgtggaa 1900cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta tctgagacta gtaaagaaga 1950aagtactcct gaagttaaag cggaagattt gcaacctgct gtagatggta 2000gtgtggaaca ttcatcaagt gaagttggag aaaaagtatc tgagactagt 2050aaagaggaaa gtactcctga agttaaagcg gaagtacagc ctgttgcaga 2100tggtaatcct gttcctttaa atcctatgcc ttcaattgat aatattgata 2150ctaatataat attccattac cataaagact gtaaaaaagg ttcagctgta 2200ggaacagatg aaatgtgttg tcctgtatca gaattaatgg ctggggaaca 2250tgttcatatg tatggaattt atgtctatag agttcaatca gtaaaggatt 2300taagtggtgt atttaatata gatcattcta catgtgattg taatttagat 2350gtttattttg taggatacaa ttcttttact aacaaagaaa cagttgattt 2400aatataatat tgtagtacgt aagctttata aaattgtata ttgaatagca 2450agtaatgcta atgcagtatt gcttgctatt tttttgttt 2489<210>8<211>688<212>PRT<213>犬埃里希体<220><223>120kDa免疫反应性蛋白的氨基酸序列<400>8Met Asp Ile Asp Asn Asn Asn Val Thr Thr Ser Ser Thr Gln Asp5 10 15Lys Ser Gly Asn Leu Met Glu Val Ile Met Arg Ile Leu Asn Phe20 25 30Gly Asn Asn Ser Asp Glu Lys Val Ser Asn Glu Asp Thr Lys Val35 40 45Leu Val Glu Ser Leu Gln Pro Ala Val Asn Asp Asn Val Gly Asn50 55 60Pro Ser Ser Glu Val Gly Lys Glu Glu Asn Ala Pro Glu Val Lys65 70 75Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser80 85 90Ser Ser Glu Val Gly Lys Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu95 100 105Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp110 115 120Gly Ser Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser125 130 135Lys Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp140 145 150Leu Gln Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu155 160 165Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro170 175 180Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Ile185 190 195Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser200 205 210Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro215 220 225Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu230 235 240Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys245 250 255Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser260 265 270Ser Ser Glu Val Gly Lys Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu275 280 285Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp290 295 300Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser305 310 315Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Arg Ala Glu Asp320 325 330Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu335 340 345Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro350 355 360Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Ser Ser Ile365 370 375Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Lys Lys Val Ser Glu Thr Ser380 385 390Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro395 400 405Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu410 415 420Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys425 430 435Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser440 445 450Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu455 460 465Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln pro Ala Val Asp470 475 480Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser485 490 495Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp500 505 510Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu515 520 525Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro530 535 540Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val545 550 555Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser560 565 570Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Val Gln Pro Val575 580 585Ala Asp Gly Asn Pro Val Pro Leu Asn Pro Met Pro Ser Ile Asp590 595 600Asn Ile Asp Thr Asn Ile Ile Phe His Tyr His Lys Asp Cys Lys605 610 615Lys Gly Ser Ala Val Gly Thr Asp Glu Met Cys Cys Pro Val Ser620 625 630
Glu Leu Met Ala Gly Glu His Val His Met Tyr Gly Ile Tyr Val635 640 645Tyr Arg Val Gln Ser Val Lys Asp Leu Ser Gly Val Phe Asn Ile650 655 660Asp His Ser Thr Cys Asp Cys Asn Leu Asp Val Tyr Phe Val Gly665 670 675Tyr Asn Ser Phe Thr Asn Lys Glu Thr Val Asp Leu Ile680 685<210>9<211>406<212>PRT<213>恰菲埃里希体<220>
<223>用于确定与犬埃里希体120kDa蛋白的同源性的120kDa蛋白的氨基酸序列<300>
<301>Walker，David H.
Yu，Xue-jie<302>恰菲埃里希体的免疫优势120kDa表面暴露的粘着蛋白<310>US 08/656,034<311>1996-05-31<400>9Met Asp Ile Asp Asn Ser Asn Ile Ser Thr Ala Asp Ile Arg Ser5 10 15Asn Thr Asp Gly Leu Ile Asp Ile Ile Met Arg Ile Leu Gly Phe20 25 30Gly Asn Lys Asn Ile Val Gln Pro Gln Asp Leu Gly Ser Glu Ile35 40 45Tyr Gln Gln Glu Gln Glu Asp Asp Thr Val Ser Gln Pro Ser Leu50 55 60Glu Pro Phe Val Ala Glu Ser Glu Val Ser Lys Val Glu Gln Glu65 70 75Lys Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala80 85 90Ser His Glu Ser Gly Val Ser Asp Gln Pro Ala Gln Val Val Thr95 100 105Glu Arg Glu Asn Glu Ile Glu Ser His Gln Gly Glu Thr Glu Lys110 115 120Glu Ser Gly Ile Thr Glu Ser His Gln Lys Glu Asp Glu Ile Val125 130 135Ser Gln Ser Ser Ser Glu Pro Phe Val Ala Glu Ser Glu Val Ser140 145 150Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp155 160 165Leu Gln Asp Val Ala Ser His Glu Ser Gly Val Ser Asp Gln Pro170 175 180Ala Gln Val Val Thr Glu Arg Glu Ser Glu Ile Glu Ser His Gln185 190 195Gly Glu Thr Glu Lys Glu Ser Gly Ile Thr Glu Ser His Gln Lys200 205 210Glu Asp Glu Ile Val Ser Gln Ser Ser Ser Glu Pro Phe Val Ala215 220 225Glu Ser Glu Val Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu230 235 240Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala Ser His Glu Ser Gly245 250 255Val Ser Asp Gln Pro Ala Gln Val Val Thr Glu Arg Glu Ser Glu260 265 270Ile Glu Ser His Gln Gly Glu Thr Glu Lys Glu Ser Gly Ile Thr275 280 285Glu Ser His Gln Lys Glu Asp Glu Ile Val Ser Gln Pro Ser Ser290 295 300Glu Pro Phe Val Ala Glu Ser Glu Val Ser Lys Val Glu Gln Glu305 310 315Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln Asp Val Ala320 325 330Ser His Glu Ser Gly Val Ser Asp Gln Pro Ala Gln Val Val Thr335 340 345Glu Arg Glu Ser Glu Ile Glu Ser His Gln Gly Glu Thr Glu Lys350 355 360Glu Ser Gly Ile Thr Glu Ser His Gln Lys Glu Asp Glu Ile Val365 370 375Ser Gln Pro Ser Ser Glu Pro Phe Val Ala Glu Ser Glu Val Ser380 385 390
Lys Val Glu Gln Glu Lys Thr Asn Pro Glu Ile Leu Val Glu Asp395 400 405<210>10<211>367<212>PRT<213>犬埃里希体<220>
<223>用于确定恰菲埃里希体120kDa蛋白同源性的120kDa蛋白的氨基酸序列<400>10Met Asp Ile Asp Asn Asn Asn Val Thr Thr Ser Ser Thr Gln Asp5 10 15Lys Ser Gly Asn Leu Met Glu Val Ile Met Arg Ile Leu Asn Phe20 25 30Gly Asn Asn Ser Asp Glu Lys Val Ser Asn Glu Asp Thr Lys Val35 40 45Leu Val Glu Ser Leu Gln Pro Ala Val Asn Asp Asn Val Gly Asn50 55 60Pro Ser Ser Glu Val Gly Lys Glu Glu Asn Ala Pro Glu Val Lys65 70 75Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser80 85 90Ser Ser Glu Val Gly Lys Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu95 100 105Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp110 115 120Gly Ser Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser125 130 135Lys Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp140 145 150Leu Gln Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu155 160 165Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro170 175 180Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Ile185 190 195Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser200 205 210Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro215 220 225Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu230 235 240Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys245 250 255Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser260 265 270Ser Ser Glu Val Gly Lys Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu275 280 285Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp290 295 300Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser305 310 315Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Arg Ala Glu Asp320 325 330Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu335 340 345Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro350 355 360Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu365<210>11<211>30<212>PRT<213>恰菲埃里希体<220><222>218..247<223>120kDa蛋白重复单元内的表面暴露的氨基酸序列<400>11Ser Ser Ser Glu Pro Phe Val Ala Glu Ser Glu Val Ser Lys Val5 10 15Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp Leu Gln20 25 30<210>12<211>27<212>PRT<213>犬埃里希体<220><222>198..224<223>120kDa蛋白重复单元内的表面暴露的氨基酸序列<400>12
Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser Lys Glu5 10 15Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln20 25<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<223>用于扩增犬埃里希体120kDa蛋白编码区核苷酸175-1793的正向引物<400>13ggaaatccat caagtgaagt t 21<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物结合<223>用于扩增犬埃里希体120kDa蛋白编码区核苷酸175-1793的反向引物<400>14ttgaaggcat aggatttaaa gg 22<210>15<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>38..59<223>与具有Spe I限制性酶产生的5’末端非重复序列的重复的DNA片段杂交的寡核苷酸<400>15cgcaagataa agtgggaatt t 2权利要求
1.一种编码犬埃里希体的120kDa蛋白质的分离的核酸节段，其特征在于，所述蛋白质对抗犬埃里希体血清具有免疫反应性，所述蛋白质具有SEQ ID NO8的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的核酸节段，其特征在于，所述节段具有SEQ ID NO7的序列。
3.一种载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的核酸节段。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体是一种表达载体，当所述载体被引入细胞时，能表达SEQ ID NO7编码的多肽。
5.一种重组蛋白质，其特征在于，该蛋白质含有SEQ ID NO8的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的重组蛋白质，其特征在于，所述氨基酸序列由含有SEQID NO7序列的核酸节段编码。
7.如权利要求6所述的重组蛋白质，其特征在于，所述核酸节段包含在表达载体中。
8.如权利要求5所述的重组蛋白质，其特征在于，该蛋白质含有14个串联重复单元，每个单元具有36个氨基酸。
9.如权利要求8所述的重组蛋白质，其特征在于，所述重复单元是亲水的。
10.如权利要求5所述的重组蛋白质，其特征在于，该蛋白质是抗原。
11.一种宿主细胞，其特征在于，该细胞含有权利要求1所述的核酸节段。
12.一种抗体，其特征在于，该抗体具有和SEQ ID NO8的氨基酸序列的免疫反应性。
13.一种抑制个体中犬埃里希体感染的方法，其特征在于，该方法包括步骤鉴定怀疑接触或感染了犬埃里希体的个体；和施用能抑制犬埃里希体的有效量的，含有犬埃里希体120kDa抗原的组合物，以抑制犬埃里希体感染。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述120kDa抗原是含有SEQ IDNO8氨基酸序列的重组蛋白质。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白质是由含有SEQ IDNO7序列的基因编码的。
16.如权利要求10所述的重组蛋白质，其特征在于，该蛋白质分散于药物学上可接受的载体中。
全文摘要
本发明提供了用恰菲埃里希体120kDa基因两侧的DNA序列的引物,经PCR扩增的犬埃里希体的120kDa蛋白质基因。该重组犬埃里希体120kDa蛋白含有14个各36个氨基酸的串联重复单元。这些重复单元是亲水性的,而且预测是暴露于表面的。还公开了该重组犬埃里希体120kDa蛋白是抗原性的,能与犬埃里希病恢复期犬血清反应。
文档编号A61P31/00GK1321190SQ99811663
公开日2001年11月7日 申请日期1999年8月27日 优先权日1998年8月27日
发明者D·H·沃克, 于学杰 申请人:研究发展基金会