狂犬病毒抗原的制备方法

专利名称：：狂犬病毒抗原的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备抗原的方法，尤其涉及一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达狂犬病毒抗原基因或联合抗原基因的方法，用于制备注射和口服用狂犬病疫苗，属于基因工程领域。
背景技术：
：狂犬病是由狂犬病病毒(RabiesVirus,RV)侵犯中枢神经系统引起的人兽共患致死性脑脊髓炎，一旦发病，死亡率几乎为100%。到目前为止无特效治疗药物，有效的办法只有注射疫苗进行预防，因此对狗、猫和野生动物的大面积的预防免疫是控制和消灭狂犬病的根本措施。目前我国兽用的狂犬病疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。尽管传统疫苗在狂犬病预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险因素很难避免。因此，传统疫苗亟需加以改进，研制安全、高效的狂犬病分子疫苗仍显得非常必要。随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达狂犬病基因，可望达到大幅度提高狂犬病抗原产量、降低生产成本的目的(ZHENFANGFu,Immunology,vol.88,pp.2001-2005,March1991，)。杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的a-干扰素以来(Smith,Mol.CellBiol.,3:2156-2165,1983)，己有数百个外源基因得到了高效表达，仅我国就有口蹄疫空衣壳粒子(李志勇等，Plosone，e2273，2008)，a-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22:355-361,1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21:223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23:104-108，1997)等多种。利用此系统来生产狂犬病抗原的优点在于1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达10毫克级/虫的水平。因而可大大降低狂犬病抗原的生产成本并使通过基因工程方法大规模生产狂犬病抗原成为可能；2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为所表达的狂犬病抗原具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性提供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的同时表达多种狂犬病抗原的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种制备狂犬病抗原的方法，包括将狂犬病毒的抗原基因或抗原基因的联合表达组合分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；将构建得到转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染以发生同源重组或转座，将狂犬病病毒的抗原基因或抗原基因的联合表达组合分别转移到杆状病毒的基因组上获得重组杆状病毒；用重组杆状病毒感染昆虫宿主和细胞；培养被感染的昆虫宿主表达相应的狂犬病抗原；收获并纯化所表达的抗原，即得。其中，所述的狂犬病毒的抗原基因优选为狂犬病病毒抗原蛋白G基因(其核苷酸序列为SEQIDNO:l所示)或狂犬病病毒抗原蛋白N基因(其核苷酸序列为SEQIDNO:3所示)；所述狂犬病毒的抗原基因的联合表达组合为狂犬病病毒抗原蛋白G基因和狂犬病病毒抗原蛋白抗原蛋白N基因的联合表达组合(即G-IRES-N组合基因)，其核苷酸序列为SEQIDNO:5所示；所述的杆状病毒运载载体的表达盒优选由多角体蛋白启动子、plO启动子或ie-l启动子与增强子所组合成的表达盒，例如，该杆状病毒运载载体可选自pBM034,pBM93,AcRP23-/acZ，AcRP6-SC,AcUWl./acZ，BacPAK6，BactoPac,Bacmid,BlucBacII(pETL),p2Bac,p2Blue,p89B310，pAc360，pAc373,pAcAB3，pAcAB4，PAcAS3，pAcC129，pAcC4，DZI，pAcGP67,pAc正l，pAcJPl,pAcMLF2，pAcMLF7，pAcMLF8，pAcMPl，pAcMP2，pAcRP23，pAcRP25,pAcRW4，pAcsMAG，pAcUWl，pAc而21，pAcUW2A，pAcUW2B，pAcUW3，pAcUW31，pAc而41，pAcUW42，pAcUW43,pAcUW51,pAcVC2，pAcVC3，pAcYMl，pAcJcC5，pBacl，pBac2，pBlueBacIII,pBlueBacHis，pEV55，mXIV,pIEINeo，pJVETL，pJVNhel，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAKl，pPBac，pSHONEXU,pSYNXIVVI+,pSYNVI+wp,pSYNXIVVI-，pVL1391，pVL1392，pVL1393，pVL941，pVL945，pVL985，pVTBac,pBM030,pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，更优选为pVL1393状病毒运载载体。本发明中所构建的转移载体优选为pVL1393(G)、pVL1393(N)，或pVL1393(G-IRES-N)(即用IRES(内部核糖体进入位点，ChainA,StructureOfRibosome-BoundCricketParalysisVirusIresRna.)序歹帐家蚕中用一个重组病毒同时进行双基因的联合表达)。所述的杆状病毒优选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV或SpltNPV，更优选为家蚕杆状病毒亲本株Bm隱NPV國ZJ8。所述的重组杆状病毒优选为以下任意一种(1)用于表达狂犬病糖蛋白G的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(G);(其微生物保藏号是CGMCCNo.2550;保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏时间:2008年6月18日；分类命名家蚕核型多角体病毒5o附Z^JCwon'A^c/eopo/j/z^/rov/n^);(2)用于表达狂犬病核蛋白N的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(N);(3)可用于同时表达狂犬病糖蛋白G和狂犬病核蛋白N的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(G-IRES-N)。所述的昆虫宿主选自包括家蚕(Bombyxmori)、野蚕(Bombyxmandarina)、蓖麻蚕(Philosamiacynthiaricim)、樟蚕(Dictyoplocajapanica)、樗蚕(Philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(Antheraeapernyi)、日本柞蚕(Antheraeayamamai)、野天蚕(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(Spodopteralittoralis)、秋粘虫(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、行军虫(Thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、美国棉铃虫(Heliothiszea)、烟青虫(Heliothisassulta)、烟草夜蛾(Heliothisvirescens)、东方粘虫(Pseudaletiaseparata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)等；更优选为家蚕(Bombyxmori)。所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体(更优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种狂犬病抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀桨)；其中，所述的蛹体为l-2天的早期嫩蛹。本发明采用基因重组技术，将来源于狂犬病病毒的不同基因组合，包括狂犬病的糖蛋白G、核蛋白N、糖蛋白G和核蛋白N的基因联合表达组合G-IRES-N构建到各种由启动子为多角体蛋白，p10，ie-l等及与增强子组合所驱动的杆状病毒表达所用表达盒的杆状病毒表达转移运载载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUWl-lacZ，BacPAK6，BactoPac，)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAc正l，pAcJPl，pAcMLF2、7、8,pAcMPl、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUWl、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYMl，pAcJcC5，pBacl、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhel，pJVP10，pJVrsMAG,pMBac，pP10，pPAKl，pPBac，pSHONEXU，pSYNXIVVI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使狂犬病病毒不同的基因组合，包括G、N或G-IRES-N基因在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外(invivo/invitro)重组，将狂犬病病毒不同的基因组合，包括G、N或G-IRES-N整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒；重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产各种狂犬病病毒抗原。本发明中最优选的一个技术方案是将SEQIDNO:l(狂犬病毒抗原蛋白G基因)、SEQIDNO:3(狂犬病毒抗原蛋白N基因)或SEQIDNO:5(G-IRES-N)所示的DNA序列插入到运载载体pVL1393上，再通过体内重组将全长狂犬病病毒G、N或G-IRES-N基因分别转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带狂犬病不同基因组合的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)、rBmNPV(N)、rBmNPV(G-IRES-N);将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖rBmNPV(G)、rBmNPV(N)、rBmNPV(G-IRES-N);当rBmNPV(G)、rBmNPV(N)、rBmNPV(G-IRES-N)在蚕体内复制时，G、N或G-IRES-N基因在多角体蛋白基因(pom)启动子控制下表达，产生狂犬病抗原；在感染3-6天(最佳为5天，25度饲养温度)后收集含狂犬病抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，每毫升蚕血淋巴可产生10毫克以上的相应狂犬病抗原，杀灭感染性病原后，经过蛋白纯化后便得到安全、高效的狂犬病抗原，此种抗原可用于制备预防狂犬病的注射用疫苗；另将所制备的抗原用脂肪酸乳化后(优选的，将初步纯化的狂犬病毒抗原用等体积的浓度为25-35%的脂肪酸(为了达到最佳的效果，所述的脂肪酸最好由以下体积百分比的各组分组成棕榈酸7%、油酸20.5%、3%硬脂酸、余量为水)混合在一起，经超声波乳化后得到注射或口服疫苗，经口添饲动物，动物能产生相应的保护抗体，并能经受住狂犬病毒的攻击，此种抗原可用于制备预防狂犬病口服用疫苗。本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产狂犬病抗原，其生产成本显著低于传统的制备狂犬病抗原方法(例如通过细胞繁殖病毒制备狂犬病抗原)，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于家蚕己经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。总体而言，本发明方法可以大幅度降低狂犬病抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。具体实施例方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。试验材料1.大肠杆菌株E.coliTG1和DHsa购自Promega公司；运载载体pVL1393购自于Invitrogen公司、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8由中国农业科学院生物技术研究所保存；狂犬病病毒由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病研究室保存；抗原检测试剂盒购自武汉生物制品研究所基因工程室，高表达家蚕品种JY1由中国农业科学院生物技术研究所保存。2.酶与试剂限制性内切酶、PNK酶、连接酶为Promega公司产品。3.生化试剂IPTG、X-Gal为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T4DNA连接酶、RNA酶、ProteinaseK、胎牛血清及其他试剂购于Invitrogen公司，细胞培养基TC-100购于Sigma公司。4.培养基大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0);家蚕细胞培养基为TC-IOO。5.狂犬病病毒基因不同组合表达产物的动物实验在中国农业科学院兰州兽医研究所动物隔离实验室进行。实施例1狂犬病抗原G蛋白的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验1、狂犬病病毒抗原蛋白G基因的克隆和序列分析1.1目的基因的获得设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出狂犬病病毒抗原蛋白G基因(SEQIDNO:l)。所设计的抗原蛋白G基因的扩增引物为pVL-G上游5'AG04rCCAACATGGTTCCTCAGGTTCTT3'BamHIpVL-G下游5'AGA4rrCTCACAGTCTGATCTCACC3'EcoRI取狂犬病病毒CVS毒株90h致死的小鼠一只，无菌解剖取脑组织，按常规方法研磨。研磨后，用细胞培养液(MEM)制成1:5的悬液，并加适量的抗菌素，在室温下浸毒6h或4'C过夜，然后反复冻融几次，使细胞裂解。7500r/min离心5min，取上清液用于总RNA的提取。从狂犬病病毒感染致死的小白鼠脑组织中提取总RNA。将提取的总RNA用PVL-G上游引物在AMV反转录酶的作用下，42'C反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下表lPCR反应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反应过程94。C变性10min;94°C1min，59°C1min，72°C2min，共30个循环。最后延伸反应10min。1.2.PCR产物的纯化将PCR扩增的G基因产物进行1X琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约1.5kb的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w)体积的6MNal，37°C将凝胶溶解后，加入10玻璃奶(Glassmilk)，混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用NewWash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入30pl0.1XTEBuffer溶解DNA，离心后去沉淀，取上清作进一步分析。1.3.酶切与连接反应酶切反应纯化后的G片段用^awffl和五coRI双酶切分析，反应总体积为50nl，其中纯化的PCR产物10)al，10X酶相应缓冲液5)d，两种酶各为lpl，无菌水补足体积。37'C反应2小时以上。将转移质粒pGEM-3Z作同样酶切反应。反应结束后于65'C灭活10min。连接反应连接总体积15fil，PCR产物8Ml，载体15XT4DNA连接缓冲液3T4DNA连接酶1^，无菌水补足体积，1214'C连接过夜。1.4.大肠杆菌的遗传转化用75mMCaCl2制备大肠杆菌TG1感受态细胞。取步骤3中制备的连接混合物5pl，加到200pl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42。C热激2分钟，迅速置于冰上l2min，加入已温育至37'C的LB培养基500pl，37'C培养1小时，取100200pl涂布于含100tig/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37。C倒置培养过夜。1.5.质粒DNA的制备(1)从转化的LB平板上挑取单个菌落，接种于3ml含100pg/mlAmp的LB培养基中，37'C培养过夜。(2)取1.5ml菌液于小离心管中，3500rpm离心4min，去上清。(3)加入Solution1150nl，混匀后置于冰上15。C。(4)加入SolutionII300^，氯仿150pl，轻轻混匀后静置5min。(5)加入SolutionIII450|al，混匀后置于冰上15min。(6)11000g离心10min，上清移入新管。(7)加入异丙醇450^1,混匀后置于4'C15min。(8)11000g离心6min，去上清。(9)加入TER250^1，混匀后置于37。C20min。(10)加入PPtBuffer300350pl,混匀后静置15min。(11)11000g离心6min，去上清。(12)加入75%乙醇400nl。(13)11000g离心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1XTEBuffer40lal溶解，于-20。C保存。1.6.重组子的鉴定用BamHI/五coRI双酶切步骤5中制备的质粒DNA，电泳后出现约1.5kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒pGEM-3Z(G)。将重组质粒pGEM-3Z(G)进行双向测序。G基因序列及所推导的氨基酸序列分别见SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。2、转移载体pVL1393(G)的构建将1.6中所制备的质粒pGEM-3Z(G)用万awHI和五coRI双酶切，用1.2中的方法纯化G基因片段，与经5"wHI和五caRI双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(G)。3、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制备按GIBCO公司产品说明配制1XTC-100培养基，用2NNaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10%胎牛血清，27'C下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，34天后收集病毒感染液，离心(5000rpmX10min)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris12.1g，EDTA33.6g,KC114.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50pg/ml，50'C保温2小时，再加入35X的Sarkorsel至终浓度为1%,继续于5(TC保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚氯仿(1:1)氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3MNaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，一20'C放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10min，沉淀用75%乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100TEBuffer中，放4t:保存备用。4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)的构建和获得4.1重组杆状病毒rBmNPV(G)的构建接种大约lXl(^细胞于15cmn音养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1叫家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2吗重组转移质粒pVL1393(G)DNA禾B5pl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60pl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27。C培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300^FBS。27。C恒温培养45天，收集上清液用于重组病毒的筛选。4.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)的筛选和纯化接种适量细胞(约7080%)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取lml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27'C感染1小时后，吸去感染液，将2%低融点琼脂糖凝胶于60'C水浴中融化，冷至40'C与40'C预热的2XTC—100培养基(含20XFBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27'C倒置培养35天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过23轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)。4.3重组病毒rBmNPV(G)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(G)。4.4重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150nl，加入150W(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20pl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20jil的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为-5'-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3，5，-AG^47TCTCACAGTCTGATCTCACC-3'取上述病毒基因组DNA1^1进行PCR扩增，反应条件为94°C变性5min、94。Clmin、58°Clmin、72°Clmin，30个循环，最后72°C延伸5min。取15^1反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。5、G基因在家蚕蛹和蚕体中高效表达本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0X10SrBmNPV(G)，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-201:冻存以进行双抗体夹心￡1^18八法检测。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的10倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。6、狂犬病毒G抗原的收集由于狂犬病毒G蛋白是一种膜蛋白，纯化困难。因此分别将上述5中所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片，然后经辐照获得无菌抗原，进一步用层析法等方法纯化G抗原。7、动物免疫实验及病毒攻击保护实验将收集纯化的无菌抗原与等体积油佐剂混合试制疫苗，在小白鼠进行上进行动物试验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫10只小白鼠，另设5只小白鼠不注射任何东西为对照组。一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得卯％的保护，而对照组全部发病。将初步纯化的狂犬病毒G抗原用等体积的浓度为30.5c/。脂肪酸(该脂肪酸由以下体积百分比的各组分组成棕榈酸7%、油酸20.5%、3%硬脂酸、余量为水)混合，经超声波乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果口服试验组获得80%的保护，而对照组全部发病。本实施例所制备的抗原无论注射还是口服，动物100%都产生保护性抗体。实施例2狂犬病抗原N蛋白的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验1、狂犬病病毒N基因的克隆和序列分析设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出狂犬病病毒N基因(SEQIDNO:3)。所设计的扩增N基因的引物为pVL-N上游5'AimSiAACATGGATGCCGACAAGATT3'勘JpVL-N下游5'AGCGGCCGCTTATGAGTCATTCGAATACGT3'脂/从狂犬病病毒感染致死的小白鼠脑组织中提取总RNA。将提取的总RNA用PVL-N上游引物在AMV反转录酶的作用下，42'C反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下表2PCR反应条件加入物体积灭菌ddH2033w10XPCRBuffer5^12.5mMdNTP4nl25MmMgCl23pi5'引物1pi3'引物1pi模板DNA2^1Taq酶1(ilTotal50piPCR反应过程94。C变性10min;94°C1min，56°C1min，72°C2min，共30个循环。最后延伸反应10min。2、转移载体pVL1393(N)的构建将1中扩增得到的N按实施例1中1.2的方法纯化，用Ja"I和双酶切后，与经和iVM双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(N)。将重组质粒pVL1393(N)进行双向测序。N基因序列及所推导的氨基酸序列分别见SEQIDN0:3和SEQIDNO:4。3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)的构建和获得3.1、重组杆状病毒rBmNPV(N)的构建接种大约lX10S细胞于15cn^培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，力n1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1吗家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2吗重组转移质粒pVL1393(N)DNA和5pl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60^，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27'C培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300plFBS。27。C恒温培养45天，收集上清液用于重组病毒的筛选。3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)的筛选和纯化接种适量细胞(约7080%)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取lml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27'C感染1小时后，吸去感染液，将2%低融点琼脂糖凝胶于60'C水浴中融化，冷至40'C与40卩预热的2XTC—IOO培养基(含20XFBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27'C倒置培养35天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过23轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)。3.3重组病毒rBmNPV(N)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(N)。3.4重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150pl，加入150pl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入2(Hil(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用2(^1的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为5'-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3'5'AGCGGCCGCTTATGAGTCATTCGAATACGT3'取上述病毒基因组DNAlnl进行PCR扩增，反应条件为94。C变性5min、94°Clmin、55°Clmin、72°Clmin，30个循环，最后72。C延伸5min。取15^1反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。4、N基因在家蚕蚕体和蛹体中表达本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹或家蚕接种约1.0X10、BmNPV(N)，4-5天后收集发病蚕蛹和蚕血，-20^冻存以进行双抗体夹心￡118八法检测。从OD值测定实验结果来看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。5、抗原纯化称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH8.0)洗至基线稳定。分别将4所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脱液，收集至第一峰下降，得纯化抗原。6、动物免疫实验及病毒攻击保护实验将收集的纯化抗原与等体积油佐剂混合试制疫苗，在小白鼠进行上进行动物试验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫10只小白鼠，另设5只小白鼠不注射任何东西为对照组。一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得70%的保护，而对照组全部发病。将初步纯化的狂犬病毒N抗原用等体积的浓度为25y。的脂肪酸(该脂肪酸由以下体积百分比的各组分组成棕榈酸5%、油酸18%、2%硬脂酸、余量为水)混合，经超声波乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果口服试验组获得50%的保护，而对照组全部发病。本实施例所制备的抗原无论注射还是口服的动物80-90%都产生保护性抗体。实施例3狂犬病毒G和N抗原的联合表达、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验1、狂犬病毒G-IRES-N组和基因的克隆和序列分析设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出狂犬病病毒G基因，N基因。所设计的扩增G、N基因的扩增引物同前。在G基因和N基因之间连接的一段IRES序列，参照立克次体病毒CricketParalysisVirus的IRES(内部核糖体进入位点，ChainA，StructureOfRibosome-BoundCricketParalysisVirusIresRna.参见序列SEQIDN06)序列由本实验室自行人工合成，在其5'端和3'端分别添加XbaI和BglII酶切位点。从狂犬病病毒感染致死的小白鼠脑组织中提取总RNA。将提取的总RNA分别用pVL-G和pVL-N的上游引物在AMV反转录酶的作用下，42'C反转录制备cDNA。以获得的扩增G基因和N基因的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增条件同前。2、转移载体pVL1393(G-IRES-N)的构建按实施例1中1.2的方法纯化所获得G基因、实施例2中2.1的方法纯化1所获得N基因和合成IRES片段，经酶切后，与杆状病毒转移载体pVL1393连接，然后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载pVL1393(G-IRES-N)。将重组质粒pVL1393(G-IRES-N)进行双向测序。G-IRES-N基因序列见SEQIDNO:5。3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)的构建和获得3.1重组杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)的构建接种大约1乂106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1吗家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2吗重组转移质粒pVL1393(G-IRES-N)DNA和5pl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60pl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27。C培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300plFBS。27°C恒温培养45天，收集上清液用于重组病毒的筛选。3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)的筛选和纯化接种适量细胞(约7080Q/0于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取lml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27。C感染l小时后，吸去感染液，将2%低融点琼脂糖凝胶于60°(3水浴中融化，冷至40CC与40。C预热的2XTC—100培养基(含20XFBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培养35天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过23轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)。3.3重组病毒rBmNPV(G-IRES-N)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(G-IRES-N)。3.4重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150nl，加入150^1(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20^1(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用2(^1的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为5'-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3'5'AGCGGCCGCTTATGAGTCATTCGAATACGT3'取上述病毒基因组DNAlpl进行PCR扩增，反应条件为94。C变性'5min、94。Clmin、55°Clmin、72°Clmin，30个循环，最后72°C延伸5min。取15^1反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。4、G-IRES-N基因在家蚕蛹体中表达本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕接种约1.0Xl()SrBmNPV(G-IRES-N)，4-5天后收集发病蚕蛹，-20〔冻存以进行双抗体夹心￡1^13八法检测。从OD值测定实验结果来看，其表达的G抗原和N抗原均达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的15倍和50倍以上，而对照Bm-NPV—ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。5、抗原收集由于狂犬病毒G蛋白是一种膜蛋白，纯化困难。因此分别将上述4中所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去细胞碎片，然后经辐照获得无菌抗原。联合表达的G和N蛋白的纯化分别参见上述的G和N蛋白的纯化部分。6、动物免疫实验及病毒攻击保护实验将收集和初步纯化的无菌抗原与等体积油性完全佐剂混合试制疫苗，在小白鼠上进行动物试验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫10只小白鼠，另设5只小白鼠不注射任何东西为对照组。一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得100%的保护，而对照组全部发病。将初步纯化的狂犬病毒G和N抗原用等体积的浓度为30.5%的脂肪酸(该脂肪酸由以下体积百分比的各组分组成棕榈酸7%、油酸20.5%、3%硬脂酸、余量为水)混合，经超声波乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，一个月后，用致死性狂犬病毒cvs标准攻毒株经脑内攻击，结果口服试验组获得100%的保护，而对照组全部发病。可见，本实施例所制备的抗原无论注射还是口服的动物100%都产生高滴度的保护性抗体。序列表<110>中国农业科学院兰州兽医研究所中国农业科学院生物技术研究所<120>狂犬病毒抗原的制备方法<130>KLPI0786<160〉7<170>Patentlnversion3.5<210〉1<211>1575<212〉DNA<213〉RabiesVirus<400>1atggttcctcaggttcttttgtttgtactccttctgggttmcgttgtgtttcgggaag60ttccccatttacacgataccagacgaacttggtccctggagccctattgacatacaccat120ctcagctgtccaaataacctggttgtggaggatgaaggatgtaccaacctgtccgagttc180tcctacatggaactcaaagtgggatacatctcagccatcaaagtgaacgggttcacttgc240acaggtgttgtgacagaggcagagacctacaccaactttgttggttatgtcac犯ccaca300ttc肪gag犯agcatttccgccccaccccagacgcatgtagagccgcgtat犯ctgg肪g360atggccggtgacccceigatatgaagagtccctacacaatccataccccgactaccactgg420cttcgaactgtaagaaccaccaaagagtccctcattatcatatcccc肪gtgtgacagat480ttggacccatatgacaaatcccttcactcaagggtcttccctggcgg咖gtgctcaggs540ataacggtgtcctctacctactgctcaactaaccatgattacaccatttggatgcccgag600aatccgagaccaaggacaccttgtgacatttttaccaatagc柳ggg犯gagagcatcc660幼cgggaacaagacttgcggctctgtggatg幼卿ggcctgtataagtctctaaaagga720gcatgc鄉ctcaagttatgtggagttcttggacttagacUatggatggaacatgggtc780gcgatgcaaacatcagatgagaccaaatggtgccctccagatcagttggtgaatttgcac840gactttcgctc柳cgagattgagcatctcgttgtggaggagttagtcaagaaaagagag900gaatgtctggatgcattagagtccatcatgaccaccaagtcagtaagtttcagacgtctc960agtcacctgagaaaacttgtcccagggtttggaaaagcatataccatatt腦ttgatggaggctgatgctcactacaagtcagtccggacctggaatgagatcatcccctca1080aaagggtgtttgaaagttggaggaaggtgccatcctcatgtgaacggggtgtttttcaat1140ggtataatattagggcctgacgaccatgtcctaatcccagagatgcaatcatccctcctc1200csgcaacatatggagttgttggaatcttcagttatccccctgatgcaccccctggc卿c1260ccttctacagttUc祖aga￡iggtgatg￡Lggctg柳attttgttgaagttcacctcccc腦gatgtgtacaaaceLgeitctcaggggttgacctgggt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