用于生产膜抗原的一般化模块的突变体细菌的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请要求PCT申请PCT/EP2013/058459 (于2013年4月24日提交）的权益，它们 二者的整个内容为所有目的在此通过引用并入本文。
技术领域
[0002] 本发明属于得自革兰氏阴性细菌的小泡的领域，所述小泡具体地用在免疫原性组 合物(例如疫苗冲使用。
【背景技术】
[0003] 由于细胞被膜的膨胀(turgour)压力，革兰氏阴性细菌可以在生长过程中从它们 的外膜自发地释放小泡。这样的小泡的形成可以通过某些细菌组分的破坏而促进，例如参 考文献1和2破坏大肠杆菌(E.coli)T 〇l-Pal系统以提供在生长过程中向培养基中释放小 泡的菌株。小泡还可以通过完整细菌的破坏而产生。已知的小泡生产方法包括使用去污剂 处理(例如用脱氧胆酸盐）的方法[3和4]、无去污剂方法[5]或超声处理[6]等。
[0004] 这些小泡(其通常可以被称作疱(bleb)和外膜小泡(OMV))富含在免疫原性的细 胞表面结合的抗原、周质抗原和分泌抗原中，且已经被用作疫苗，例如针对脑膜炎奈瑟氏球 菌(Neisseria meningitidis)血清群B [7]。它们特别适合用于该用途，因为所述小泡含 有充当佐剂的化合物，从而引起针对抗原的强免疫应答。这样，与纯化的抗原蛋白或其它细 菌组分相比，所述小泡对于免疫系统而言是天然细菌的更接近的模仿物。但是，由于所述小 泡衍生自细菌，它们通常需要处理以除去反应原性细菌组分如内毒素。这可以通过去污剂 处理等实现[8]。
[0005] 本发明的一个目的是，提供另外的和改善的组分，其用于制备这些小泡，且尤其是 可以用作疫苗的小泡。本发明的一个具体目的是，提供适合用于生产所述小泡的革兰氏阴 性细菌。例如，所述细菌可以适合提供高小泡收率、具有改变的蛋白含量和/或组合物的小 泡、以及具有改善的交叉保护效力的小泡。
[0006] 具体地，关于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)，仍然需要提供保护免于广 谱流感嗜血杆菌菌株的疫苗。流感嗜血杆菌是一种易变的微生物，其具有提高的适合新小 生境(niche)和造成广谱疾病的能力。适合性、毒力和定居因子可以变化，以便允许所述微 生物适合不同的组织和宿主。因此，潜在抗原易受高选择压力，且所以可能在不同菌株之间 具有序列变异性。
[0007] 本发明公开内容 革兰氏阴性细菌与外部介质由两个连续的膜结构层隔开。这些结构(被称作细胞质膜 和外膜（OM))，其在结构上和在功能上存在差异。外膜在病原性细菌与它们各自的宿主的 相互作用中起重要作用。结果，表面暴露的细菌分子代表宿主免疫应答的重要靶标，从而使 得外膜组分在提供疫苗、诊断和治疗剂中成为有吸引力的候选物。
[0008] 本发明描述了，编码共同具有LytM催化结构域的多肽的一个或多个基因的突变 或缺失会导致细菌细胞分裂和细菌表型的剧烈变化。发明人还已经证实，所述突变或缺失 会导致小泡(被称作OMV或外膜小泡）的释放，而相同的野生型NTHi菌株通常不会释放OMV。 [0009]发明人已经制备了革兰氏阴性细菌，其中含有LytM催化结构域的蛋白的正常表 达被破坏（即所述蛋白被灭活），且已经观察到，这些细菌具有在小泡的制备中可以有利的 性能。这些性能包括增加的形成小泡和存在于得到的小泡中的蛋白的性质和/或量的变化 的趋势。已知在大肠杆菌中含有LytM结构域的分裂机制的2个组分(EnvC和NlpD)是负责 细胞分离的细胞壁水解酶(酰胺酶）（AmiA、AmiB和AmiC)的直接调节剂[9]。还已知的是，大 肠杆菌中的LytM金属蛋白酶是子代细胞分离所绝对需要的。
[0010]在一个特别优选的实施方案中，描述了通过缺失NT013和/或NT022不仅会影响细 菌细胞分裂，而且还存在外膜小泡(OMV)在通常不会释放OMV的NTHI菌株中的惊人产生和释 放。
[0011 ] 具体地，已经在无法分类的(11〇1147口631316)流感嗜血杆菌(1'11'!1;〇中证实，1'11'013的 缺失会造成小泡释放的增加以及得到的小泡的蛋白含量和/或组合物的变化，例如当与没 有缺失的NHTi相比时，如在下面更详细地证实的。
[0012] NT017在NTHi中的缺失会造成得到的小泡的蛋白含量和/或组合物的变化，例如 当与没有缺失的NHTi相比时，如在下面更详细地证实的。
[0013] NT022在NTHi中的缺失会造成小泡释放的增加，以及得到的小泡的蛋白含量和/ 或组合物的变化，例如当与没有缺失的NHTi相比时，如在下面更详细地证实的。
[0014] 突变细菌的生长速率可以与野生型生长速率相当，不同于已知的TolR突变体的 生长速率。
[0015] 因此，本发明提供了其中至少一种含有LytM催化结构域的蛋白被灭活的革兰氏阴 性细菌和从所述细菌制备小泡的方法。本发明还提供了从该细菌得到的或可得到的小泡以 及包含这些小泡的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物具体地可以用作疫苗。
[0016] 因而，本发明提供了一种革兰氏阴性细菌，其中至少一种含有LytM催化结构域的 蛋白被灭活。在一个实施方案中，这样产生的细菌:其与其中含有LytM催化结构域的蛋白 有活性的相同细菌相比，在培养基中生长的过程中向培养基中释放更大量的小泡和/或具 有不同的蛋白组合物的小泡。任选地，不表达至少一种含有LytM催化结构域的蛋白。
[0017] 本发明还提供了一种革兰氏阴性细菌，其中一种或多种含有LytM催化结构域的 蛋白具有修饰，使得在培养基中生长的过程中，所述细菌与缺少所述修饰的相同细菌相比 向培养基中释放更大量的小泡和/或具有与缺少所述修饰的相同细菌不同的蛋白含量和/ 或组合物的小泡。
[0018] 具体地，本发明还提供了一种NTHi细菌，其中一种或多种本发明的抗原（例如 NT013、NT017和NT022)已经被敲除[10]。用于生产敲除的细菌的技术是已知的，并且已经报 道了从NTHi菌株敲除基因，即在参考文献11中。
[0019] 本发明还提供了一种NTHI细菌，其中一种或多种本发明的抗原（例如NT013、 NT017和NT022)具有抑制其活性的突变。编码所述抗原的基因将具有改变编码的氨基酸序 列或消除其表达的突变。突变可能涉及缺失、置换和/或插入其中任何可能涉及的一个或多 个氨基酸。
[0020] 一个实施方案提供了编码本发明的抗原（例如NT013、NT017和NT022)的一个或多 个基因的缺失。
[0021 ]在一个实施方案中，本发明提供了编码具有LytM催化结构域的多肽的NTHI基 因。一般而言，将金属蛋白酶鉴别为在它们的催化结构域中含有HxH和HxxxD氨基酸结构 域。优选地，这一个或多个基因编码NTO13、NT022或NTO17中的任一个。
[0022]优选的实施方案提供了这样的NTHI菌株：其中缺失编码NT013或NT022或NT017中 的任一个的一个或多个基因。例如，缺失的基因可以被抗生素抗性盒(诸如红霉素抗性盒） 置换。已经发现，所有上述多肽共同具有LytM催化结构域，且都是金属蛋白酶。
[0023] 还已经发现，NT013和NT022中的LytM结构域是保守的。NT013催化活性部位由在 C-端部分处的下述氨基酸基序-HKGD-和-HLH-代表。NT022催化活性部位由在C-端处的下 述氨基酸基序-NKGID-和-KLH-代表。
[0024]本发明还提供了一种制备革兰氏阴性细菌的方法，其包括以下步骤:修饰编码一 种或多种含有LytM催化结构域的蛋白的基因，使得所述修饰造成所述细菌当在培养基中 生长时向培养基中释放比起始细菌更大量的小泡和/或具有与起始细菌不同的蛋白含量 和/或组合物的小泡。所述突变步骤可以灭活(例如突变或删除)所述基因。
[0025] 对于制备包括NTHi抗原（例如本发明的抗原（例如NTO13、NTO17和NT022))且可以 用作免疫原的细菌外膜小泡而言，本发明的突变体细菌是特别有用的。
[0026]还提供了一种用于生产本发明的过度产生OMV的NTHi细菌的方法，所述方法包括 通过一个或多个下述过程遗传修饰革兰氏阴性细菌菌株：（a)工程改造所述菌株以下调一 个或多个Tol基因的表达；和（b)突变一个或多个编码包含肽聚糖相关位点的蛋白的基 因以减弱所述蛋白的肽聚糖结合活性；（c)突变或缺失一个或多个编码共同具有LytM催 化结构域的多肽的基因。在一个特别优选的实施方案中，NTHi可能不表达有活性的NT013、 NT022基因和/或Tol基因[11]、[10]中的任一个。在一个实施方案中，所述修饰是一个或 多个编码共同具有LytM催化结构域的多肽的基因的突变或缺失。
[0027]本发明还提供了从本发明的细菌分离的或可分离的小泡，例如使用本文中提及的 任何方法。这些小泡可用作疫苗的组分。
[0028]本发明还提供了一种用于制备革兰氏阴性细菌（例如NTHi小泡）的方法，所述方 法包括以下步骤:处理本发明的革兰氏阴性细菌（例如NTHi细菌），使得它的外膜形成小 泡。
[0029]本发明还提供了一种用于制备革兰氏阴性细菌（例如NTHi小泡）的方法，所述方 法包括以下步骤:在使得它的外膜自发地脱落小泡的条件下培养本发明的革兰氏阴性细菌 (例如NTHi细菌）。
[0030] 本发明还提供了一种用于制备小泡的方法，所述方法包括以下步骤:将小泡与包 含本发明的细菌的培养基分离，所述细菌已经在允许所述细菌向培养基中释放小泡的条件 下生长。通过该方法制备的小泡可以用作药物组合物(包括疫苗）的组分。
[0031] 本发明还提供了包含本发明的细菌的培养基，所述细菌已经在允许所述细菌向培 养基中释放小泡的条件下生长。可以从该培养基纯化小泡。
[0032] 本发明还提供了包含小泡的组合物，所述小泡在培养本发明的细菌的过程中释放 进培养基中。该组合物不包含任何活的和/或完整的细菌。该组合物和/或它的组分可以用 于疫苗制备。
[0033] 包含本发明的小泡的药物组合物可以用在医学中，例如用在治疗或预防感染的方 法中和用在提尚抗体应答的方法中。
[0034]本发明还提供了包含小泡的组合物，其中所述小泡存在于滤液中，所述滤液可在 穿过0.22μπι过滤器过滤已经在其中培养本发明的细菌的培养基以后得到。该组合物和/或 它的组分可以用于疫苗制备。
[0035]含有LytM结构域的蛋白 根据本发明，在革兰氏阴性细菌中修饰一种或多种含有LytM结构域的蛋白。通常，这 是灭活(例如通过突变或缺失）。这可能造成所述细菌与其中含有LytM催化结构域的蛋白 有活性的相同细菌相比在培养基中生长的过程中释放（i)更大量的小泡和/或（ii)具有 不同的蛋白含量和/或组合物的小泡。可以做出多种修饰。
[0036]溶葡萄球菌酶-型(LytM)肽酶的金属蛋白酶广泛分布，存在于细菌噬菌体中、革兰 氏阳性细菌中和革兰氏阴性细菌中。含有催化性LytM结构域的金属蛋白酶属于M23肽酶 家族[12]，该结构域首次在得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的分泌的自溶 素中鉴别[13]。
[0037] 基于与已知的含有LytM结构域的蛋白（诸如大肠杆菌的EnvC、NlpD和YebA，无荚 膜的（无法分类的）流感嗜血杆菌的NTO13、NTO17或NT022)的LytM结构域的序列同一性， 通常可以鉴别LytM结构域并由此鉴别含有LytM结构域的蛋白。
[0038] LytM结构域因而通常与本文中提及的任意LytM结构域的序列具有至少30%、 40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性。含有 LytM结构域的蛋白含有LytM结构域。下面提供了LytM结构域和含有LytM结构域的蛋白 的示例性序列。
[0039] 抗原NT013被注解为含有TPR重复的蛋白，且也被注解为细胞色素 c成熟血红 素裂合酶亚基CcmH2。它已经在菌株86-028NP中作为NTHI0532释放。NT013已经被注解为 属于金属蛋白酶蛋白家族，且它具有LytM催化结构域。
[0040] NT013抗原具有天然的42个N-端氨基酸序列（SEQ ID NO: 1的氨基酸1-42)。 SEQ ID NO:85代表不具有天然的42个N-端氨基酸序列的NT013抗原。
[0041 ] 抗原NT017已经被注解为86-026NP菌株中的存活蛋白SurA-样蛋白NTHI0915。 [0042] NT017抗原具有天然的20个N-端氨基酸序列（SEQ ID NO: 3的氨基酸1-20) JEQ ID NO:86代表不具有天然的42个N-端氨基酸序列的NT017抗原。
[0043] 抗原NT022已经被注解为得自菌株NP86-028的NTHI0830,且被鉴别为可能的外 膜抗原性脂蛋白B。它已经从Fil76菌株克隆和表达。还已经发现它含有LytM催化结构域并 且是表面暴露和分泌的。
[0044] NT022抗原具有天然的18个N-端氨基酸序列（SEQ ID NO: 5的氨基酸1-18)。 SEQ ID NO:87代表不具有天然的18个N-端氨基酸序列的NT022抗原。
[0045]在不同的革兰氏阴性细菌中发现了含有LytM结构域的蛋白的同系物，且例子在 下表中阐明：
[0046] LytM 结构域可以含有基序 HxxxD (SEQ ID NO: 13)和/或ΗχΗ，例如HKGVD (SEQ ID NO: 14)、HRGVD (SEQ ID NO: 15)、HTGID (SEQ ID NO: 16)、HLH。其它具体基序包括 NKGVD (SEQ ID NO: 17)、TKGID (SEQ ID NO: 18)、NKGID (SEQ ID NO: 19)、QLH、RLH、 KLH、WKGVF (SEQ ID NO: 20)、WRGLV (SEQ ID NO: 21)、WKGMV (SEQ ID NO: 22)、GLY、 SLY、ALY〇
[0047] NTHi抗原（即蛋白）在上面通过参考得自文献的命名惯例来定义，例如"ΝΤΗΓ编 号(得自菌株86-028NP的基因组）。在参考文献14 (特别是表1)中更详细地解释了这样的 惯例。因而，在指定菌株的公开序列数据库中可以容易地找到在本文中提及的任意抗原（即 蛋白）的示例性氨基酸和核苷酸序列（连同另外的信息，诸如功能注解），但是本发明不限 于得自86-028NP菌株的序列。几种其它NTHI菌株的基因组序列是可得到的（再次，参见参考 文献14的表1)。标准检索和比对技术可以用于在这些(或其它）另外的基因组序列中的任一 个中鉴别本文给出的任何特定序列的同系物。此外，可得到的序列可以用于设计引物，所述 引物用于从其它物种和菌株扩增同源序列。因而，本发明不限于这些特定物种和菌株或其 中存在示例序列的菌株，而是包括得自其它革兰氏阴性菌株(例如NTHI菌株)的这样的变体 和同系物，以及其中存在这样的变体和同系物以及非天然变体的物种和菌株的用途。一般 而言，特别的SEQ ID NO的合适变体包括它的等位基因变体、它的多晶型形式、它的同系物、 它的直系同源物、它的旁系同源物、它的突变体等。在本发明的实施方案中，含有LytM结构 域的蛋白是NTHi的NTO13、NT022或NTO17的同系物、直系同源物或旁系同源物。
[0048]因而，例如，与本文中的SEQ ID NO相比，与本发明一起使用（即在形成本发明的 过程中经过修饰）的多肽或蛋白可以包括一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7 个、8个、9个等)氨基酸置换，诸如保守置换（即用另一个具有有关侧链的氨基酸置换一个氨 基酸）。遗传编码的氨基酸通常分成4个家族：（1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；（2)碱性的， 即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不带电荷的极性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同地归类为芳族氨基酸。 一般而言，在这些家族内的单个氨基酸的置换对生物学活性不具有重大影响。相对于SEQ ID NO序列，所述多肽（即蛋白）还可以包括一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7 个、8个、9个等）单个氨基酸缺失。相对于SEQ ID NO序列，所述多肽还可以包括一个或多个 (例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个等)插入(例如1、2、3、4或5个氨基酸中的每 一种)。
[0049] 类似地，与本发明一起使用的多肽（即在形成本发明的过程中经过修饰)可以包含 这样的氨基酸序列，其： (a) 与在序列表中公开的序列相同（即100%同一"性）； (b) 与在序列表中公开的序列具有序列同一性（例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99 · 5%或更多）； (c) 与(a)或(b)的序列相比，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个(或 更多个)单个氨基酸改变(缺失、插入、置换），所述改变可以是在分开的位置，或者可以是连 续的;和/或 (d) 当用逐对比对算法与得自序列表的特别的序列比对时，从N-端向C-端的X个氨基 酸的每个移动窗口（使得对于延伸到P个氨基酸的比对(其中P>x)，存在p-x+1个这样的窗 口）具有至少X · y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、 100、150、200;7选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、 0.96、0.97、0.98、0.99;并且如果1. 7不是整数，则四舍五入至最接近的整数。优选的逐对 比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[15]，其中使用缺省参数(如缺口开放罚分= 10.0，缺口延伸罚分=0.5，使用EBL0SUM62评分矩阵）。用EMBOSS包中的needle工具会方便 地实施这种算法[16]。
[0050] 在组（c)内，缺失或置换可以是在N-端和/或C-端，或者可以在两个末端之间。因 此，截短是缺失的一个例子。截短可以涉及在N-端和/或C-端处缺失多达40个(或更多个)氨 基酸。N-端截短可以除去前导肽例如以促进在异源宿主中的重组表达。C-端截短可以除去 锚序列例如以促进在异源宿主中的重组表达。
[0051] 一般而言，当抗原包含与得自序列表的序列(诸如NTHI序列）不同的序列时（例如 当它包含与其具有〈100%序列同一性的序列表时，或者当它包含其片段时），在每种单独情 况下优选的是，所述抗原可以引起识别得自序列表的各个NTHI序列的抗体。
[0052]在一些实施方案中，所述含有LytM的蛋白选自NTHi的NT013和NT022或其同系物、 直系同源物或旁系同源物。
[0053] 在一些实施方案中，所述含有LytM的蛋白是NTHi的NT017或其同系物、直系同源 物或旁系同源物。
[0054] 细菌 本发明的革兰氏阴性细菌通常是无荚膜的(无法分类的）流感嗜血杆菌菌株（NTHi)。 但是，它可以是不同的革兰氏阴性细菌，包括脑膜炎奈瑟氏球菌(特别是血清群B)和百日 咳鲍特氏菌(B. pertussis)。在一些实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌不是无荚膜的 (无法分类的）流感嗜血杆菌菌株。
[0055] 用在本发明中的示例性物种包括在埃希氏菌属（Escherichia)、志贺氏菌属（ Shigella)、奈瑟氏球菌属（Neisseria)、莫拉菌属（Moraxell