动物中的免疫应答，可以保护哺乳动物免于细菌 (例如革兰氏阴性细菌诸如流感嗜血杆菌)感染。
[0143]本发明对各种不同血清型的流感嗜血杆菌是有效的，但是在保护免于由无法分类 的流感嗜血杆菌（NTHI)感染引起的疾病中可以是特别有用的。根据本发明，感染可以与选 自例如中耳炎（包括急性中耳炎）、支气管炎、结膜炎、鼻窦炎、泌尿道感染、肺炎、菌血症、 脓毒性关节炎、会厌炎、肺炎、积脓、心包炎、蜂窝织炎、骨髓炎、下呼吸道感染或脑膜炎的疾 病或病症有关。本发明通过引起免疫应答(其阻止细菌从咽喉经由咽鼓管移动至中耳然后 在中耳处寄居），对于治疗或预防中耳的炎症而言或对于治疗或预防COPD疾病而言是特 别有用的。
[0144] 本发明还提供了包含第一组分和第二组分的试剂盒，其中第一组分和第二组分都 不是如上所述的本发明组合物，但是其中可以组合所述第一组分和第二组分以提供如上所 述的本发明组合物。所述试剂盒可以进一步包括含有以下一种或多种的第三组分:说明书、 注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
[0145] 本发明还提供了一种预填充了本发明的免疫原性组合物的递送装置。
[0146] 所述哺乳动物优选地是人，例如人患者。在所述疫苗用于预防用途的情况下，人优 选地是儿童（例如幼儿或婴儿)或青少年;在所述疫苗用于治疗用途的情况下，人优选地是 青少年或成年人。意图用于儿童的疫苗还可以施用给成年人，例如以评估安全性、剂量、免 疫原性等。哺乳动物(例如人，例如患者）可能处于来自疾病本身的风险中，或可能是怀孕 的雌性，例如妇女（"母源免疫"）。
[0147] 检查治疗性处理的效力的一种方式包括，在施用本发明的组合物以后，监测细菌 (例如流感嗜血杆菌)感染。一种检查预防性处理的效力的方法包括，在施用所述组合物以 后，监测针对所述组合物中抗原的全身免疫应答(诸如监测IgGl和IgG2a产生水平)和/或粘 膜免疫应答(诸如监测IgA产生水平）。可以如下确定本发明的组合物的免疫原性:将它们施 用给测试受试者（例如12-16个月龄的儿童，或动物模型诸如毛丝鼠模型[84])，然后 确定标准参数，包括IgG的ELISA滴度(GMT)。这些免疫应答通常在施用所述组合物以后约 4周确定，并与在施用所述组合物以前确定的值进行对比。在施用超过一剂组合物的情况 下，可以进行超过一次施用后确定。通常，在免疫接种之后但是在攻击之前确定抗原特异性 的血清抗体应答，而在免疫接种之后和在攻击之后确定抗原特异性的粘膜抗体应答。
[0148] 还可以用所述疫苗组合物通过在细菌（例如流感嗜血杆菌)感染的动物模型（例 如，豚鼠毛丝鼠或小鼠）中的免疫接种研究在体内确定疫苗组合物的效力。一种这样的模型 描述在参考文献[85]中。
[0149] 用于在体内确定本发明的疫苗组合物的效力的其它有用的动物模型描述在参考 文献[86]中。
[0150] 本发明的组合物通常直接施用给患者。通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉 内、肌肉内或注射至组织的间质间隙），或通过粘膜，诸如通过直肠、口服（例如片剂、喷雾 剂）、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜施用，可以实现直接递送。
[0151] 本发明可以用于引起全身免疫和/或粘膜免疫，优选地用于引起增强的全身免疫 和/或粘膜免疫。
[0152] 优选地，增强的全身免疫和/或粘膜免疫表现为增强的THl和/或TH2免疫应答。优 选地，所述增强的免疫应答包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA的产生的增加。
[0153] 可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可以用于初次免疫方案和/ 或加强免疫方案。在多剂量方案中，可以通过相同或不同的途径施用多个剂量，例如胃肠外 激发和粘膜加强，粘膜激发和胃肠外加强等。通常间隔至少1周（例如约2周、约3周、约4周、 约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用多剂量。
[0154] 根据本发明制备的疫苗可以用于治疗儿童和成年人。因此，人患者可以是小于1 岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选患者是老年人(例如2 50岁，2 60 岁，优选2 65岁）、年轻人(如<5岁）、住院患者、健康护理工作者、武装部队和军事人员、孕 妇、慢性病患者或免疫缺陷患者。但是，所述疫苗不仅适用于这些群体，可以用于更广泛的 群体。
[0155]可以将通过本发明生产的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在健康护理专业人员 或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间）施用给患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、 风疹疫苗、丽R疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、联 合的B型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌 的联合疫苗(诸如四价A-C-Wl 35-Y疫苗）、呼吸道合胞体病毒疫苗等基本上同时施用。
[0156] 粘膜免疫 本发明提供了用于粘膜免疫的本发明的组合物。本发明还提供了一种用于提高哺乳动 物中的免疫应答的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的这样的免疫原性组合 物的步骤。所述组合物优选地经由粘膜层施用(至粘膜表面），例如它可以鼻内施用。
[0157] 细菌的ADP-核糖基化毒素和/或其脱毒衍生物可以存在，其可以例如从大肠杆菌 热不稳定的肠毒素（"LT"）衍生出。所述衍生物可以在它的A亚基中具有脱毒突变，例如它 可以是LT-K63或LT-R72。具体地，它可以是LT-K63。在其它实施方案中，它不是LT-K63。
[0158] 本发明的组合物和LT-K63佐剂的鼻内施用是优选的。这可以减小鼻咽、肺和血液 中的流感嗜血杆菌细菌负载，并增加受感染的哺乳动物的存活率。
[0159] 本发明的组合物的其它抗原组分 本发明还提供了这样的组合物:其进一步包含至少一种无法分类的流感嗜血杆菌抗原 或至少一种其它无法分类的流感嗜血杆菌抗原。
[0160] 本发明还提供了这样的组合物:其进一步包含至少一种不是无法分类的流感嗜血 杆菌抗原的抗原。
[0161] 具体地，本发明还提供了这样的组合物:其包含一种或多种本发明的多肽和一种 或多种下述其它抗原： -得自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、B、C、W135和/或Y的抗原。 -得自肺炎链球菌的糖或多肽抗原[例如[87]、[88]、[89]。 -得自甲型肝炎病毒(诸如灭活的病毒)的抗原[例如[90]、[91]。 -得自乙型肝炎病毒的抗原，诸如表面抗原和/或核心抗原[例如91、[92]。 -白喉抗原，诸如白喉类毒素[例如参考文献[93]的第3章]或CRM197突变体[例如
[94]。 -破伤风抗原，诸如破伤风类毒素[例如参考文献93的第4章]。 -得自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，诸如得自百日咳博德特氏 菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，任选地也与百日咳杆菌粘附素和/或凝 集原2和3组合[例如参考文献[95]和[96]。 -全细胞百日咳抗原 -得自流感嗜血杆菌B的糖抗原[例如[97]。 -脊髓灰质炎抗原[例如[98]、[99]诸如IPV。 -麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献93的第9、10和11章]。 -流感抗原[例如参考文献93的第19章]，诸如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面 蛋白。 -得自粘膜炎莫拉菌的抗原[例如[100]。 -得自无乳链球菌(B群链球菌）的蛋白抗原[例如[101]、[102]。 -得自无乳链球菌(B群链球菌)的糖抗原。 -得自酿脓链球菌(A群链球菌）的抗原[例如102、[103]、[104]。 -得自金黄色葡萄球菌的抗原[例如[105]。 -得自呼吸道合胞体病毒的抗原，例如重组蛋白F。 -包含白喉（D)、破伤风（T)、百日咳（无细胞组分）（Pa)、乙型肝炎（rDNA) (HBV)、 骨髓灰质炎（灭活的）（IPV)和流感嗜血杆菌b型（Hib)缀合物疫苗（吸附的）的疫苗组 合物，例如吸附无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗(Infanrix-hexa) 所述组合物可以包含这些其它抗原中的一种或多种。与RSV疫苗和/或与含有DTPa的 疫苗的组合是特别重要的。
[0162] 在必要时，可以将毒蛋白抗原脱毒(例如通过化学和/或遗传方式将百日咳毒素脱 毒[96])。
[0163]在所述组合物包含白喉抗原的情况下，还优选地包括破伤风抗原和百日咳抗原。 类似地，在包括破伤风抗原的情况下，还优选地包括白喉和百日咳抗原。类似地，在包括百 日咳抗原的情况下，还优选地包括白喉和破伤风抗原。因此，DTP组合是优选的。
[0164]糖抗原优选地呈缀合物的形式。所述缀合物的载体蛋白包括白喉毒素、破伤风毒 素、脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白[106]、合成肽[107]、[108]、热激蛋白[109]、[110]、百日咳 蛋白[111]、[112]、得自流感嗜血杆菌的蛋白D[113]、细胞因子[114]、淋巴因子[114]、链 球菌蛋白、激素[114]、生长因子[114]、得自难辨梭菌的毒素 A或B[115]、铁摄取蛋白 [116]等。一种优选的载体蛋白是白喉毒素的CRM197突变体[117]。
[0165]所述组合物中的抗原通常以每种至少lμg/ml的浓度存在。一般而言，任意给定抗 原的浓度足以引起针对该抗原的免疫应答。
[0166] 作为在本发明的免疫原性组合物中使用蛋白抗原的替代方案，可以使用编码抗原 的核酸(优选DNA，例如以质粒的形式）。
[0167] 优选地将抗原吸附至铝盐上。
[0168] -般方面 术语"包含"包括"包括"以及"由...组成"，例如，"包含"X的组合物可以排它地由X组 成，或者可以包含其它物质，例如X+Y。
[0169]关于数值X的术语"约"是任选的，且是指例如X±10%。
[0170]词语"基本上"不排除"完全地"，例如"基本上不含有" Y的组合物可以完全地不含 有Y。在必要时，词语"基本上"可以从本发明的定义中省略。
[0171]对两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比的提及表示，当进行比对时，所比较 的两个序列中相同的氨基酸的百分比。使用本领域已知的软件程序，例如在参考文献 [118]的7.7.18部分中描述的那些，可以进行该比对并确定同源性或序列同一性百分比。通 过Smi th-Waterman同源性检索算法确定优选比对，所述算法使用仿射缺口检索，其中缺口 开放罚分为12,缺口延伸罚分为2，BL0SUM矩阵为62 Jmith-Waterman同源性检索算法是众 所周知的，且公开在参考文献[119]中。
【附图说明】
[0172] 图l:NTHi LytM因子的表达和亚细胞定位.（A)使用针对NT013、NT017和NT022产 生的特异性抗血清，对不同细胞间隔提取物进行蛋白质印迹分析。1 -重组蛋白，2 -总提 取物WT，3总提取物K0,4 -外膜蛋白WT，5 -外膜蛋白K0,6 -周质级分WT，7 -周质级 分K0,8 -上清液，WT 9 -上清液K0。红色箭头指示特异性信号。如预期的，用突变株没 有观察到特异性反应性;但是，抗血清与也存在于敲除的菌株中的未表征的其它非特异性 带交叉反应。（B)对Hi 176野生型菌株和176 ΔΝΤ022突变体的免疫荧光显微术分析证实 蛋白ΝΤ022的表面定位。细菌是红色，且LytM因子呈绿色。（C) NTHi中的LytM蛋白定位的模 型。
[0173] 图2:NTHi Hil76野生型和LytM突变体的表型表征.在37°C生长16h的液体静 置培养物的聚集表型(A)和CFU/毫升（B)。在两种不同的OD进行CFU计数。176 ΔΝΤ017菌株 具有与亲本菌株类似的生长速率和CFU，而176ΔΝΤ013和176ΔΝΤ022突变体表现出降低 的生长速率生长和更低的CFU。（C)显示176 Δ NT013和176 Δ NT022菌株的细菌聚集的共焦 成像，细菌被染成红色，Dapi被染成蓝色。
[0174] 图3:在LytM突变体上的共焦和电子显微术.（A) Hil76 wt、176ANT013和176Δ 阶022的共焦成像，将细菌染成红色（抗总细菌）和蓝色(04?1)。（8)176￥丨、176八阶013和 176 Δ NT022的扫描电子显微术。突变体176 Δ NT017与野生型菌株相比没有表现出任何差异 (数据未显示）。
[0175] 图4:LytM突变体中的隔膜形成.在Hil76 wt和LytM突变体上的透射电子显微 术。红色箭头指示突变体176 △ NT013和176 △ NT022中的受损的隔膜形成。
[0176] 图5:突变体176ΔΝΤ013和176ΔΝΤ022释放比野生型菌株更多的(1^。氾176耵、 176 Δ NT013和176 Δ NT022突变体和它们各自的OMV制剂制剂的透射电子显微术。红色箭头 指示从细菌表面释放的0MV。
[0177] 图6:01^的分析.从野生型、176&阶013和176&阶022菌株制备的01^的考马斯染 色的SDS page凝胶（A)。在选择的带上进行质谱法鉴定（B)。使用稳定地表达NF-kB-萤光 素酶报告盒和TLR2 (C)或TLR4/MD2/CD14 (D)的HEK293细胞的萤光素酶测定。通过测量在 与连续稀释的OMV-起温育6小时以后NF-kB诱导的萤光素酶活性，评估TLR受体的刺激。 在用从野生型和突变株纯化的OMV的不同稀释液刺激的hPBMC (O.N.)中测量IL-6和TNFa 水平(E-F)。
[0178] 图7:在OMV中发现的蛋白的分析。
[0179] 图8:在OMV中的脂蛋白。得自WT、AtolR、Δ 17的OMV具有类似的脂蛋白量，而Δ 13 和Δ 22突变体富含脂蛋白，尤其是NTHI1957和NTHI 0353脂蛋白。
[0180]图9:在OMV中的周质蛋白。主要周质蛋白是周质丝氨酸蛋白酶do HhoA。对于从Δ 13衍生出的小泡，这是特别真实的。与从WT产生的OMV相比，从Δ tolR和Δ 22衍生出的OMV 富含周质蛋白。与从WT产生的OMV相比，从Δ 17衍生出的OMV含有小量周质蛋白。
[0181]图10:在OMV中的外膜蛋白。从每类0MV，最丰富的外膜蛋白是nt099 (外膜蛋白 P2)和nt092 (外膜蛋白P5)。就从△ 13和Δ22衍生出的OMV而言，观察到的外膜蛋白量的主 要下降是由于P2的减少。
[0182] 图11:在OMV中的蛋白的相对量。与野生型菌株相比，在由突变株产生的OMV中发现 的蛋白nt067、nt014、nt022和nt016的相对量。
[0183] 图12:MC58 Δ 1483和野生型细菌的DAPI染色。
[0184] 图13:MC58 Δ 1483和野生型细菌的TEM (A)和SEM (B)分析。
[0185] 图14:由MC58 Δ 1483和野生型细菌产生的小泡的蛋白分析。
[0186] 图15:BP1721敲除的和野生型细菌的DAPI染色。
[0187] 图16:NlpD同系物的多重比对。
[0188] 图17:YebA同系物的多重比对。
[0189] 图18:EnvC同系物的多重比对。
[0190] 图19:由Bp W28 9G/129K ANlpD和野生型细菌产生的小泡的蛋白分析。
【具体实施方式】
[0191] 针对3种LytM 金属蛋白酶：NTHI0532 (NT013)、NTHI0915 (NT017)和NTHI0830 (NT022)，制备单敲除的无法分类的流感嗜血杆菌（NTHi)突变体。这些突变体表现出造成 外膜小泡（OMV)的释放的增加的细胞表面缺陷。此外，证实了这些蛋白参与细菌细胞分裂 和发病机制。具体地，NT013和NT022是肽聚糖切割和细胞分裂的基础。NT017对NTHi寄生 和宿主免疫逃避具有强影响。
[0192] 方法 细菌菌株和生长条件 将NTHi菌株176用于该研究。它作为得自中耳的分离物是芬兰中耳炎组群研究的一 部分。在5% CO2下在37°C温育的巧克力琼脂polivitex (BioMerieux)上培养NTHi。使用补 充了10 yg/mL的每种氯化血红素 （Fluka Biochemika)和烟酰胺腺噪呤二核苷酸（NAD, Sigma)的脑心浸液（BHI)液体培养基（Difco Laboratories)作为流体生长培养基。使用 大肠杆菌菌株DH5a、HK100和BL21 (DE3) (Invitrogen)进行LytM蛋白的克隆和表达。将 它们在37°C在Luria Bertani (LB)培养基中培养，且在必要时补充100 yg/mL氨苄青霉 素。
[0193]细胞培养物 在该研究中使用的组织培养细胞是Chang上皮细胞(Wong-Kilbourne衍生物，克隆1-5c-4,人结膜，ATCC? CCL-20.2?)和HEK293 (人肾，ATCC? CRL1573 ?)。将Chang 细胞 维持在补充了25 mM !fepes、15 mM L-谷氨酰胺、抗生素和10% (体积/体积）热灭活胎牛血 清（FCS, Invitrogen Corporation)的Dulbecco氏改良伊格尔培养基（D-MEM; Gibco) 中。在5% CO2下在37°C培养它们。
[0194] 在含有4.5 g/ml葡萄糖的DMEM中培养稳定地表达TLR2或TLR4/MD2/CD14和NF-κ B-萤光素酶报告盒的HEK293细胞，所述DMEM补充了 10%热灭活的FBS、100 U/ml青霉素、 100 μg/ml链霉素、2 mM谷氨酰胺、5 μg/ml噪呤霉素、250 μg/ml潮霉素（且对于 HEK293-TLR4细胞，添加 10 μg/ml杀稻瘟素）。
[0195] 编码LytM蛋白的基因的克隆 通过聚合酶不完全引物延伸（PIPE)方法（119)，将LytM基因克隆进pET15b+载体 (Novagen)中。简而言之，通过PCR从HI176基因组DNA扩增编码每种蛋白的序列，从而除去 信号肽。PCR产生不完全延伸产物的混合物;通过引物设计，将短重叠序列引入在这些不完 全延伸混合物的末端，这允许互补链对合和产生杂合的载体-插入片段组合。然后用载体-插入片段杂合体转化大肠杆菌HKlOO细胞[120]。选择单个氨苄青霉素抗性的菌落，并通 过PCR检查重组质粒的存在。将得自阳性克隆的质粒分离，并亚克隆进感受态大肠杆菌 BL21(DE3)细胞中。
[0196] 重组蛋白的表达和纯化 为了蛋白纯化，将表达NTHI0532、NTHI0915和NTHI0830的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的 一个单独菌落接种在LB +氨苄青霉素中，并在37°C培养过夜，在新鲜LB培养基中稀释，并 在3〇°(3生长至〇.6-〇.8的〇〇。通过添加111^异丙基-1-硫代-0-〇-吡喃半乳糖苷（1?丁6 ; Sigma)保持4小时，诱导蛋白过表达。通过Ni2+-缀合的螯合快速流Sepharose 4B树脂 (Pharmacia)上的亲和色谱法，纯化重组的6 X His-融合蛋白。通过使用考马斯蓝的SDS-PAGE电泳染色，检查纯度。使用双辛丁酸（BCA)测定（Thermo Scientific)，确定蛋白浓 度。
[0197]敲除突变体的构建 通过红霉素抗性盒对每个完整基因的等位基因替换，构建NTHI0532、NTHI0915和 NTHI0830的缺失突变体。使用下面列出的引物，通过PCR扩增所述3个基因的上游和下游区 域，并克隆进Stratagene pSC-A TOPO载体中。从p頂13质粒纯化红霉素抗性盒。装配含有 上游区域、抗性盒和下游区域的构建体。将得到的质粒线性化，并用于使用MIV方案[121] 转化176个NTHi菌株。通过PCR、蛋白质印迹和基因座测序，证实得到的敲除的菌株。
[0198]多克隆抗血清的