一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体。所述突变体的氨基酸序列如以下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)所示：(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，(3)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，(4)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，(5)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，(6)在(1)或(2)或(3)或(4)或(5)的氨基酸序列基础上经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或者添加，且具有碱性果胶酶PGL活性的氨基酸序列。本发明的突变酶和原始酶相比更有利于其在工业上的应用，在纺织脱胶领域具有很好的应用前景。
【专利说明】
一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体。
【背景技术】
[0002] 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1-4糖苷键聚合而成的多糖链，去酯 化的果胶被称为果胶酸或者多聚半乳糖醛酸。果胶广泛存在于所有的高等植物细胞间质 中，果胶为细胞内部的支撑物质，纤维素、半纤维素和木质素则存在于初生细胞壁，它们以 及一些伸展蛋白和果胶相互交联，组成坚硬的细胞结构来维持细胞的形态。各种苎麻，亚 麻，黄麻等植物纤维的脱皮、解聚和脱胶处理都需要去掉纤维上的果胶类物质，因此利用果 胶酶脱胶具有重要的工业应用价值。
[0003] 多种微生物都能够产生果胶酶，如细菌、酵母、真菌、放线菌。果胶酶是分解果胶类 物质的多种酶的总称，它可将果胶分解为半乳糖醛酸等物质。果胶酶按其作用的pH值可分 为:酸性果胶酶、中性果胶酶和碱性果胶酶。果胶酶按其作用方式可分为:果胶酯酶和果胶 解聚酶。果胶酯酶的作用是从果胶分子上移走甲基，果胶解聚酶的作用是降解果胶糖苷键。 果胶解聚酶又分为两个类别：果胶水解酶和果胶裂解酶。果胶水解酶的作用是水解果胶糖 苷键，果胶裂解酶的作用是通过β消除反应使糖苷键断裂，该酶攻击底物的糖苷键在邻近羧 基或酯化的羧基一边发生β消除长链分子内的糖苷键，而外切解聚酶是指从链的一端逐个 切断糖苷键。并且各种果胶解聚酶对底物的选择又有差别，有的对酯化度高的果胶作用容 易，有的对酯化度低的果胶作用容易。
[0004] 碱性果胶酶的作用最适pH在8.0-10.0,在植物药类提取、茶和咖啡发酵，纺织、造 纸、洗涤剂、植物纤维加工、含果胶工业废水处理及生物技术等行业的应用成为人们研究的 热点。微生物产生的碱性果胶酶在工业上有着很好的应用，作为棉织物染印煮练过程中的 至关重要酶制剂，碱性果胶酶的研发以及其在织物染印煮练中的应用，使绿色、温和的生物 煮练技术成为可能。在碱性条件下，作为棉纤维主体的纤维素有润胀的趋向，而果胶酶利用 其专一性有效分解去除在棉纤维表面对棉蜡等疏水性共生物起黏结作用的果胶质，使疏水 性物质从棉纤维表面脱落，从而达到精练效果，而纤维本身不受到损伤。因此，经生物精练 的棉纤维能最大程度的保持纤维强度，失重小，织物手感柔软厚实，且富有弹性。并且可节 约大量工艺用水、生产时间、能耗、原料及对废水的处理费用，减少对环境排放水中的盐含 量及C0D值等。
[0005] 本发明前期研究的碱性果胶酶基因来源于Bacillus subtilis 168,含有1263bp 的开放阅读框，编码420个氨基酸，通过Signal P分析显示该氨基酸序列含有21个氨基酸的 信号肽，将该基因 pell68在大肠杆菌中进行表达所得碱性果胶酶经纯化后进行酶学性质分 析的研究表明，该酶的最适温度为55°C，最适pH为9.4，比酶活为353.62U/mg，可以有效地进 行苎麻脱胶，但是应用成本过高，工业应用还有差距，因此通过分子改造和随机突变的方法 获得比酶活更高的碱性果胶酶对其在工业应用上的推广有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种碱性果胶酶突变体，尤其是一种具有更高比酶活的碱性 果胶酶突变体。
[0007] 所述突变体的氨基酸序列如以下（1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)所示：
[0008] (l)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，
[0009] (2)SEQIDN0·2所示的氨基酸序列，
[0010] (3)SEQIDN0·3所示的氨基酸序列，
[0011] (4)SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，
[0012] (5)SEQIDN0·5所示的氨基酸序列，
[0013] (6)在（1)或（2)或（3)或(4)或（5)的氨基酸序列基础上经过一个或者几个氨基酸 取代、缺失或者添加，且具有碱性果胶酶PGL活性的氨基酸序列。
[0014] 本发明还提供一种编码上述突变体的基因，进一步，所述基因包括密码优化的基 因。
[0015] 本发明可以利用下述突变体编码基因来实现的，也可以通过其他形式的简并密码 基因序列来实现，例如密码子优化后的基因。
[0016] 编码上述突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.9或SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列。
[0017] 编码SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列。
[0018] 编码SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID N0.7 所示的核苷酸序列。
[0019] 编码SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID N0.8 所示的核苷酸序列。
[0020] 编码SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID N0.9 所示的核苷酸序列。
[0021] 编码SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列的突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID N0.10 所示的核苷酸序列。
[0022] 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示的野生 碱性果胶酶的第47位的赖氨酸Lys突变成谷氨酸Glu。所得突变体命名为K47E。
[0023] 氨基酸序列如SEQ ID N0.2的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的碱性 果胶酶突变体的第132位的缬氨酸Val突变成苯丙氨酸Phe。所得突变体命名为K47E V132F。 [0024] 氨基酸序列如SEQ ID N0.3的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的碱性 果胶酶突变体的第272位的精氨酸Arg突变成色氨酸Trp。所得突变体命名为K47E V132F R272ff〇
[0025] 氨基酸序列如SEQ ID NO.4的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的碱性 果胶酶突变体的第47位的赖氨酸Lys突变成天门冬氨酸Asp。所得突变体命名为K47D V132F〇
[0026] 氨基酸序列如SEQ ID NO.5的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的碱性 果胶酶突变体的第272位的精氨酸Arg突变成色氨酸Trp。所得突变体命名为K47D V132F R272ff〇
[0027] 本发明还提供一种携带上述基因的载体、重组细胞或重组菌。
[0028] 本发明还提供一种获得所述碱性果胶酶突变体的方法，是以野生型碱性果胶酶的 基因为模板，采用倾向错误PCR、定点饱和突变和/或重叠延伸PCR进行定点突变获得编码突 变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达获得突变体。
[0029] 具体来说，是将来源于Bacillus subtilis 168的野生型碱性果胶酶基因 （SEQ ID NO · 11)为模板，先采用error-prone PCR进行随机突变，用96孔板筛选得到比酶活提高的编 码碱性果胶酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示;采用重叠延伸PCR的方法获 得编码碱性果胶酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 10所示;采用定点饱和诱变的方法获得编码碱性果胶酶突变体的基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.9所示。经过测序鉴定所有突变位点均已成功按照预设目标得到突变。
[0030] 进一步，对于氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的碱性果胶酶单突变体K47E的构建， 以野生型碱性果胶酶的基因为模板通过倾向错误PCR进行随机诱变，筛选得到将47位的赖 氨酸突变为谷氨酸的突变株;对于氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的碱性果胶酶双突变体 K47E V132F的构建，以突变酶K47E基因为模板通过重叠延伸PCR并筛选得到将132位的缬氨 酸突变为苯丙氨酸的突变株;对于氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示的碱性果胶酶双突变体 K47D V132F的构建，以突变酶K47E V132F基因为模板通过47位点的定点饱和诱变筛选得到 将47位点的赖氨酸突变为天门冬氨酸;对于氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示的碱性果胶酶 三突变体K47E V132F R272W的构建，以突变酶K47E V132F基因为模板通过重叠延伸PCR将 272位点的精氨酸突变为色氨酸;对于氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示的碱性果胶酶三突变 体K47D V132F R272W的构建，以突变酶K47D V132F基因为模板通过重叠延伸PCR将272位点 的精氨酸突变为色氨酸。
[0031] 所述重组表达优选以pET28a为表达载体，以大肠杆菌Rosetta(DE3)为表达宿主构 建重组菌。
[0032] 所述用于error-prone PCR的引物是：
[0033] eppel FP:5，-GCGTCGACGAGCTGAT-3，；
[0034] eppe1 RP:5，~ATAAGAATGCGGCCGCTTAAT~3，；
[0035] 所述用于定点突变的引物是：
[0036] VI32F FP:5，-CTGCAAACACGACGATCTTCGGTTCAG-3，；
[0037] V132F RP:5 '-CTTTAGCGTTAGTCCCTGAACCGAAGATC-3'；
[0038] R272W FP:5 '-AAATTACGCTGCATCATAACTGGTATAAA-3'；
[0039] R272W RP:5 '-CGCGCTGGACAATATTTTTATACCAGTTA-3'；
[0040] 所述用于定点饱和突变的简并引物是：
[0041 ] BH1 FP:5 '-GCTTGTCTCGGCATTAGGGVMAGAAACG-3'；
[0042] BH1 RP:5 '-GCGTTGTGTTCGTTTCTKBCCCTAATG-3 '；
[0043] BH2 FP:5 '-AGCTTGTCTCGGCATTAGGGNDTGAAAC-3'；
[0044] BH2 RP:5 '-GGCGTTGTGTTCGTTTCAHNCCCTAATG-3'；
[0045] BH3 FP:5 '-GCTTGTCTCGGCATTAGGGATGGAAACG-3'；
[0046] BH3 RP:5 ' ~GGCGTTGTGTTCGTTTCCATCCCTAATG~3'；
[0047] BH4 FP:5 ' ~GTCTCGGCATTAGGGTGGGAAACGAAC~3'；
[0048] BH4 RP:5 ' ~TTGGCGTTGTGTTCGTTTCCCACCCTAA~3'。
[0049] 本发明提供应用基因工程菌发酵生产所述碱性果胶酶突变体的方法，是将含有编 码突变碱性果胶酶的基因的重组菌（例如：含有编码突变碱性果胶酶的基因的Rosetta (DE3))活化培养后接入100ml含有50μg/ml卡那霉素的LB发酵培养基中，于37°C，220rpm培 养，菌体生长到一定阶段(〇D 6QQ = 0.6-0.8)，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，同时将温 度调整为18°C，诱导发酵16h。将所得菌液离心后收集菌体超声波破菌，破菌上清液即为碱 性果胶酶粗酶液，其中含有突变体。
[0050] 所述活化培养是从甘油管中将重组菌接种于20ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养 基中，培养温度37°C，220rpm摇床上振荡培养10h。
[0051 ] 也可以将上述获得的上清经过Ni-NTA亲和层析柱纯化以及GE-desalting柱脱去 咪唑，得到纯化后的碱性果胶酶突变体。
[0052]本发明通过随机突变、定点突变和饱和突变的方法改造碱性果胶酶基因，使所编 码的PGL活性提高，比酶活增强。突变后的碱性果胶酶突变体比酶活分别提高为640.81、 873.30、1388.37、1256.17和1544.421]/11^，分别是野生型的1.81、2.47、3.93、3.55和4.37 倍。本发明提供的PGL的比酶活有较大幅度的提高，更加适合工业化生产的需要，满足社会 生产的需求。
[0053]本发明还提供一种突变体在工业纺织脱胶中的应用。
【具体实施方式】
[0054]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0055] 本发明公开了一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，属于基因工程和酶工程领 域。本发明将来源于Bacillus subtil is 168的碱性果胶酶编码基因 pel 168进行倾向错误 PCR进行随机诱变，筛选获得单突变体K47E;随后结合之前已发表专利的突变位点V132F整 合突变得到双突变体K47E V132F;然后通过重叠延伸PCR的方法定点突变得到三突变体 K47E V132F R272W，同时将47位点进行饱和突变得到K47D V132F;最后通过定点突变得到 三突变体K47D V132F R272W。五株突变酶K47E、K47E V132F、K47D V132F、K47E V132F R272W和K47D V132F R272W均表现出了更高的比酶活，分别为原始酶的1.81、2.47、3.93、 3.55和4.37倍。本发明的突变酶和原始酶相比更有利于其在工业上的应用，在纺织脱胶领 域具有很好的应用前景。
[0056] 下面通过具体的实施例来进行介绍。
[0057]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059] 实施例1、碱性果胶酶突变体的获得
[0060] 一、随机突变得到K47E
[0061 ] 通过error-prone PCR构建碱性果胶酶基因 pel突变体库，根据碱性果胶酶基因 pel的核苷酸序列设计点突变引物对如下：
[0062] 正向引物FI: 5' -GCGTCGACGAGCTGAT-37 ；
[0063] 反向引物R1:5' -ATAAGAATGCGGCCGCTTAAT-37 ；
[0064]正向引物的下划线部分为Sail的酶切位点，反向引物的下划线部分为Not頂每切位 点。
[0065]以原始基因 pel为模板（序列信息如SEQ ID N0.11所示），用设计的引物对进行 error-prone PCR扩增。
[0066] PCR反应体系：
[0067]
[0068] PCR反应条件：94°C预变性5min，然后91°C变性lmin，55°C退火30s，72°C延伸90s， 25个循环，最后72°C延伸SmiruPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA 纯化试剂盒纯化。
[0069] 将PCR产物片段和pET28a载体(购自Stratagene)用Notl和Sail双酶切，琼脂糖电 泳回收酶切产物，酶连后电转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞(购自Transgen)，涂布于含 有50μg/ml卡那霉素的LB平板，37°C过夜培养。平板上得到的菌株即为碱性果胶酶基因突变 体库，将单菌落接种于含有200μ1(含有50μg/ml卡那霉素)LB的96孔板中37°C培养12h，用终 浓度为〇.5mM IPTG诱导2h，用破菌缓冲液(购自GBCBI0 technology)破菌后取上清测酶活， 初步筛选出酶活最高的菌株即为产碱性果胶酶突变体K47E的菌株，命名为Rosetta/ pET28a-pelK47E。从该突变体菌株中得到的质粒为pET28a-pelK47E，该质粒携带有SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0070] 二、定点突变得到K47E V132F
[0071]参考以前已发表的专利（申请名称:一种pH稳定比酶活高的重组碱性果胶酶及其 构建方法，公开号：CN103881996A)，将第132位的V突变成芳香族氨基酸苯丙氨酸F，可以增 强疏水性。根据碱性果胶酶基因 pel的核苷酸序列设计点突变引物对如下：
[0072] 正向引物F2:5 ' -CTGCAAACACGACGATCTTCGGTTCAG-3 '
[0073] 反向引物R2:5 ' -CTTTAGCGTTAGTCCCTGAACCGAAGATC-3 '
[0074]以质粒pET28a_pel K47E为模板，用设计的引物对进行重叠延伸PCR扩增。
[0075] PCR反应体系：
[0076]
[0077] PCR反应条件：94°C预变性5min，然后94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸7min， 16个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0078] PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。将纯 化后的PCR产物用Dpnl进行去甲基化，转化到大肠杆菌)(L-G〇ld克隆感受态细胞（购自 Stratagene)中，挑选两个转化子进行测序得到正确的点突变的重组载体pET28a_pel K47EV132F，该重组载体上携带有SEQIDN0.7所示的核苷酸序列，SEQIDN0.7所示的核苷 酸序列编码SEQ ID NO.2所示的突变体。
[0079] 三、定点饱和突变得到K47D V132F
[0080]通过设计简并引物来进行重叠延伸PCR对47号位点饱和突变，从而筛选更好的突 变体。根据碱性果胶酶基因 pel的核苷酸序列设计简并引物对如下：
[0081 ] BH1FP:5 '-GCTTGTCTCGGCATTAGGGVMAGAAACG-3 '；
[0082] BH1RP:5 '-GCGTTGTGTTCGTTTCTKBCCCTAATG-3 '；
[0083] BH2FP:5 '-AGCTTGTCTCGGCATTAGGGNDTGAAAC-3 '；
[0084] BH2RP:5 '-GGCGTTGTGTTCGTTTCAHNCCCTAATG-3 '；
[0085] BH3FP:5 '-GCTTGTCTCGGCATTAGGGATGGAAACG-3 '；
[0086] BH3RP:5 '-GGCGTTGTGTTCGTTTCCATCCCTAATG-3 '；
[0087] BH4FP:5 '-GTCTCGGCATTAGGGTGGGAAACGAAC-3 '；
[0088] BH4RP:5 '-TTGGCGTTGTGTTCGTTTCCCACCCTAA-3 '；
[0089]以质粒pET28a-pel K47E V132F为模板，用设计的引物对进行重叠延伸PCR扩增， PCR反应体系和条件如步骤二中所述。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并 用DNA纯化试剂盒纯化。纯化后的PCR产物转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，得 到的转化子挑取并点在果胶底物平板上进行功能性筛选，以突变体K47E VI32F作为对照， 筛选水解圈比对照更大的转化子进行摇瓶发酵。最后经过测序验证筛选得到的转化子即为 Rosetta/pET28a-pelK47D V132F，该转化子含有的质粒为pET28a-pel K47D V132F，该质粒 含有SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列，SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列编码SEQ ID N0.4所 示的突变体。
[0090] 四、定点突变得到K47E V132F R272W、K47D V132F R272W
[0091] 将272位点的精氨酸R突变为色氨酸W，根据碱性果胶酶基因 pel的核苷酸序列设计 点突变引物对如下：
[0092] R272W FP:5 '-AAATTACGCTGCATCATAACTGGTATAAA-3 '；
[0093] R272W RP:5 '-CGCGCTGGACAATATTTTTATACCAGTTA-3 '；
[0094] 分别以质粒pET28a-pel K47E V132F和质粒pET28a-pel K47D V132F为模板，用设 计的引物对进行重叠延伸PCR扩增，PCR反应体系和条件如步骤二中所述。PCR产物用1 %琼 脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。将纯化后的PCR产物用Dpnl进 行去甲基化，转化到大肠杆菌XL-Gold克隆感受态细胞中，挑选两个转化子进行测序得到正 确的点突变的重组载体pET28a-pel K47E V132F R272W和pET28a-pel K47D V132F R272W。
[0095] 重组载体pET28a-pelK47EV132FR272W含有SEQIDN0·8所示的核苷酸序列， SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO.3所示的突变体。
[0096] 重组载体pET28a-pelK47DV132FR272W含有SEQIDN0·10所示的核苷酸序列， SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列编码SEQ ID N0.5所示的突变体。
[0097] 实施例2、碱性果胶酶的表达纯化
[0098] 将质粒pET28a-pel、pET28a-pelK47EV132F、pET28a-pelK47EV132FR272W和 pET28a-pelK47D V132F R272W分别转入Rosetta中，获得重组菌Rosetta/pET28a-pel、 Rosetta/pET28a-pelK47E V132F、Rosetta/pET28a-pelK47E V132F R272W和Rosetta/ pET28a-pelK47D V132F R272ff〇
[0099] 将六种重组菌Rosetta/pET28a-pel、Rosetta/pET28a-pelK47E、Rosetta/pET28a-pelK47E V132F、Rosetta/pET28a-pelK47D V132F、Rosetta/pET28a-pelK47E V132F R272W 和Rosetta/pET28a-pelK47D V132F R272W分别培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基 中，37°C培养3h;0D6Q() = 0.6-0.8时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.5mM，转至18°C 继续培养16h。
[0100] 5000rpm、10min离心收集菌体，悬浮于溶液A(20mM Tris-HCl，pH9.4,0.5M NaCl， 10mM咪唑）中，于冰浴中超声破碎(60w，10min;超声2s，停止4s)，之后12000rpm离心10min除 去细胞碎片，取上清液;将上清液过Ni-IDA His · Bind Superflow纯化柱，用5ml溶液A冲 洗，再用l〇ml溶液B(20mM Tris-HCl，pH9.4,0.5M NaCl，60m Μ咪唑）漂洗，最后用5ml溶液C (20mM Tris-HCl，pH9 · 4，0 · 5M NaCl，500mM咪唑）洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用GE-desal t ing柱脱去咪挫，获得纯化的六种碱性果胶酶的溶液。
[0101] SDS-PAGE电泳显示纯化的PEL168、PEL168K47E、PEL168K47E V132F、PEL168K47D V132F、PEL168K47E V132F R272W和PEL168K47D V132F R272W蛋白的分子量均约为46kDa。 [0102 ]实施例3、六种碱性果胶酶的比酶活比较
[0103] 一、果胶酶酶活的测定方法
[0104] 分别将酶稀释液和PGA溶液于55°C预热5min;取20μ1酶稀释液，加入2ml含0.2% PGA的缓冲液来起动酶促反应;反应条件为55°C，15min，再用3ml 0.03mol/L的磷酸缓冲液 终止反应，在235nm处测定其吸光度值。
[0105] 空白对照:无活性的酶液反应（即：先取3ml磷酸缓冲液与待测酶液混匀，如上述反 应条件反应，再加入底物终止反应）。
[0106] 酶活计算：
[0107]
[0108] 式中：4600(L · mol-Vm-4 -不饱和PGA在235nm处的摩尔吸光系数；
[0109] t(min) -酶促反应时间(在酶反应的线性范围内）；
[0110] b(cm)-石英比色杯厚度；
[0111] 简化得:酶活(U/ml) = 3 · 6232x 稀释倍数 XOD235。
[0112] 二、蛋白浓度测定方法
[0113]利用购自碧云天的蛋白浓度测定试剂盒，反应化合物在465-595nm处有最大光吸 收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。取纯的BSA小牛血清蛋白，用 0.05mo 1/L Gly-NaOH缓冲液配制成0.5mg/ml蛋白溶液。吸取标准蛋白溶液0、1、2、4、8、12、 16和20μ1，用Gly-NaOH缓冲液定容至20μ1，加入试剂盒中的G250染色液200μ1，混匀，反应3-5分钟，在595nm处测定0D值，绘制蛋白浓度与0D595的标准曲线。待测样品蛋白与Gly-NaOH 缓冲液以一定比例混合，总体积为20μ1，同样加入G250染色液200μ1，混匀，反应3-5分钟，在 595nm处测定0D值，根据标准曲线计算出待测样品蛋白浓度。
[0114] 三、比酶活比较
[0115] 利用测得酶活除以蛋白浓度得到比酶活，实验结果列于表1，将野生酶与突变酶相 比，可以发现五株突变酶的比酶活和野生酶相比均有大幅度的提高，突变后的碱性果胶酶 突变体比酶活分别提高至640.81、873.30、1388.37、1256.17和1544.421]/11^，分别是野生型 的1.81、2.47、3.93、3.55和4.37倍。
[0116] 表1野生酶与五株碱性果胶酶突变体的比酶活比较
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[0118] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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【主权项】
1. 一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如以 下（1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)所示： (1) SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列， (2) SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列， (3) SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列， (4) SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列， (5) SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列， (6) 在（1)或(2)或(3)或(4)或（5)的氨基酸序列基础上经过一个或者几个氨基酸取代、 缺失或者添加，且具有碱性果胶酶PGL活性的氨基酸序列。2. 编码权利要求1所述突变体的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，包括密码优化的基因。4. 携带权利要求2或3所述基因的载体、重组细胞或重组菌。5. -种获得权利要求1所述碱性果胶酶突变体的方法，其特征在于，是以野生型碱性果 胶酶的基因为模板，采用倾向错误PCR、定点饱和突变和/或重叠延伸PCR进行定点突变获得 编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达获得突变体。6. 根据权利要求5所述的获得碱性果胶酶突变体方法，其特征在于，对于氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示的碱性果胶酶单突变体K47E的构建，以野生型碱性果胶酶的基因为模板 通过倾向错误PCR进行随机诱变，筛选得到将47位的赖氨酸突变为谷氨酸的突变株;对于氨 基酸序列如SEQIDN0.2所示的碱性果胶酶双突变体K47EV132F的构建，以突变酶K47E基 因为模板通过重叠延伸PCR并筛选得到将132位的缬氨酸突变为苯丙氨酸的突变株;对于氨 基酸序列如SEQIDN0.3所示的碱性果胶酶双突变体K47DV132F的构建，以突变酶K47E V132F基因为模板通过47位点的定点饱和诱变筛选得到将47位点的赖氨酸突变为天门冬氨 酸 ;对于氨基酸序列如SEQIDN0.4所示的碱性果胶酶三突变体K47EV132FR272W的构建， 以突变酶K47E V132F基因为模板通过重叠延伸PCR将272位点的精氨酸突变为色氨酸;对于 氨基酸序列如SEQIDN0.5所示的碱性果胶酶三突变体K47DV132FR272W的构建，以突变 酶K47D V132F基因为模板通过重叠延伸PCR将272位点的精氨酸突变为色氨酸。7. 根据权利要求5或6所述获得碱性果胶酶突变体方法，其特征在于，以pET28a为表达 载体同时以大肠杆菌R0setta(DE3)为表达宿主构建含有权利要求1所述突变体的重组菌。8. 根据权利要求7所述获得碱性果胶酶突变体方法，其特征在于，以LB液体培养基为发 酵培养基，重组菌在37 °C培养至0D6Q() = 0.6-0.8，加入IPTG后在18°C进行诱导表达16h，将所 得菌液离心后收集菌体超声波破菌，破菌上清液即为碱性果胶酶粗酶液，该碱性果胶酶粗 酶液中含有碱性果胶酶突变体。9. 根据权利要求8所述获得碱性果胶酶突变体方法，其特征在于，上清经过Ni-NTA亲和 层析柱纯化以及GE-desal t ing柱脱去咪唑，得到纯化后的碱性果胶酶突变体。10. 权利要求1所述突变体在工业纺织脱胶中的应用。
【文档编号】C12N15/60GK106085994SQ201610699824
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月22日 公开号201610699824.1, CN 106085994 A, CN 106085994A, CN 201610699824, CN-A-106085994, CN106085994 A, CN106085994A, CN201610699824, CN201610699824.1
【发明人】张桂敏, 望潇文, 易犁, 蒋思婧, 马延和
【申请人】湖北大学