一种催化效率与热稳定性提高的n-乙酰谷氨酸激酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种催化效率与热稳定性提高的N?乙酰谷氨酸激酶突变体，属于生物工程领域。将来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA5?5)的N?乙酰谷氨酸激酶的基因进行定点突变，使其编码的氨基酸序列在第91位由苯丙氨酸F突变为组氨酸H。本发明所述的N?乙酰谷氨酸激酶突变体的催化效率是野生型的2.12倍，在37℃下的半衰期是突变前的2.78倍。本发明所得N?乙酰谷氨酸激酶突变体更有利于精氨酸的生产需求，为高效合成L?精氨酸奠定了基础。
【专利说明】
一种催化效率与热稳定性提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体
技术领域
[0001] 本发明涉及一种催化效率与热稳定性提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，属于生物 工程技术领域。
【背景技术】
[0002] L-精氨酸是一种碱性半必须氨基酸，它具有多种生理功能。它是合成胞浆蛋白和 核蛋白的必需氨基酸;作为唯一的氨来源参与肌酸的合成;作为尿素循环的重要中间体，在 肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力 的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及 肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。 因此，L-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。
[0003] N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetyl glutamate kinase)简称NAGK，是L-精氨酸合成途 径的第二个酶和关键限速酶，同时它受终产物L-精氨酸的反馈抑制。在ATP的作用下，它催 化N-乙酰谷氨酸的λ-αχτ磷酸化从而生成L-精氨酸合成的中间体N-乙酰谷氨酸磷酸。
[0004] L-精氨酸生产方法有水解法和发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本 高等问题，并且存在严重的污染而不适合大规模的生产。因此，实现发酵法生产L-精氨酸成 为国内外氨基酸工业的一个十分迫切的问题。目前，用来产L-精氨酸的微生物菌株主要是 谷氨酸棒杆菌与钝齿棒杆菌，为提高精氨酸产量，研究者们利用DNA重组技术结合代谢工程 技术调控合成精氨酸的代谢途径，这使得精氨酸的产量大有提高。为进一步提高生产量研 究者渐渐开始将研究重点转向L-精氨酸限速酶一一Ν-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)，通过克隆Ν-乙酰谷氨酸激酶基因并导入其它菌株来表达，以及运用定点突变技术获得解除精氨酸对其 的反馈抑制，从而来提高发酵产L-精氨酸的能力。然而，虽然通过克隆Ν-乙酰谷氨酸激酶基 因（argB)并导入其它菌株获得了NAGK的过量表达，但是NAGK的比酶活并不高即NAGK的催化 活性较弱，且热稳定性不好即在37°C下NAGK的半衰期为36h，而L-精氨酸的发酵周期是96h。 因此，在保持N-乙酰谷氨酸激酶过量表达的基础上，提高其催化效率与热稳定性成为工业 生产的迫切需要。
[0005] 因此，本发明公开了一种催化效率与热稳定都显著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变 体，将来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酰谷氨酸激酶的基 因进行定点突变，使其编码的氨基酸序列在第91位由苯丙氨酸F突变为组氨酸H。本发明所 述的N-乙酰谷氨酸激酶突变体F91H NAGK的催化效率（108811^^?^1)相对于野生型（513mM 一 bin-〇提高了 2.12倍，并且在37°(：下的半衰期由野生型的3611延长到10011，是突变前的2.78 倍。本发明所得N-乙酰谷氨酸激酶突变体更有利于精氨酸的生产需求，为高效合成L-精氨 酸奠定了基础。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的问题是提供一种催化效率与热稳定性都提高的N-乙酰谷氨酸激 酶突变体。将来源于钝齿棒杆菌(〇^7116&3(^61'；[11111(^6仙1：111113￥?45-5)的1'|-乙酰谷氨酸激 酶第91位的苯丙氨酸F进行定点突变，将含突变后基因的重组质粒转化进入E.coli BL21进 行表达，蛋白纯化后得到催化效率与热稳定性显著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体。
[0007] 编码所述突变后N-乙酰谷氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示所示。
[0008]所述突变是将第91位的苯丙氨酸F位分别突变为组氨酸H。
[0009]获得所述突变体的方法，是以pET28a-argB质粒(一种高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌 SYPA5-5)为模版，设计引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变得到含有突变后基因的重组质 粒pET28a-argB F91H，将它们分别转化至E.coli BL21进行表达，获得突变体F91HNAGK。获得所 述突变体的方法，具体地是：
[0010] (1)突变表达载体的构建
[0011] 通过分析N-乙酰谷氨酸激酶的3D结构与同源序列的比对，确定91位的苯丙氨酸F 为目的突变为点，设计突变实验，将该位点苯丙氨酸F突变为组氨酸H。以pET28a-argB质粒 为模版，设计引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变得到的突变基因 argBF91HW及载体 pET28a分别用EcoRI与Sail核酸内切酶进行双酶切后于16°C连接;然后将连接产物直接转 化到E. col i JM109菌株，提取重组质粒进行测序。
[0012] (2)含突变体的基因工程菌的获得
[0013] 制备E.coli BL21(DE3)感受态，将测序正确的重组质粒pET28a-argBF9iH转化到感 受态E.coli BL21细胞中，筛选转化子。
[0014] (3)N_乙酰谷氨酸激酶活力测定
[0015] 酶活测定方法:3mL反应液中含595mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，20mmol/L N-乙酰谷 氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP二钠盐，149mmol/L NH20H'HCI及适量粗酶液。于37°C 反应lh后，加入lmL反应终止液（1.0mol/L HCI含5%FeCl3 · 6H20,4%三氯乙酸）终止反应。 离心，取上清测定N-乙酰谷氨酸氧肟酸的光吸收值A54〇。
[0016] 酶活力单位定义为1个国际单位(U)等于每分钟内生成Uimol产物N-乙酰谷氨酸氧 肟酸所需要的酶量。
[0017] (4)野生型和突变体的动力学参数与热稳定性的测定
[0018] 将重组E. coli BL21培养后破细胞，取上清即为粗酶液，将野生型和突变体经Ni柱 纯化后测定酶活力与蛋白浓度得到比酶活，通过改变底物N-乙酰谷氨酸(NAG)的浓度以及 运用双倒数法测得Km，Vm与Kcat的值，以及将野生型和突变体放置37°C水浴不同的时间得 到热稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0019]实施例1突变表达质粒的构建及重组E.coli BL21菌株的获得
[0020] 根据Corynebacterium crenatum SYPA5-5的argB基因序列，设计N-乙酰谷氨酸激 酶编码基因的两头引物，再根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变中间引物：
[0021 ]利用重叠延伸PCR体外扩增获得突变基因。
[0022] 用于定点突变的引物为：
[0023] PargB F:5，-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAG-3，（EcoRI)
[0024] PargB R:5，-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG-3，（SalI)
[0025] PargBF9iH Fm:5 '-GTTCAAGGGTGGTCACCGTGTGACCACTCCTG-3 '
[0026] PargBF9iH Fm:5 '-TCACACGGTGACCACCCTTGAACTCGCCCTGG-3 '
[0027] 提取钝齿棒杆菌杆菌SYPA5-5基因组为模板；
[0028] PCR反应条件:95 °C预变性5min，95 °C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，30个循 环;72°C延伸5min，。将所得突变基因片段与克隆载体pET-28a分别用EcoR I与Sal I核酸内 切酶进行双酶切，胶回收后将两者混合，加入T4连接酶，于16 °C过夜连接，转化至 E.coliJM109,经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子，进行双酶切验证，将重组质 粒命名为pET28a-argB F91H，并送至上海生物工程公司测序。
[0029] 将测序正确的重组质粒再转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组E.coli BL21菌株
[0030]实施例2突变体N-乙酰谷氨酸激酶的表达及Ni-NTA纯化
[0031]取冻管保藏的重组子接种至含卡那霉素（终浓度为50yg/mL)的LB培养基中，37°C 振荡培养过夜，按1 %接种量转接，37 °C培养至0D约0.6-0.8，加人IPTG至终浓度为lmmol/L， 16°C过夜诱导表达。将过夜诱导表达的菌液于10000r/min，4°C离心15min，收集菌体，用 Tris-HCI (pH8.0)缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，然后经0.45μπι滤膜过滤，选用表达载 体pET-28a中含有6Hi s-Tag，过Ni-NTA纯化NAGK，将获得纯的NAGK酶蛋白经SDS-PAGE分析， 检测到一条分子量约为36kDa的特异性条带，纯的NAGK酶用于蛋白浓度与酶活的测定，得到 比酶活。
[0032]实施例3野生型和突变体催化效率的比较
[0033] 将上一步得到的纯酶液进行酶促反应：酶促反应总体积为3mL，含595mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，20mmol/L N-乙酰谷氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP 二钠盐， 149mmol/LNH20H · HCI及适量粗酶液;于37°C反应lh后，加入lmL反应终止液（1.0mol/L HCI 含5%FeCl3 · 6H20,4%三氯乙酸)终止反应;离心，取上清测定N-乙酰谷氨酸氧肟酸的光吸 收值A54〇。通过改变底物N-乙酰谷氨酸(NAG)的浓度以及运用双倒数法测得Km，Vm与Kcat的 值。得到的结果如表1所示:N-乙酰谷氨酸激酶突变体F9 IHnagk的催化效率(Kcat/Km)由野生 型(CgNAGK)的SUnirVirr1提高到lOSSmiTVirT 1，提高了 2.12倍，因此突变体酶的催化效率 得到显著提高，更利于精氨酸的合成。
[0034]实施例4野生型和突变体的热稳定性比较
[0035] 为了测定野生酶和突变酶对温度的耐受性，将已经纯化的酶于37°C水浴不同的时 间后按上述方法测残余酶活力，考察其热稳定性。将未经37°C水浴的酶活设为100%，得到 酶的热稳定性曲线。结果如表1所示:N-乙酰谷氨酸激酶突变体F91Hnagk的热稳定性明显比 野生型（〇8财61〇的好，其在37°(：下的半衰期由野生型的3611延长到10011，是突变前的2.78 倍。因此具有更好热稳定性的突变体酶在发酵周期较长的精氨酸合成中更有利的。
[0036]本发明所述的突变体不仅催化效率相比突变之前有了显著的提高，即提高了 2.12 倍，而且热稳定性也得到显著提高，即在37°C的半衰期是突变前的2.78倍。结果表明，在关 键位点突变氨基酸，可以获得优于野生型的突变体，这种策略可以广泛应用于酶学性质的 改进。
[0037]表1野生型和突变体的动力学参数及其半衰期
【主权项】
1. 一种催化效率与热稳定性显著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，其特征在于，将钝 齿棒杆菌来源的的N-乙酰谷氨酸激酶第91位的苯丙氨酸F突变为组氨酸H。2. 权利要求1所述突变体的编码基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3. 权利要求1所述突变体的应用，其特征在于，将权利要求2所述的基因导入钝齿棒杆 菌中，用于改善精氨酸的合成效率;但不限于应用于改善精氨酸的合成。
【文档编号】C12N15/54GK105907735SQ201610286036
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】饶志明, 徐美娟, 张景景, 杨套伟, 张显, 葛小勋
【申请人】江南大学