用于免疫疗法的组合物和方法
【专利说明】用于免疫疗法的组合物和方法
[0001 ]优先权
[0002] 本申请要求2013年6月24日提交的美国临时申请No. 61/838,547和2014年3月6日 提交的美国临时申请No. 61 /948，916的权益和优先权，其在此通过引用整体并入。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于免疫疗法的组合物(包括药物组合物)及方法。
【背景技术】
[0004] 抗原呈递细胞（APC)是一种加工和呈现在其表面上与主要组织相容性复合物 (MHC)蛋白复合的抗原肽的细胞。效应细胞，诸如T细胞，可使用受体诸如T细胞受体(TCR)识 别这些肽-MHC (pMHC)复合物。
[0005] 树突细胞(DC)是一种抗原呈递细胞的实例，其可被刺激以有效呈递抗原并支持免 疫效应细胞扩增，从而激活对抗原的细胞毒反应。在一些免疫疗法中，DC是从患者收集到的 并用抗原脉冲或用病毒载体转染。在输回所述患者后，这些激活的细胞呈递肿瘤抗原至效 应淋巴细胞(如CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞）。如果适当进行，该疗法可起始针对表达抗原 (包括肿瘤抗原)细胞的细胞毒反应。
[0006] 然而，DC免疫疗法，如许多免疫疗法面临显著的限制。例如，接种的癌症患者中离 体可检测的强且抗原特异性T细胞反应与仅较弱的临床反应存在差异。JanikashviIi N等， Personalized dendritic cell-based tumor immunotherapy.Immunotherapy 2010年I月 I 日；2(1):57。
[0007] 仍然需要有效用于包括抗原特异性免疫疗法的免疫疗法的组合物(包括货架稳定 的药物组合物)和方法。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明提供用于免疫疗法的组合物和方法，其包括用于在患者中诱导抗原特异性 T细胞的货架稳定的药物组合物。此类组合物用于治疗例如，癌症和传染病。在一些方面，所 述组合物是人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包括在其表面上具有抗原呈递复合物和任选的T 细胞共刺激信号的药学上可接受的珠粒或颗粒，以向患者提供在适当的情况下呈递一种或 多种抗原(如，一种或多种肿瘤抗原）的分子复合物以激活抗原特异性T细胞。所述珠粒或颗 粒经设计提供药效动力学优势，包括循环特性、生物分布和降解动力学，以及活性。此类参 数包括尺寸、表面电荷、聚合物组成、配体缀合化学、配体密度等。
[0010]在一些实施方案中，T细胞共刺激信号是抗-CD28抗体或其部分，其可包含人重链 氨基酸序列，包括选自IgG、IgD、IgA或IgM同种型的序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白序 列包括人IgG恒定和可变序列。框架(FW)序列可经修饰含有重要或所需的鼠科框架残基以 维持一个或多个抗原结合位点的完整性。互补决定区（CDR)可基于鼠科抗体氨基酸序列 (如，9.3mAb)，或其它⑶28结合序列，其中许多是已知的。在一些实施方案中，所述抗体重链 是人IGHV4(如，IGHV4-59)种系FW的变体。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链且所述轻 链是人IGKV4-01FW的变体。所述抗体可包含恒定区，且所述恒定区可为人IgG4或其变体。 [0011]所述共刺激分子可缀合至具有抗原呈递分子复合物的固体支撑物，以诱导抗原特 异性T细胞。抗原呈递分子复合物可包括I类MHC和/或II类复合物，或其包含抗原结合槽的 部分。在一些实施方案中，所述分子复合物包含一个或多个HLA氨基酸序列（如，包含HLA的 胞外结构域或其抗原呈递部分），其可包含另外的序列，诸如免疫球蛋白序列，或其它二聚 化序列或稳定序列。在一些实施方案中，HLA-Ig二聚化融合物提供稳定性和/或结合亲和力 方面的优势。
[0012]因此，在一些实施方案中，本发明提供用于呈递抗原至T细胞的珠粒-或颗粒-缀合 的分子复合物，其中所述复合物包含形成I类或II类抗原结合槽的氨基酸序列或其部分。所 述抗原呈递复合物的氨基酸序列可包括与异源序列的融合物，以提供例如稳定性、亲和力 和空间优势。在一些实施方案中，所述异源序列包括免疫球蛋白序列。在一些实施方案中， 所述分子复合物包括融合至异源序列诸如免疫球蛋白序列的HLA(如，HLA-A2)氨基酸序列。 在一些实施方案中，所述免疫球蛋白包含人重链免疫球蛋白序列（如，IGVH4)，其可包括免 疫球蛋白恒定序列以提供二聚体HLA，和可任选地包含可变区序列。所述可变序列如果存在 可被任选地修饰以减少或消除潜在的抗原结合并且任选地无鼠科FW残基。所述HLA氨基酸 序列可为HLA-A*02:01 aMGT登记号HLA00005)或其衍生物。
[0013] T细胞共刺激配体和/或抗原呈递复合物（以及本文所述的其它配体，包括靶向配 体)可缀合至固体支撑物用于离体或体内抗原呈递和抗原特异性T细胞激活。在一些实施方 案中，所述固体支撑物是具有用于偶联配体的表面官能团的珠粒或颗粒(如，PLGA或PLGA-PEG颗粒）。所述颗粒经设计提供药效动力学优势，包括循环特性、生物分布和降解动力学以 及活性。此类参数包括尺寸、表面电荷、聚合物组成、配体缀合化学、配体密度等。
[0014] 在各个实施方案中，所述药物组合物可另外包含用于呈递至T细胞且可与配体缀 合的珠粒或颗粒共同配制的抗原肽。在各个实施方案中，所述药物组合物是货架稳定的，并 且可以在施用前复溶的冻干形式提供，或替代地以另一种施用给患者的便利形式(如，通过 肠胃外施用)提供。
[0015] 本文所述的药物组合物通过向有需要的患者施用有效量的组组合物用于免疫疗 法，例如，用于诱导抗原特异性细胞毒性T细胞形成的方法。具体而言，抗原呈递平台可用于 治疗传染病、癌症或自身免疫性疾病患者，或者向免疫抑制患者提供预防性保护。
[0016] 本发明还提供编码本文所述的氨基酸序列的多核苷酸，以及表达本文所述的氨基 酸序列的宿主细胞。
[0017]本发明通过以下非限制性实例进一步说明。
[0018] 本发明的细节示于以下随附的说明书和权利要求书中。尽管与本文所述那些方法 和材料类似的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但现在描述说明性方法和材料。 本发明的其它特征、目标和优势将通过说明书和权利要求书变得显而易见。除非上下文另 外明确说明，否则在说明书和随附权力要求书中，单数形式还包括复数形式。除非另外定 义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域普通技术人员通常所理 解相同的含义。
[0019] 附图简述
[0020] 图1-3显示了抗-⑶28的三条人源化可变重序列。
[0021]图4-6显示了抗-⑶28的三条人源化可变轻序列。
[0022]图7显示了经修饰的恒定重序列。
[0023] 图8显示了恒定κ轻序列。
[0024]图9显示了用于构建HLA融合物的人源化非⑶28-结合可变区。
[0025] 图10显示了人源化HLA-IgG4HC的氨基酸序列。
[0026]图11显示了轻链3 (LC3或Vk3 )的氨基酸序列。
[0027]图12显示了重链I(HCl)的氨基酸序列。
[0028]图13显示了重链2(HC2)的氨基酸序列。
[0029] 图14-16显示了用于在STABLEFAST-NSO细胞系中表达的表达构建体。
[0030] 图17显示了人源化抗-⑶28mAb不是超激动剂。
[0031]图18显示了人源化抗-CD28克隆特异性染色人T-细胞系上的⑶28。图18(A):用鼠 科抗-人〇)811^13(克隆9.3，同种型1862&)染色；图18(8) :用人源化抗-0028(同种型1864)染 色。
[0032] 发明详述
[0033]以下缩写可在全文中使用:BLAST-基本局部比对搜索工具，CDR-互补决定区，Ck-k 轻链恒定区，Fc-抗体片段可结晶区，Fw-(可变区的）框架区，HLA-人白细胞抗原，MHC-主要 组织相容性复合物，VH-可变重链，Vk-可变κ轻链及V区-抗体可变区，VH或Vk。
[0034]本发明提供用于免疫疗法的组合物和方法，其包括用于在患者中诱导抗原特异性 T细胞的货架稳定的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含二聚体HLA抗原呈递 复合物。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化免疫球蛋白序列或其部分，其可用作人 工抗原呈递细胞(aAPC)上配体的组分，以向患者提供二聚体分子复合物用于呈递一种或多 种抗原（如，一种或多种肿瘤抗原）和任选的一种或多种共刺激信号。如下更详述的抗原呈 递平台可基于人工固体支撑物，诸如药学上可接受的支撑物(包括胶乳或聚合物珠粒或颗 粒)。
[0035]在一些实施方案中，所述T细胞共刺激信号是抗-CD28抗体或其部分。在一些实施 方案中，所述抗-CD28抗体包含选自1861、1862、1863、1864、18〇、以4或181的至少一种人免 疫球蛋白同种型的序列。例如，所述抗-CD28抗体可为IgG同种型，并且可含有一种或多种 IgG种系框架序列的序列。例如，所述抗-CD28可含有人IGHV4重链氨基酸序列，其可被修饰 以具有一至十五个氨基酸修饰。所述修饰可包括鼠科框架残基以支持一个或多个抗原结合 位点的完整性。
[0036]在一些实施方案中，互补决定区（⑶R)基于鼠科抗体氨基酸序列，其可任意地包含 一至十个、诸如一至五个氨基酸修饰。在一些实施方案中，一个、两个、三个或多个⑶R基于 小鼠9.3mAb(Tan等.J.Exp.Med. 1993177:165)，其可公开获得。示例性CDR示于图1-6中。在 一些实施方案中，所述抗体具有全套的重链和/或全套的轻链⑶R(9.3mAb)。例如，在一些实 施方案中，所述重链可变区含有一个、两个或三个以下CDR，其可各自任选地被一个、两个或 三个氨基酸取代、缺失或添加修饰<01?1(0￥6￥!1)、001?2(￥1'^666了阶-41^3)和001?3 (DKGYSYYYSMDY)。在一些实施方案中，所述轻链可变区含有一个、两个或三个以下CDR，其各 自可被一个、两个或三个氨基酸取代、缺失或添加修饰：CDR1(RASESVEYYVTSLMQ)、CDR2 (AASNVES)和CDR3(QQSRKVPYT)。
[0037]可替代的CDR序列、可变区或CD28-结合配体可用于各种实施方案中。可替代的配 体和抗体描述于美国专利7,612,170、美国专利6,987,171和美国专利6,887,466中，例如， 并且这些公开内容在此通过引用整体并入。
[0038]在一些实施方案中，所述抗体重链包含人IGHV4-59种系框架(FW)的变体，其经修 饰包括5至15个鼠科FW残基。在一些实施方案中，所述抗体包含轻链氨基酸序列，并且所述 轻链序列可为人IGKV4-01FW序列的变体，并且其可经修饰包括3至15个鼠科FW残基。
[0039] 所述抗-CD28人重链序列可经修饰，例如，以在位置1、3、6、37、48、67、71、73、76、 78、82、82a和82c(基于Kabat编号）处包含一个或多个(如，2个或更多个、3个或更多个、4个 或更多个、5个或更多个或所有）鼠科Fw残基。在这些位置处的鼠科Fw残基可如9.3mAb中一 样。所述轻链可经修饰以在位置3、4、49、70、85、87和80包含一个或多个(如，2个或更多个、3 个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或所有）鼠科Fw残基。所选的鼠科Fw残基可支持抗 原-结合位点的完整性。人源化抗-CD28抗体维持对CD28的亲和力和9.3mAb的T细胞共刺激 活性，并且为至少40%、50%、75%、80%、90%，并且在一些实施方案中，与9.3mAb相比，对 于CD28结合100%或更有效。在各个实施方案中，所述抗-CD28mAb不是超激动剂。
[0040]所述抗体可包含恒定区并且所述恒定区可为任何同种型。在一些实施方案中，所 述抗体恒定区是人IgG4或其变体。在一些实施方案中，所述恒定区包含一个或多个铰链稳 定突变，其可被引入至CH链中（如，S241，其可被P取代）。在一些实施方案中，所述抗体包含 恒定区，并且所述恒定区包含一个或多个适于化学偶联所述抗体至固体支撑物的突变。所 述一个或多个适于偶联的突变可产生氨基酸侧链官能团（如，硫醇、胺或羟基），诸如未配对 的半胱氨酸（如，在S473处）。对恒定区的其它变化包括那些减少Fc γ受体结合的修饰。例 如，所述CH链可在L248处修饰，如，L248E。
[0041 ]在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段，诸如F(ab '）2或Fab，或者为单链抗体或 其它抗原-结合抗体片段。例如，所述抗体片段可为本文所述的人源化mAb或其它抗-CD28的 单链可变片段。
[0042] 在一些实施方案中，所述共刺激分子是单链可变片段(scFv)，其包含由抗CD28mAb 诸如本文所述的抗体的VH和VL链形成的抗原结合环，或基本上由由抗CD28mAb诸如本文所 述的抗体的VH和VL链形成的抗原结合环组成。scFv抗体构建体可包含通过短肽连接子以 头-头或头-尾构象连接在一起的一条或若干条(2、