被认为对重链和轻链的界面是重要的，并且也支持⑶R3构象 并因此保留在所有变体中。残基80被认为潜在具有对CDR 2和3的构象存在间接影响，并且 仅保留在VkI中。残基70通过与轻链残基R24形成盐桥，并因此对Vk结构域具有重要构象影 响。在抗-CD28中，该盐桥不存在（因为残基70是N而非D)，并引入该相互作用可以是不利的； 然而在鼠科中抗体N70被糖基化(NFS)，并且在人源化期间移除这个将是有益的；因此所述 鼠科N保留在Vk 1和Vk2中，但在Vk3中改变为D。
[0115] 基于人IgG4/K的恒定区序列经设计包含铰链稳定突变(S241P)和移除残余Fe γ受 体结合(L248E)的较低铰链中的突变。半胱氨酸残基还包含在Fe的C-端附近以用于化学偶 联目的（S473C)。经修饰的IgG4重链恒定区序列示于图7中，连同κ轻链恒定区序列（图8)。
[0116] 另外的VH结构域设计为潜在不结合至⑶28,并且该序列显示于图9中。对鼠科V区 序列的分析表明（从小鼠种系V区的体突变的程度说)所述VH可能是CD28结合的主要贡献 者。因此仅潜在非结合人源化VH变体经设计。该变体不含有任何小鼠 Fw残基以重构正确的 CDR构象，并且在⑶RH3中在可能对结合是重要的残基处还含有三个突变(Y100A、Y100aA、 YlOObA)〇
[0117] 实施例2:用于融合HLA_A*02:01至人源化抗体的连接子的设计
[0118] 将用于融合HLA-A*02:0iaMGT登记号HLA00005)至人源化抗-CD28抗体N-端的连 接子通过iTope?和TCED?构建并并入分析以去除潜在免疫原性。
[0119] iTope?软件预测了34个人MHC II类等位基因的开放式结合沟内肽的氨基酸侧链 与特异性结合袋之间的有利相互作用(特别是袋位置;？1^446^7和?9)。这些等位基因代 表全球存在的最常见的HLA-DR等位基因，而没有权重由于任何特定种族人群中最主要存在 的那些等位基因。二十个等位基因含有'开放'pi构型，并且十四个含有'闭合'构型，其中位 置83处的甘氨酸被缬氨酸替代。关键结合残基的位置经由电脑模拟产生重叠横跨测试蛋白 质序列的一个氨基酸的9聚体肽获得。与物理MHC II类结合实验的比较已显示iTope?可用 于以高精度成功区别结合与不结合MHC II类分子的肽。经由电脑模拟产生的MHC II类结合 分析的任何限制使用TCED?减少，所述TCED?含有来源于之前在EpiScreen?离体T细胞表位 作图测定中筛选的序列的大数据库肽(>1〇,〇〇〇条肽)序列。因此TCED?可用于针对不相关的 抗体和蛋白序列搜索任何测试序列，以寻找与实际离体免疫原性的相关性。
[0120] 使用iTope?对连接子序列分析是用横跨连接子序列的重叠9聚体进行的，针对34 个MHC II类等位基因的每一个测试所述重叠9聚体。基于潜在'命中'和与MHC II类分子的 相互作用对每个9聚体评分。通过所述软件计算的所述肽得分在0至1之间。将产生高平均结 合得分(在iTope?评分函数中>0.55)的非种系肽突出显示，并且如果2 50%的MHC II类结 合肽（即34个等位基因中的17个)具有高结合亲和力(得分>0.6)，则此类肽被定义为"混杂 高亲和力"MHC II类结合肽(其被认为对于含有CD4+T细胞表位是高风险的）。其中2 50%的 MHC II类结合肽(得分>0.55(但而非大部分>0.6))的肽被定义为"混杂中等亲和力"MHC II 类结合肽。对所述序列的进一步分析使用TCED?进行。所述序列用于通过BLAST搜索询问 TCED?以鉴定在之前EpiScreen?研究中刺激T细胞响应的不相关蛋白的肽(T细胞表位)之 间的任何高序列同一性。
[0121] 由Schneck等使用的序列包含两个连接子，一个在HLA-A*02:01的N-端处以与N-端 信号序列连接，和一个在C-端用于融合至抗-CD28VH结构域(参见例如图9)。对于N-端连接 子，从信号序列切割位点至连接子分析序列，并且所述序列包括HLA-A*02:01成熟蛋白的前 8个氨基酸。对于C-端连接子，从HLA-A*02:01a3结构域的末端8个氨基酸至连接子序列和 抗-CD28VH结构域的多达前8个氨基酸分析序列。
[0122] 结合得分>0.6(高亲和力）的肽结合至大部分的U 17)MHC II类等位基因（定义为 混杂高亲和力粘合剂）。结合得分在0.55与0.6之间的中等亲和力粘合剂结合2 17MHC II类 等位基因。发现N-端连接子含有两条混杂MHC II类结合序列，一条高亲和力（在位置2处有 Pl锚)和一条中等亲和力(在位置4处有pi锚）。发现所述C-端连接子含有一条在位置11处具 有Pl锚的混杂中等亲和力MHC II类结合肽。
[0123] BLAST搜索表位的T细胞表位数据库(TCEDtm)使用如iTope?分析中所用相同的序 列进行，以确定与之前鉴定的表位的任何同源性。所述TCED?用于针对大型（>10,000条肽） 数据库的肽搜索任何测试序列，所述肽来源于已在EpiScreerTT细胞表位作图测定中测试 的不相关的序列。发现所述连接子序列没有一条在TCED?中含有任何'命中'。
[0124] iTope?进一步用于评估连接子序列变化以降低其对结合至II类MHC的倾向。应注 意可完全去除N-端连接子使得HLA-A*02:01的N-端直接融合至pBFKsr载体中提供的信号序 列或其天然信号序列。这将确保所述融合蛋白的N-端将仅含有人种系序列并避免T细胞表 位风险。发现下文推荐的连接子序列可减少MHC II类结合至本地残余水平(〈5个由任何9聚 体结合的等位基因），并提供适于克隆的限制位点(尽管两个序列将需要对载体修饰）： [0125] N-端连接子：
[0129] 实施例3:序列和表达克隆的密码子优化
[0130] 使用GeneOptimizerC珍优化密码子，并且如下所示克隆经优化的序列用于表达。
[0131] 将序列工程化为具有PmeI限制位点、Kozak序列和信号肽以用于在NSO细胞中表 达。翻译立即起始于Kozak序列的下游。
[0132] HLA-IgG4HC融合物的完全非翻译氨基酸序列示于图10中。
[0133] LC3(VK3)的非翻译序列示于图11中。
[0134] HCl的非翻译序列示于图12中。
[0135] HC2的非翻译序列示于图13中。
[0136] 还表达了人β2微球蛋白。
[0137] 实施例4:在NSO细胞中表达
[0138] 基于Biacore亲和力数据和其它考虑，HC1: :LC3和HC2: :LC3重链和轻链组合分别 被选为第一和第二mAb候选物，以用于StableFast-NSO细胞系开发。
[0139] 用于STABLEFAST-NSO细胞系产生的pBFksr: :HC1: :LC3双顺反子表达载体的最终 载体图描述于图14中。pBFksr: :HC2: :LC3的构建使用相同的方法进行。
[0140] 亲代NSO细胞在补充无血清生长培养基中扩增。在建立健康培养物后，一千万个细 胞（10 X IO6)用45yg线性（APvuI)表达载体DNA转染。使细胞在生长培养基中大量恢复24小 时。在恢复后，将细胞在补充无血清选择培养基(胆固醇_)中洗涤，重新悬浮于选择性培养 基中并以每孔200yL分布至40 X 96-孔板。对于HCl: : LC3和HC2: : LC3，实际分布分别为1140 个细胞/孔和840个细胞/孔。将板在37°C、5 % C02下孵育1周，并以补充有选择培养基的酚红 补料。在转染后两周，基于培养基颜色从红色变化为黄色，活跃地使多个孔生长。
[0141] 通过ELISA筛选来自HCl: :LC3转染的总共I，127个孔的人IgG表达。筛选来自HC2:: LC3转染的总共612个孔。基于IgG浓度，对于HCl: : LC3和HC2: : LC3，分别将总共290个和101 个细胞系放大到24-孔板。24小时产率测定用于选择最佳表达者以用于进一步分析。简而言 之，将24-孔板以5 X IO5个细胞接种在500yL新鲜培养基中。24小时后，上清液通过ELISA筛 选。基于IgG浓度，对于HCl: : LC3和HC2: : LC3，分别将总共60和24个细胞系放大到6孔板。
[0142] 3-天特异性产率测定用于选择最佳表达者以用于进一步分析。简而言之，将6-孔 板以4 X 105个细胞接种在1.5mL新鲜培养基中。在3天后，对细胞计数，并且通过ELISA筛选 上清液。基于IgG浓度和生长，可计算以pg/细胞/天计的平均特定产率或SPR。基于相对SPR， 对于HCl: :LC3和HC2: :LC3,分别总共20和10个细胞系放大到T-75烧瓶。以T-75规模重复3天 SPR测定以选择最终细胞系用于悬浮液适应，并放大用于mAb生产。
[0143] 将针对每个mAb的五个细胞系放大至30-mL振动培养基并重新评估SPR和生长。保 存(banked)所有悬浮物系。对于每个mAb表现最佳的细胞系经放大至转瓶培养基用于小规 模生产。
[0144] 对于HLA-IgG4融合蛋白，构建pBFksr: :HLA-IgG4: :LC3双顺反子表达载体以用于 STABLEFAST-NSO细胞系产生。载体图示于图15中。还为三顺反子表达载体创建了含有人β2 微球蛋白基因的表达盒和载体，所述三顺反子表达载体编码所有三种融合蛋白亚基（人 HLA-IgG4重链融合物、a-⑶28轻链[LC3]和人β2微球蛋白）。三顺反子构建体示于图16中。所 有三个基因的表达在短暂ΗΕΚ293培养物中通过上清液的ELISA和蛋白质印迹分析确认。
[0145] 实施例5:功能表征
[0146] 测试针对CD28的人源化单克隆抗体诱导刚分离的PBMC在mAb涂覆板上扩增的能 力。如图17所示，人源化抗-CD28不是超激动剂。
[0147] 测试人源化单克隆抗体在人T-细胞系上染色CD28的能力。结果示于图18中。图18 (A)显示了用鼠科抗-人⑶SmAb(克隆9.3,同种型IgG2a)染色。黑色=未染色的细胞，红色= 抗-IgG2a FITC，蓝色=抗-CD28+抗-IgG2a FITC。图18(B)显示了用人源化抗-CD28(同种型 IgG4)染色。黑色=未染色的细胞，红色=抗-IgG4PE、蓝色=抗-CD28(35ng)+抗-IgG4PE、紫 色=抗⑶28( Iyg)+抗-IgG4PE。用人源化抗-⑶28染色可用克隆9.3mAb(未显示)阻断。
[0148] 在纯化HLA-Ig之后，抗原肽装载效率通过使用构象依赖性抗-HLA mAb的ELISA检 查，以捕获肽装载的蛋白（如Immunology 17.2章中当前方案所述）。与非特异性肽(即MHC错 误匹配)的0%相比，预期特异性肽的可再生装载效率(即正确的MHC限制)为~90%。
[0149] 通过引用并入
[0150] 本文参考的所有专利和公开物在此通过引用整体并入。
【主权项】
1. 一种药物组合物，其包含： 尺寸在约100至200nm范围内、表面电荷为约0至-20mV及每个颗粒有约100至1500个蛋 白质配体的聚合物PLGA-PEG颗粒，所述蛋白质配体通过硫氢基-马来酰亚胺化学任选地偶 联； 抗-CD28抗体配体群体； HLA配体群体； 一种或多种用于呈递至T细胞的抗原肽;及 用于静脉内、动脉内、皮下、真皮内、淋巴管内或肿瘤内施用的药学上可接受的载体。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述颗粒基本上是球形或近似球形。3. 根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述PLGA是约50%乳酸(LA)和50%羟基 乙酸(GA)的聚合物。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述PLGA聚合物的分子量为约 25K至约35K，并且所述PEG的分子量为约3K至约10K。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其每个颗粒具有400至1000个配体。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述抗-CD28抗体配体包含任 选具有5至15个鼠科框架残基的人IGHV4-59种系框架和任选具有3至15个鼠科框架残基的 IGKV4-01种系框架。7. 根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述抗-CD28配体是抗原-结合 抗体片段。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述抗-⑶28配体包含scFv。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述HLA配体是二聚体。10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述HLA是HLA-A*02:01。11. 根据权利要求9或10所述的药物组合物，其中所述HLA包含免疫球蛋白融合物。12. 根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述抗-CD28抗体配体和所述HLA-A*02: 01免疫球蛋白融合物具有在S241和L248处有突变且在密码子473处有半胱氨酸的IgG4恒定 区。13. 根据权利要求12所述的药物组合物，其中所