连接蛋白。配 体，诸如所述抗原呈递复合物和共刺激分子可经氨基酸取代修饰以允许化学缀合。
[0080] 相同固体支撑物上具体蛋白的比率可变化以提高固体支撑物在抗原或抗体呈递 中的有效性。例如，抗原呈递复合物与抗-⑶28的比率可为至少约30:1、或至少约10:1、约3: 1、约1:1、约0.3:1;约0.1:1，和至少约0.03:1。在一些实施方案中，所述比率为约5:1、约4: 1、约3: 1、约2:1、或约1:1、约1: 2、约1: 3、约1:4或约1: 5。偶联至所述支撑物的蛋白的总量可 为至少l〇mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少 100mg/ml、至少 150mg/ml或大于200mg/ ml。在一些实施方案中，诸如那些采用具有表面官能团（如，马来酰亚胺或酯）的PLGA或 PLGA-PEG颗粒，偶联至所述颗粒的蛋白总量可为1至10yg/mg的PLGA，或在一些实施方案中， 2至6yg/mg PLGA。在一些实施方案中，所述颗粒的配体密度为约IO3至约IO5个配体/μπι2,或 在一些实施方案中约IO 4个配体/ym2。例如，对于尺寸在100至200nm范围内的纳米颗粒，所述 纳米颗粒平均具有约100至约1500个配体，诸如约200至约1200个配体，或约400至约1000个 配体，或约500至约800个配体。
[0081 ]在各个实施方案中，本发明提供包含聚合物珠粒或颗粒、如本文所述的抗-CD28抗 体，和/或抗原呈递复合物诸如如本文所述的人源化Ig HLA融合复合物的药物组合物。所述 药物组合物可另外包含用于呈递至如所述的T细胞且可与缀合珠粒或颗粒共配制的抗原 肽。在各个实施方案中，所述药物组合物是货架稳定的，并且在一些实施方案中，以用于在 施用前复溶的冻干形式提供，或以另一种"现成"药物制剂提供。
[0082] 在一些实施方案中，本发明提供包含直径或平均直径为50至500nm的基于PLGA或 PLGA-PEG的纳米颗粒和包含表面-缀合的抗-CD28抗体和抗原呈递复合物的药物组合物。所 述抗-CD28抗体可为人源化抗体，如如本文所述的人源化抗体，并且可为抗体片段诸如单链 可变片段。在一些实施方案中，所述抗原呈递复合物包含至少一个HLA抗原-结合槽。所述 抗-CD28和HLA复合物可在相同反应中分别或一起偶联至所述颗粒。所述药物组合物可包含 至少一种肽抗原，诸如肿瘤抗原(如，MART-1)，并且其可与所述颗粒在无任何活性装载工艺 的情况下共配制。
[0083] 本文所述的药物组合物可通过向有需要的患者施用有效量的组合物用于免疫疗 法，例如用于诱导抗原特异性细胞毒性T细胞形成的方法中。在一些实施方案中，所述患者 是癌症患者。
[0084] 本文所述的基于颗粒的抗原呈递平台可通过任何适当途径施用给患者，包括静脉 内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴管内施用和肿瘤内施用。患者包括人和兽医 学患者。
[0085] 本发明的一些示例性实施方案描述如下。
[0086]在一些实施方案中，本发明提供包含聚合物PLGA-PEG颗粒的药物组合物，所述聚 合物PLGA-PEG颗粒的尺寸在约100至200nm范围内、表面电荷为约-0至-20mV(和在一些实施 方案中-5至-15mV)，和每个颗粒有约100至1500个蛋白质配体。在一些实施方案中，所述蛋 白质配体各自通过硫氢基-马来酰亚胺化学偶联至所述颗粒。所述配体包括抗-CD28抗体配 体群体和HLA配体群体及一种或多种用于呈递至T细胞的抗原肽。所述组合物包含用于静脉 内、动脉内、皮下、真皮内、淋巴管内或肿瘤内施用的药学上可接受的载体。
[0087]在一些实施方案中，所述颗粒基本上是球形或近似球形的。
[0088] 在一些实施方案中，所述PLGA是约50%乳酸(LA)和50%羟基乙酸(GA)的聚合物。 [0089] 在一些实施方案中，所述PLGA聚合物的分子量为约30K，并且所述PEG的分子量为 约3K至约10K，诸如约5K。
[0090] 在一些实施方案中，所述组合物具有每个颗粒400至1000个配体。
[0091 ]在一些实施方案中，所述抗-⑶28抗体配体包含任选具有5至15个鼠科框架残基的 人IGHV4-59种系框架，和任选具有3至15个鼠科框架残基的IGKV4-01种系框架。
[0092] 在一些实施方案中，所述抗-⑶28是ScFv。
[0093] 在一些实施方案中，所述HLA是HLA-A*02:01，其可包含与铰链区上方的免疫球蛋 白序列的融合物，足以提供二聚体HLA构建体。
[0094] 在一些实施方案中，所述组合物是经冻干的。
[0095] 具体而言，抗原呈递平台可用于治疗传染病、癌症或自身免疫性疾病患者，或向免 疫抑制患者提供预防性保护。
[0096] 可治疗的传染病包括那些由细菌、病毒、朊病毒、真菌、寄生虫、蠕虫等引起的传染 病。此类疾病包括AIDS、肝炎、CMV感染和移植后淋巴增生性疾病(PTLD) tXMV,例如，是器官 移植患者中存在的最常见的病毒病原体，并且是经历骨髓或外周血液干细胞移植的患者中 发病率和死亡率的主要起因 （Zaia ,Hematol · Oncol · Clin .North Am. 4,603-23，1990)。这是 由于这些患者免疫受损的状况，这使得血清反应阳性患者中的潜伏性病毒重新激活或血清 反应阴性个体机会性感染。当前治疗集中于使用抗病毒化合物诸如更昔洛韦，其具有缺点， 其中最显著的是出现耐药性CMV。这些治疗的一种有用的替代者是预防性免疫治疗方案，其 包括在启动移植程序之前产生来源于患者或适当供体的病毒特异性CTL。
[0097] PTLD发生在大比例的移植患者中，并由Epstein-Barr病毒(EBV)感染导致。EBV感 染据信存在于约90%的美国成人群体中（Anagnostopoulos&Hummel ,Histopathology 29， 291-2)15,1996)。活跃的病毒复制和感染被免疫系统阻止，但是如在CMV的情况下，由于移 植疗法而免疫受损的个体丧失控制T细胞类群，这使得病毒重新激活。这代表了对移植方案 的严重妨碍。EBV还可参与多种血液学癌症和非血液学癌症中的肿瘤促进。在EBV与鼻咽癌 癌之间还存在强相关性。因此，使用EBV-特异性T细胞预防性治疗为当前疗法提供了优良的 替代方法。
[0098] 可根据本发明肿瘤的癌症包括黑素瘤，癌如结肠癌、头颈癌、十二指肠癌、前列腺 癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、导管癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌、胃癌、发育异常 的口腔粘膜癌、息肉癌、侵入性口腔癌、非小细胞性肺癌、过渡和鳞状细胞泌尿癌等;神经恶 性肿瘤，如神经母细胞瘤、神经胶质瘤等;血液学恶性肿瘤，如慢性骨髓性白血病、儿童急性 白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、恶性皮肤T细胞、蕈样霉菌病、非MF皮 肤T-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、富T细胞皮肤淋巴性增生、大疱性类天疱疮、盘状红斑狼 疮、扁平苔癣等；等。参见，如，Mackensen等，Int · J. Cancer 86，385-92，2000; Jonuleit等， Int.J.Cancer 93,243-51,2001;Lan等，J.Immunotherapy 24,66-78,2001;Meidenbauer 等，J.Immunol.170(4)，2161-69,2003。
[0099] 在一些实施方案中，本发明提供通过施用本文所述的药物组合物以激活具有抗-肿瘤活性的T细胞来治疗癌症(包括以上鉴定的那些癌症)的方法。在一些实施方案中，所述 疗法与一种或多种免疫检查点抑制剂诸如纳武单抗(附￥〇11111^13)、？61]1131'〇112111]^13和伊匹单 抗(IpiIimumab) -起提供。在一些实施方案中，另外的疗法是抗-CTLA4或抗-PDl或抗-PD-Ll。另外的疗法或检查点抑制可通过其常规方案分别施用，或可作为本文所述的纳米颗粒 或连接至单独类群的纳米颗粒的另外配体施用。在一些实施方案中，一种或多种免疫检查 点抑制剂提供为起始疗法，和使用随后开始的本文所述的纳米颗粒的疗法，例如在约1至约 8周的检查点抑制疗法后或在约2至约4周的检查点抑制疗法后。在一些实施方案中，一种或 多种检查点抑制剂与纳米颗粒疗法同时提供，例如在疗法开始时和约每两周，或在疗法开 始时和约每两周进行一种或多种检查点抑制剂及约每四周进行纳米颗粒疗法。在一些实施 方案中，所述患者对检查点抑制疗法耐受，或者仅显示了对检查点抑制疗法的部分或短暂 响应，并且本文所述的aAPC增强这些患者中的肿瘤消退。在另一些实施方案中，对于通常对 检查点抑制疗法耐受的癌症，本文所述的组合物扩大了成功使用针对此类癌症的检查点抑 制剂。
[0100] 在一些实施方案中，所述肽抗原是基于患者的个性化基础、基于对患者肿瘤的分 析选择的。例如，可使用Ionov Y.，A high throughput method for identifying personalized tumor-associated antigens ,Oncotarget I (2): 148-155(2010)(其在此通 过引用并入)所述的方法，或其它方法。在这些实施方案中，可提供所述纳米颗粒(基于"现 成"），并且基于个性化基础选择和装载肿瘤抗原。
[0101] 可治疗的自身免疫性疾病包括哮喘、全身性红斑狼疮、风湿性关节炎、I型糖尿病、 多发性硬化、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、银肩病、重症肌无力、古德帕 斯彻氏综合症、格雷夫斯氏病、寻常性天疱疮、爱迪生氏病、疱疹样皮炎、乳糜泻和桥本氏甲 状腺炎。
[0102] 抗原特异性辅助T细胞可用于激活巨噬细胞或激活B细胞以产生可用于例如治疗 传染病和癌症的特异性抗体。产生抗体的B细胞本身还可用于该目的。
[0103] 本发明还提供编码本文所述的氨基酸序列的多核苷酸以及表达本文所述的氨基 酸序列的宿主细胞。
[0104] 本发明通过以下非限制性实例进一步说明。 实施例
[0105] 实施例1:种系人源化可变区和人恒定区序列的设计
[0106] 该实施例尤其表明来自小鼠抗-CD28抗体模板的种系人源化(接枝的CDR)抗体的 序列设计;人恒定区序列(包括含有S241P(Kabat编号)铰链稳定突变、L248E(Kabat编号）突 变以去除残余Fc γ受体结合、及适于偶联抗体的Cys残基（S473C,Kabat编号）的人IgG4)的 设计;潜在不结合至CD28的变体种系人源化抗体V结构域的设计;融合HLA-A*02:01至种系 人源化抗体的不含有潜在T细胞表位的N-端的连接子序列的设计。
[0107] 起始抗-CD28抗体是鼠科9 · 3单克隆抗体(Tan等· J·Exp .Med· 1993177:165)。9 · 3抗 体V区的结构模型使用Swiss PDB产生，并分析以鉴别V区中可能对抗体结合性质必需的氨 基酸。CDR内含有的所有残基(使用Kabat和Chothia定义)连同多个框架残基被认为对于结 合具有潜在的重要性。抗-⑶28的VH和Vk序列含有典型的框架(Fw)残基，并且⑶R 1、2和3基 序与许多鼠科抗体相当。
[0108] 对于人源化，人IGHV4-59种系Fw被选为重链的模板（参考由Tan等J. Immunol 2002169:1119-1125选择的IGHV3/0R16-10)<JGKV4-01种系Fw被选为轻链的模板。这些Fw都 与其对应的鼠科VH和Vk序列具有62 %同源性。将所述鼠科⑶R接枝至这些Fw中，并且还纳入 不同数量的鼠科Fw残基以产生三种人源化VH变体和三种人源化Vk变体(图1 -6)。
[0109] 对于重链Fw，Fwl残基1和3被认为对于抗原结合较重要，因为它们与结合袋相邻， 而残基6被认为影响β链支持残基1和3的构象及CDR3的构象。因此这些鼠科Fw残基保留在所 有变体中。
[0110]在Fw2中，残基37被认为对于维持VH与Vk之间的界面是重要的，而残基48被认为支 持CDR2的构象;因此这两个残基都保留在所有变体中。
[0111] 在Fw3中，残基73、76和78直接接触⑶Rl，而残基71接触⑶Rl和⑶R2两者；因此，这 些残基可能为抗原结合所需（取决于CDRl和CDR2的贡献），并因此保留在所有变体中。残基 71可有时通过影响残基71至78的构象而间接影响⑶Rl的构象，而残基82a和82c还可间接影 响⑶R2的构象。这些残基因此仅保留在VHl中。残基67和82在三维结构中相邻，并且相互作 用以填充可影响⑶R2的构象并潜在影响支持⑶R 1和3的β链的空间。因此这些残基保留在 变体VHl和VH2中。
[0112] 对于轻链Fw，Fwl残基3与结合袋相邻，并可直接参与抗原结合，而残基4直接支持 ⑶R3的构象。因此，这些鼠科Fw残基保留在所有变体中。
[0113] 在Fw2中，残基49支持⑶R2的构象，并且对于重链与轻链之间界面也是重要的，其 中其直接支持重链⑶R3的构象，因此保留在所有变体中。
[0114] 在Fw3中，残基85和87