用于癌症疗法的脂质体奥沙利铂组合物的制作方法
【专利说明】用于癌症疗法的脂质体奥沙利铂组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月13日提交的美国临时申请序列号61/780,000的优先权权 益，其内容通过引用整体并入本文。
[0003] 关于在联邦政府资助的研究和开发下作出的发明的权利声明
[0004] 不适用
[0005] 以光盘提交的"序列表"、表格或计算机程序列表附录的引用
[0006] 不适用
[0007] 发明背景
[0008] 基于铂的药物(或"铂类"）是有效的抗癌药物，其形成阻断癌细胞中DNA和RNA合成 的DNA加合物并诱导细胞凋亡。顺铂、卡铂和奥沙利铂是用于治疗多种实体瘤，包括卵巢癌、 肺癌、结肠直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、胃癌、黑色素瘤和头颈癌的主要铂类。然而，铂类的主要 缺点是毒性。常见的副作用包括肾和神经损伤、高端听力损失、持久恶心和呕吐。尤其是，顺 铂在血液中具有非常短的半衰期，由于药物通过肾排泄而导致急性肾毒性。
[0009] 奥沙利铂是具有1，2_二氨基环己烷(DACH)载体配体的基于铂的化疗剂。奥沙利铂 不同于顺铂之处在于顺铂的胺基团被二氨基环己烷(DACH)取代且两个氯化物被双齿草酸 盐部分取代。奥沙利铂的分子量为397.3g/mol。奥沙利铂（I)和顺铂(II)的化学结构如下所 不。
[0011] 已显示奥沙利铂在体外和体内对多种肿瘤细胞系均有效。尽管奥沙利铂的作用机 理尚未完全阐明，但已显示由奥沙利铂的生物转化所产生的水(aqua)衍生物与DNA相互作 用形成链间和链内交联，造成DNA合成破坏，从而导致细胞毒性和抗肿瘤作用(Raymond等人 Annals of Oncology.9:1053-1071.1998)。据认为，活化的奥沙利铂所保留的庞大DACH环 导致形成铂-DNA加合物，其似乎更有效地阻断DNA复制且比由顺铂形成的加合物更具细胞 毒性。奥沙利铂在治疗对顺铂或卡铂的一线治疗表现出抗性的癌症中是特别重要的 (Boulikas&Vougiouka.Oncology Reports · 10:1663-1682· 2003)。与顺钼相反，未观察到肾 毒性，并且在其给药过程中不需要水化。很少观察到肾小管坏死。研究还证实了与许多其他 化合物的加和和/或协同作用，表明了奥沙利铂在组合疗法中例如在体外和体内与氟尿嘧 啶组合中的可能用途。（Ibrahim，A.等人The Oncologist · 9:8-12 · 2004)。
[0012] 不同于顺铂，由于草酸盐基团的取代，血浆中的奥沙利铂迅速经非酶促转化成反 应性化合物，这一过程使其药代动力学曲线(profile)复杂化。大多数化合物似乎是无药理 学活性的，但二氯(DACH)钼络合物进入细胞，在那里它们具有细胞毒性特性。尽管奥沙利铂 在体外和体内已经显示出广泛的抗肿瘤作用以及比顺铂更好的安全性曲线，但主要的不良 反应是神经毒性及血液和胃肠(GI)毒性（Ibrahim等人）。
[0013] 脂质体已用作铂类的传送载体以试图减少药物的毒性。脂质体是包括分离外部和 内部水相的磷脂双层的囊泡。脂质体能够在脂质双层中运载疏水性药物和/或在水性核心 中运载亲水性药物以用于药物递送。脂质体尺寸通常在直径为50至250nm的范围内，其中50 至150nm的直径特别优选用于某些应用。脂质体铂类(包括奥沙利铂）的使用已呈现出巨大 的挑战。与游离药物相比，脂质体铂类证实有分布、代谢和从体内排泄的独特模式，以及不 同的毒性水平和独特的副作用。特别地，优化脂质体铂类的释放速率在体内半衰期与释放 之间或在安全性与效力之间难以维持平衡。通常，泄漏的脂质体将使包封的药物更容易获 得，但会造成与天然药物类似的更大的毒性风险。另一方面，较少泄漏的脂质体可以减少毒 性，但它们不能为足够的效力提供充足的药物释放。这种挑战反映在空间上稳定的脂质体 顺铂（SP I -7 7 )在I I期临床研究试验中的有限体内效力中（Feng等人Canc er Chemother·Pharmacol·54:441-448·2004)。
[0014] 因此，希望开发于现有的脂质体和非脂质体铂疗法相比具有改善性质的脂质体奥 沙利铂。存在平衡效力和安全性并改善奥沙利铂对靶向癌细胞的生物利用度的制剂的需 求。本发明解决了这些和其他需求。
[0015] 发明概述
[0016] 在一个方面，本发明提供用于治疗癌症的组合物。该组合物包括：（a)基本上由50-70mol %的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物、25-45mol %的胆固醇和2-8mol %的 PEG-脂质组成的两性离子脂质体;和(b)奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的 比例为约20:1至约65:1的量包封在脂质体中。
[0017] 在第二方面，本发明提供治疗癌症的方法。该方法包括向需要其的受试者给予本 发明的组合物。
【附图说明】
[0018] 图1显示奥沙利铂从具有不同脂质含量的脂质体中的体外释放。
[0019]图2显示在pH=7.4和pH=5,顺铂从含有二硬脂酰磷脂酰胆碱(A)或棕榈酰油酰磷 脂酰胆碱(B、C)的脂质体中的体外释放。
[0020]图3显示在pH=7.4和pH=5,奥沙利铂从含有棕榈酰油酰磷脂酰胆碱的脂质体中 的体外释放。
[0021 ] 图4显示在I?S(pH7.4和5)和FBS中，奥沙利铂从P0PC/Chol/DSPE-PEG2000脂质体 中的释放速率。
[0022] 图5显示在P0PC/Chol/DSPE-PEG2000脂质体中％奥沙利释放与摩尔％胆固醇的相 关性。
[0023] 图6显示在P0PC/CH0L/DSPE-PEG2000脂质体中IC5Q与摩尔％胆固醇的相关性。 [0024] 图7显示在P0PC/Chol/DSPE-PEG2000脂质体中IC5q与奥沙利铂释放速率的相关性。 [0025]图8显示脂质体奥沙利铂（脂质体奥沙利铂5a)以40和60mg/kg、游离奥沙利铂以 15mg/kg (MTD)或盐水(对照)单次静脉内给药后测量的平均KB肿瘤体积。与给药后第27天的 奥沙利铂(#，P〈〇.05)和给药后第31天的对照(*，P〈0.05)相比，测试的两种剂量的脂质体奥 沙利钼5a均显著抑制肿瘤生长。单向ANOVA后进行Neuman-Keul s事后检验。5-10只小鼠/组 的值为平均值土 SEM。
[0026] 图9显示经脂质体奥沙利铂5a(P0PC 65: 30: 5)、奥沙利铂或盐水处理的具有KB异 种移植瘤的裸小鼠的Kap Ian-Me i er存活曲线。
[0027]图10显示在具有HT29人结肠直肠癌异种移植物的小鼠中，与乐沙定(Eloxatin，奥 沙利铂)相比，脂质体奥沙利铂5a的抗肿瘤作用。脂质体奥沙利铂5a以22mg/kg/剂量、游离 奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次(three weekly)后测量 平均肿瘤体积。5-10只小鼠/组的值为平均值±SEM。
[0028]图11显示脂质体奥沙利铂5a以22mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量 (MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次后，具有HT29结肠直肠异种移植瘤的无胸腺裸小 鼠的体重变化。5-10只小鼠/组的值为平均值土 SEM。
[0029] 图12显示Kaplan-Meier曲线，其显示经脂质体奥沙利钼5a以22mg/kg/剂量、游离 奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次处理的具有HT29结肠直 肠异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的存活百分数。与乐沙定和盐水相比，脂质体奥沙利铂5a显 著增加存活率，P〈0.05，Mantel-C 〇X，l〇g-rank检验。各组以10只具有肿瘤的雌性小鼠开始。
[0030]图13显示在研究II具有HT29人结肠直肠异种移植物的小鼠中，与乐沙定相比，月旨 质体奥沙利钼5 a的抗肿瘤作用。用脂质体奥沙利钼5a以15、2 5、3 5mg/kg/剂量、游离奥沙利 铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次，测量平均肿瘤体积。与初始给 药后30天乐沙定或盐水处理相比，脂质体奥沙利铂5a处理显著抑制肿瘤生长，p〈0.05,单向 ANOVA ,Newman-Keuls事后检验。5-10只小鼠/组的值为平均值土 SEM。
[0031 ]图14显示用脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/ 剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次的具有HT29结肠直肠异种移植瘤的无胸腺裸 小鼠的体重变化。5-10只小鼠/组的值为平均值土 SEM。
[0032] 图15显示Kaplan-Meier曲线，其显示经脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂 量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水（对照）静脉内给药每周三次处理的具有 HT29结肠直肠异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的存活百分数。各组以10只具有肿瘤的雌性小鼠 开始。
[0033]图16显示无胸腺裸小鼠用乐沙定和脂质体奥沙利铂5a给药后随时间推移的肿瘤 铂水平。所有剂量均以奥沙利铂摩尔当量给予。数据表示为三只小鼠的平均值±标准误差。 [0034]图17显示无胸腺裸小鼠用乐沙定和脂质体奥沙利铂5a给药后随时间推移的血浆 铂水平。所有剂量均以奥沙利铂摩尔当量给予。数据表示为三只小鼠的平均值±标准误差。 [0035]图18显示在具有BxPC-3人胰腺异种移植物的小鼠中，与乐沙定相比，脂质体奥沙 利钼5 a的抗肿瘤作用。用脂质体奥沙利钼5 a以15、2 5、3 5mg/kg/剂量、游离奥沙利钼以15mg/ kg/剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次，测量平均肿瘤体积。5-10只小鼠/组的值 为平均值土 SEM。
[0036]图19显示用脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂量、游离奥沙利铂以15mg/kg/ 剂量(MTD)或盐水(对照)静脉内给药每周三次的具有BxPC-3胰腺异种移植瘤的无胸腺裸小 鼠的体重变化。5-10只小鼠/组的值为平均值土 SEM。
[0037] 图20显示Kaplan-Meier曲线，其显示经脂质体奥沙利铂5a以15、25、35mg/kg/剂 量、游离奥沙利铂以15mg/kg/剂量(MTD)或盐水（对照）静脉内给药每周三次处理的具有 BxPC-3胰腺异种移植瘤的无胸腺裸小鼠的存活百分数。各组以10只具有肿瘤的雌性小鼠开 始。
[0038] 发明详述
[0039] I.概述
[0040] 本发明涉及用于癌症疗法的脂质体奥沙利铂组合物。本文所述的脂质体组合物基 本上由磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇(PEG)缀合的脂质和包封的奥沙利铂组成。所公开的 组合物通常具有低于约20°C的凝胶-流体相变温度并在酸性介质中显示出人意料地迅速的 PH依赖性奥沙利铂释放。还描述了用于制备该组合物和用该组合物治疗癌症的方法。该组 合物特别有用于增强癌细胞中细胞内的奥沙利铂生物利用度和改善癌症治疗的整体安全 性。该组合物可广泛适用于预防和控制癌症，为患者和临床医生提供多种益处。
[0041 ] II.定义
[0042]如本文所用，术语"脂质体"涵盖由脂质双层包围的任何隔室(compartment)。术语 脂质体包括单层囊泡，其由单一的脂质双层构成，且直径通常在约20至约400nm范围内。月旨 质体也可以是多层的，其直径通常在l-ΙΟμπι范围内。在一些实施方式中，脂质体可包括多层 囊泡(MLV;尺寸为约Ιμπι至约ΙΟμπι)、大单层囊泡(LUV;尺寸为几百纳米至约ΙΟμπι)和小单层 囊泡（SUV;尺寸为约20nm至约200nm)〇
[0043] 如本文所用，术语"两性离子脂质体"是指含有在同一脂质分子中具有带正电荷和 带负电荷的官能团的脂质的脂质体。两性离子脂质体的整个表面电荷将根据外部介质的PH 而变化。通常，两性离子脂质体的整个表面电荷在生理pH(即，pH~7.4)下是中性的或阴性 的。
[0044] 如本文所用，术语"脂质体尺寸"和"平均粒径"是指脂质体的外径。平均粒径可通 过多种技术，包括动态光散射(DLS)、准弹性光散射(QELS)和电子显微镜来确定。
[0045] 如本文所用，术语"摩尔百分数"和"mol %"是指给定的脂质组分的摩尔数除以所 有脂质组分的总摩尔数。除非明确说明，当计算脂质体的脂质组分的mol%时，不包括活性 剂、稀释剂或其它组分的量。
[0046] 如本文所用，术语"磷脂酰胆碱脂质"是指具有胆碱头基的二酰基甘油酯磷脂（即， 1，2_二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）。磷脂酰胆碱脂质中的酰基通常衍生自具有6-24个碳原 子的脂肪酸。磷脂酰胆碱脂质可包括合成的和天然来源的1，2_二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆 碱。
[0047] 如本文所用，术语"胆固醇"是指2, 15-二甲基-14-(1,5-二甲基己基）四环 [8.7.0.02,7.0 11，15]二十七碳-7-烯-5-醇(化学文摘服务登记编号57-88-5)。
[0048]如本文所用，术语"PEG-脂质"是指共价结合至疏水性或两性脂质部分的聚（乙二 醇）聚合物。脂质部分可包括油脂、蜡、类固醇、脂溶性维生素、甘油一酯、甘油二酯、磷脂和 鞘脂。优选的PEG-脂质包括二酰基-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）]和N-酰基-鞘氨 醇-1-{琥珀酰基[甲氧基（聚乙二醇）]} AEG-脂质中的PEG的分子量通常为约500至约5000 道尔顿(Da; g/mol) JEG-脂质中的PEG可具有直链或支链结构。
[0049]如本文所用，术语"奥沙利铂"是指[(1R，2R)_环己烷-1，2-二胺](乙二根合_0,0'） 铂（Π )(化学文摘服务登记编号63121-00-6)。
[0050] 如本文所用，术语"组合物"是指包含特定量的特定成分的产品，以及由特定量的 特定成分的组合直接地或间接地产生的任何产品。本发明的药物组合物通常含有如本文所 述的脂质体奥沙利铂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。"药学上可接受的"是指载 体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容且对其接受者无害。
[0051] 如本文所用，术语"烧醇"是指具有至少一个羟基的Ch烷烃。烷醇包括但不限于甲 醇、乙醇、异丙醇和叔丁醇。
[0052]如本文所用，术语"多孔过滤器"是指含有具有限定的直径(例如，30-1000nm)的孔 的聚合物或无机膜。多孔过滤器可由聚合物，包括但不限于聚碳酸酯和聚酯，以及无机底 物，包括但不限于多孔氧化铝制成。
[0053] 如本文所用，术语"无菌过滤"是指通过使组合物穿过具有从滤液中排除微生物 和/或病毒的能力的过滤器进行的组合物的灭菌。通常，用于灭菌的过滤器含有足够大以使 脂质体穿过过滤器进入滤液，但足够小以阻止微生物例如细菌或真菌通过的孔。
[0054] 如本文所用，术语"癌症"是指包括人类癌症(cancers)和癌(carcinoma)、肉瘤、腺 癌、淋巴瘤、白血病以及实体瘤和淋巴癌的病症。不同类型的癌症的实例包括但不限于肺癌 (例如，非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌（即，肝癌 (hepatocarcinoma))、肾癌（即，肾细胞癌）、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸膜癌、胰腺癌、子 宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胰腺癌、胆道癌、胃肠道类癌肿瘤、食管癌、胆囊癌、阑尾癌、 小肠癌、胃（胃部)癌、中枢神经系统的癌症、皮肤癌、绒毛膜癌、头颈癌、血癌、骨原性肉瘤、 纤维肉瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴 瘤、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞性白血病、髓细胞性白血病、急性淋巴细胞白血 病、急性髓细胞性白血病和多发性骨髓瘤。
[0055] 如本文所用，术语"治疗或处理（treat/treat ing/treatment)"是指在治疗或改善 癌症或癌症症状中的任何成功指标，包括任何客观的或主观的参数，例如症状的减少;缓 解;消退或使癌症或癌症症状对于患者更加可容忍;或者，在一些情况下，预防癌症的发作。 症状的治疗或改善可基于任何客观的或主观的参数，包括例如，体检或临床试验的结果。
[0056] 如本文所用，术语"给予或给药(administer/administered/administering)" 是 指给予本发明的脂质体组合物的方法。本发明的脂质体组合物可以各种方式给予，包括胃 肠外、