癌症的治疗的制作方法

专利名称：癌症的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗癌症的组合物和方法。
越来越多的迹象表明肿瘤生长的细胞和分子学机制，不是仅涉及肿瘤细胞的增殖和迁移。重要地，据信肿瘤生长和转移依赖于血管发生，即新血管形成的过程(Crystal，1999)。血管发生(也称为新血管化)是通过血管内皮细胞的迁移和增殖介导的，萌发自现有的血管形成不断生长的微血管网，为不断生长的肿瘤提供必需的营养。如果没有活性的血管发生，原发的固体肿瘤的直径不会超过1-2mm(Harris，1998)。
人HepG2肝细胞性癌细胞已经用作癌细胞系模型，以评估抗肿瘤药物(Yang等，1997)。这些细胞基础表达及可诱导地表达立即早期基因和转录调节物即早期生长应答因子-1(EGR-1)(Kosaki等，1995)。早期生长应答蛋白(EGR-1)早期生长应答因子-1(EGR-1，也称为Egr-1，NGFI-A，zif268，krox24和TIS8)，是一种立即早期基因的产物，及是转录调节物的锌指家族的一个原型成员(Gashler等，1995)。Egr-1结合参与动脉硬化和再狭窄的发病机理中的一系列基因的启动子。这些包括血小板衍生生长因子(PDGF)A-链(Khachigian等，1995)，PDGF-B(Khachigian等，1996)，转化生长因子-β2(Liu等，1996，1998)，成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)(Hu等，1994；Biesiada等，1996)，1型膜基质金属蛋白酶(Haas等，1999)，组织因子(Cui等，1996)和细胞间粘着分子-1(Malzman等，1996)。EGR-1还已经定位于人动脉硬化斑中的内皮细胞和平滑肌细胞(McCaffrey等，2000)。用序列特异性催化DNA抑制Egr-1基因诱导，会抑制进行气囊血管成形术后的大鼠颈动脉内膜增厚(Santiago等，1999a)。DNAzymes在人类基因治疗中，反义核酸技术是选择用于灭活这样一些基因的主要手段之一，所述基因的表达导致疾病及因此是非所需的。反义方法应用一种核酸分子，其互补于并从而与编码非所需基因的一种mRNA分子杂交。这种杂交导致基因表达受抑制。
反义技术有一些缺点。反义杂交导致DNA/靶mRNA异源双链体形成。此异源双链体充当RNA酶H介导的靶mRNA组分降解的底物。在此，DNA反义分子以被动方式起作用，主要是通过内源性RNA酶H促进所需的裂解。考虑到反义分子具有与其靶mRNA形成稳定的异源双链体的化学性和能力，这种对RNA酶H依赖性限制了反义分子的设计。反义DNA分子还具有非特异性活性及在较高浓度甚至有毒性的问题。反义抑制靶mRNA表达的另一种机制例如是空间抑制翻译器沿着mRNA移动。
作为反义分子的替代，催化性核酸分子已经示出可作为治疗剂抑制基因表达，在文献中已经广泛论述(Haseloff(1988)；Breaker(1994)；Koizumi(1989)；Otsuka；Kashani-Sabet(1992)；Raillard(1996)；和Carmi(1996))。因此，与常规反义分子不同，催化性核酸分子通过实际上裂解其靶mRNA分子而不是只与其结合而起作用。催化性核酸分子只能裂解一种靶核酸序列，如果这种靶序列符合某些最基本要求。靶序列必须互补于催化性核酸的杂交臂，及靶序列在裂解位点必须含有一个特异性序列。
催化性RNA分子(核酶)已经充分论证(Haseloff(1988)Symonds(1992)；和Sun(1997))，并已经示出能裂解RNA(Haseloff(1988))和DNA(Raillard(1996))分子。确实，体外选择和演变技术的发展已经使得可使用己知核酶的随机变体或随机序列RNA作为起始点而获得新的抗已知底物的核酶(Pan(1992)；Tsang(1994)；和Breaker(1994))。
然而，核酶在打算进行其功能的细胞内对酶解非常敏感。这反过来限制了其药物学应用。
近来，产生了一类称为“DNAzymes”新的催化性分子(Breaker和Joyce(1995)；Santoro(1997))。DNAzymes是单链的，并裂解RNA(Breaker(1994)；Santoro(1997))和DNA(Carmi(1996))。已经提出一种DNAzyme的一般模型，称为“10-23”模型。根据“10-23”模型的DNAzymes，也简称为“10-23 DNAzymes”，具有由15个脱氧核糖核苷酸组成的一个催化结构域，两侧是均由7-9个脱氧核糖核苷酸组成的两个底物识别结构域。体外分析示出这种类型的DNAzymes在生理条件下，能在嘌呤嘧啶连接处有效地裂解其底物RNA(Santoro(1997))。
DNAzymes示出作为治疗剂的前景。然而，DNAzymes是否成功对抗由存在已知mRNA分子所导致的疾病还不可预测。此不可预测性部分是由于两个因素，首先，一些mRNA的二级结构可阻止DNAzymes结合及连接其靶mRNA的能力。其次，表达靶mRNA的细胞对DNAzymes的吸收也许不足以有效产生有治疗意义的结果。
本文所用术语“EGR”是指EGR家族的一个成员。EGR家族成员见Gashler等，1995所述，并包括EGR-1-EGR-4。通常优选的EGR家族成员是EGR-1。
因此，本发明的第一方面提供了一种治疗肿瘤的方法，此方法包括为治疗对象施用一种抑制EGR诱导的制剂、降低EGR表达的制剂或降低EGR的核累积或活性的制剂。
本发明的第二方面提供了一种抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法，此方法包括将肿瘤细胞与抑制EGR诱导的制剂、降低EGR表达的制剂或降低EGR的核累积或活性的制剂接触。
本发明的第三方面提供一种肿瘤细胞，该细胞已经通过在细胞中导入一种核酸分子而转化，此核酸分子包含或编码(i)一种抑制EGR诱导的制剂，(ii)一种降低EGR表达的制剂，或(iii)一种降低EGR的核累积或活性的制剂。
本发明的第四方面是提供一种筛选抑制血管发生的制剂的方法，该方法包括测试一种推定制剂的抑制EGR诱导、降低EGR表达或降低EGR的核累积或活性的能力。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述制剂选自以下一组EGR反义寡核苷酸，定向针对EGR的核酶，定向针对EGR dsDNA的ssDNA，这样ssDNA与EGR-1 dsDNA形成三链体，和定向针对EGR的DNAzyme。


图1胰岛素刺激血管内皮细胞中Egr-1依赖性基因表达。将预先用pEBSl3foscat使用FuGENE6转染的生长停滞的牛大动脉内皮细胞与D一葡萄糖(5-30mM)，胰岛素(100nM)或FGF-2(25ng/ml)如示温育，之后制备细胞裂解物。CAT活性根据裂解物中蛋白质浓度归一化。
图2在大动脉内皮细胞中胰岛素诱导的DNA合成被定向于Egr-1的反义寡核苷酸阻断。A.胰岛素刺激DNA合成。将生长停滞的内皮细胞用胰岛素(100nM或500nM)或FBS(2.5％)温育18小时，之后用3H-胸苷另外脉冲6小时。B.反义Egr-1寡核苷酸抑制胰岛素诱导的DNA合成。将内皮细胞用0.8μM的AS2，AS2C或E3温育，之后暴露于胰岛素(500nM或1000nM)18小时，并用3H-胸苷脉冲6小时。C.胰岛素诱导的DNA合成的剂量依赖性抑制。在用0.4μM或0.8μM的AS2或AS2C温育的内皮细胞中，确定由胰岛素(500nM)刺激的DNA合成。用β-闪烁计数器确定可TCA沉淀的3H-胸苷掺入DNA的情况。
图3在培养的大动脉内皮细胞中胰岛素诱导的DNA合成是MEK/ERK依赖性的。将生长静止的内皮细胞用PD98059(10μM或30μM)，SB202190(100nM或500nM)或渥曼青霉素(wortmannin)(300nM或1000nM)预先温育2小时，之后加入胰岛素(500nM)18小时，之后用3H-胸苷脉冲。用β-闪烁计数器确定可TCA沉淀的3H-胸苷掺入DNA的情况。
图4内皮细胞损伤后的伤口愈合通过胰岛素以Egr-1依赖性方式加强。对各实验组的损伤后3天裸露区域中的细胞群进行定量和绘制组织学图谱。
图5人微血管内皮细胞增殖受定向于人EGR-1的DNAzymes抑制。将SV-40转化的HMEC-1细胞在补加EGF(10ng/m1)和氢化可的松(1μg/m1)及10％FBS的MCDB 131培养基中生长。在无补加物的无血清培养基中温育48小时后，将细胞用指定的DNAzyme(0.4μM)转染，并在更换培养基(加入10％血清)72小时后再转染。
图6NGFI-A DNAzyme(ED5)，其混杂的对照(ED5SCR)和23nt的合成的大鼠底物的序列。下划线处是翻译起始位点。
图7NGFI-A DNAzyme抑制血清(FBS)对NGFI-A蛋白的诱导。用抗NGFI-A，Spl或c-Fos的抗体进行Western印迹分析。考马斯蓝染色的凝胶表明每条泳道加入了相同数量的蛋白质。EDC的序列是5’-CGC CAT TAG GCT AGC TAC AAC GAC CTA GTG AT-3’；3’T是倒位的。SFM表示无血清培养基。
图8NGFI-A DNAzyme抑制SMC增殖。a.通过Coulter计数器确定总细胞数目。将已经暴露于血清和/或DNAzyme 3天的生长停滞的SMCs用胰蛋白酶消化，随后对悬浮液进行定量。AS2的序列是5’-CTT GGC CGC TGC CAT-3’(SEQ ID NO2)。b.在暴露于血清和/或DNAzyme后掺入锥虫蓝的细胞的比例。将细胞在0.2％(wv)锥虫蓝中在22°C染色温育5分钟，之后用血细胞计数器以双盲方式定量。c.ED5对幼仔SMC增殖的作用。将已经暴露于血清和/或DNAzyme 3天的生长停滞的WKY12-22再悬浮，并通过Coulter计数器对细胞数目定量。数据是一式三份的两个独立实验的代表。图中标示了平均值和标准误差，*表示与对照组(只有FBS)相比P＜0.05(斯氏对比t检验)。
图9NGFI-A DNAzyme抑制大鼠颈动脉中新血管内膜形成。在右侧颈动脉永久结扎18天后，新血管内膜形成。将DNAzyme(500μg)或载体在结扎时和结扎后3天应用于外膜。序列特异性抑制新血管内膜形成。对以250μm间隔取自结扎点的每个大鼠(每组5个大鼠)的5个连续切片的新血管内膜和中膜区进行数字化测定并以每组比率表示。平均值和标准误差以纵轴表示，*表示与Lig，Lig+Veh，Lig+Veh+ED5SCR实验组对比，使用不成对数据Wilcoxen秩和检验P＜0.05。Lig表示结扎，Veh表示载体。
图10HepG2细胞增殖受0.75μM的DNAzyme DzA抑制。通过Coulter计数器确定总细胞数目。将已经暴露于血清和/或DNAzyme3天的生长停滞的细胞用胰蛋白酶消化，随后对悬浮液进行定量。DzA的序列是5’-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ IDNO3)。
发明详述本发明的第一方面是提供了一种治疗肿瘤的方法，该方法包括为治疗对象施用抑制EGR诱导的制剂，降低EGR表达的制剂，或降低EGR核累积或活性的制剂。
本发明第一方面的方法可包括通过抑制血管发生而间接抑制肿瘤生长，和/或通过在肿瘤细胞中阻断EGR而直接抑制肿瘤生长。
在第一方面的一个优选的实施方案中，肿瘤是固体肿瘤。肿瘤可以选自而非限于前列腺肿瘤，肝细胞癌，皮肤癌或乳房肿瘤。
本领域技术人员意识到有许多方式可以进行本发明的方法。
在本发明的一个优选的实施方案中，EGR是EGR-1。
在一个实施方案中，本发明的方法是通过直接使用三螺旋方法定向于EGR基因进行的，其中ssDNA分子可以结合dsDNA并防止转录。
在另一实施方案中，本发明的方法可以通过使用核酸转录诱饵(decoy)抑制EGR基因的转录而进行。可以设计线性序列形成一个部分分子内双链体，其编码限定的转录因子的结合位点。迹象提示EGR转录依赖于Spl，Apl或血清应答因子与启动子区域的结合。已经确定抑制一或多个这些转录因子的这种结合，可抑制EGR基因的转录。
在另一实施方案中，本发明的方法是通过使用合成的反义DNA分子抑制EGR mRNA的翻译进行的，所述反义DNA分子不作为RNaseH的底物，并通过在空间上阻断基因表达而起作用。
在另一实施方案中，本发明的方法是通过使用合成的反义DNA分子使mRNA不稳定而抑制EGR mRNA的翻译，所述反义DNA分子的作用是指导RNase H介导的在反义DNA和mRNA之间形成的异源双链体中存在的EGR mRNA的降解。
在本发明的一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸具有选自以下的序列(i) ACA CTT TTG TCT GCT(SEQ ID NO4)，和(ii)CTT GGC CGC TGC CAT(SEQ ID NO2)。
在另一实施方案中，本发明的方法是通过裂解mRNA而抑制EGR的翻译进行的，mRNA的裂解通过序列特异性锤头核酶和锤头核酶的衍生物如Minizymes或Mini核酶，或其中核酶衍生自(i)发夹核酶，(ii)四膜虫组I内含子，(iii)δ肝炎病毒核酶，或(iv)脉孢菌核酶。
本领域技术人员将意识到核酶的组成可以是(i)完全由RNA组成，(ii)由RNA和DNA碱基组成，或(iii)由RNA或DNA和修饰的碱基，糖和骨架组成。
在本发明中，核酶还可以是(i)完全合成的，或(ii)包含于基因转录物中，所述基因由病毒衍生载体输送，表达质粒，合成基因，同源或异源整合入患者的基因组中，或输送进来自体内的细胞中，之后使用上述任一种方法再导入患者的细胞中。
在另一个实施方案中，本发明的方法是通过表达反义EGR-1mRNA抑制EGR基因结合其靶DNA的能力进行的。
在另一实施方案中，本发明的方法是使用转录诱饵方法，通过抑制EGR作为转录因子的活性而进行的。
在另一实施方案中，本发明的方法是通过对GC富集的序列有优先性的药物抑制EGR基因结合其靶DNA的能力而进行的。这种药物包括诺加霉素，赫达霉素和色霉素A3(Chiang等，生物化学杂志1996；271233999)。
在一优选的实施方案中，本发明的方法是通过序列特异性DNAzyme裂解EGR mRNA进行的。在另一优选的实施方案中，DNAzyme包括(i)在嘌呤嘧啶裂解位点裂解mRNA的催化性结构域；(ii)与5’末端催化性结构域相邻的第一个结合结构域；和(iii)与3’末端催化性结构域相邻的第二个结合结构域，其中结合结构域与就在相当于SEQ ID NO15所示168-332位核苷酸的EGR mRNA的区域内的嘌呤嘧啶裂解位点两侧的两个区域充分互补，这样DNAzyme裂解EGR mRNA。
本文所用术语“DNAzyme”是指一种DNA分子，其特异性识别和裂解独特的靶核酸序列，靶核酸序列可以是DNA或RNA。
在一优选的实施方案中，DNAzyme的结合结构域互补于就在裂解位点两侧的区域。然而本领域技术人员意识到，DNAzyme结合并裂解EGR mRNA不需要严格的互补。
结合结构域的长度(也称为臂长)可以任意变换，并可以是相同或不同的。在一个优选的实施方案中，结合结构域的长度为至少6个核苷酸长。优选地，两个结合结构域组合的总长度为至少14个核苷酸。两个结合结构域的长度可以有各种变化，如7+7，8+8和9+9。
本发明的DNAzyme的催化性结构域可以是任何适当的催化性结构域。适当的催化性结构域例如Santoro和Joyce，1997和美国专利No.5807718所述。在一个优选的实施方案中，催化性结构域的核苷酸序列为GGCTAGCTACAACGA(SEQ ID NO5)。
在本发明中，在相当于168-332位核苷酸的EGR mRNA区域内的优选的裂解位点如下(i)相当于198-199位核苷酸的GU位点；(ii)相当于200-201位核苷酸的GU位点；(iii)相当于264-265位核苷酸的GU位点；(iv)相当于271-272位核苷酸的AU位点；(v)相当于292-293位核苷酸的AU位点；(vi)相当于301-302位核苷酸的AU位点；(vii)相当于303-304位核苷酸的GU位点；(viii)相当于316-317位核苷酸的AU位点。
在另一优选的实施方案中，DNAzyme具有选自以下的序列(i)5’-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttcggg(SEQ ID NO3)，靶GU(bp 198，199)；臂与bp 189-207杂交(ii)5’-tacaggggaGGCTAGCTACAACGAaccgttgcg(SEQ ID NO6)，靶GU(bp 200，201)；臂与bp191-209杂交(iii)5’-catcctggaGGCTAGCTACAACGAgagcggct(SEQ ID NO7)，靶GU(bp 264，265)；臂与bp 255-273杂交(iV)5’-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO8)，靶AU(bp 271，272)；臂与bp 262-280杂交(V)5’-ccgctgccaGGCTAAGCTACAACGAcccggacgt(SEQ ID NO9)，靶AU(bp 271-272)；臂与262-280bp杂交(Vi)5’-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat(SEQ ID NO10)，靶AU(bp 301，302)；臂与bp 292-310杂交(Vii)5’-cagcggggaGGCTAGCTACAACGAatcagctgc(SEQ ID NO11)，靶GU(bp 303，304)；臂与bp 294-312杂交(viii)5’-ggtcagagaGGCTAGCTACAACGActgcagagg(SEQ ID NO12)，靶AU(bp 316，317)；臂与bp 307-325杂交在一个特别优选的实施方案中，DNAzyme定向于相当于198-199位核苷酸的GU位点，相当于271-272位核苷酸的AU位点或相当于301-302位核苷酸的AU位点。
在另一优选的实施方案中，DNAzyme具有以下序列5’-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO3)5’-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat(SEQ ID NO10)5’-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO8)5’-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt(SEQ ID NO9)。
在应用基于DNAzyme的治疗中，优选DNAzyme尽可能地稳定以抗在细胞内环境中的降解。一种实现此目的的方法是通过在DNAzyme的一或多个末端掺入3’-3’倒位(inversion)。更特异地，3’-3’倒位(在此也简称为倒位)是指末端核苷酸的3’碳与其相邻的核苷酸之间的共价磷酸键。这种类型的键与在相邻的核苷酸的3’碳和5’碳之间的正常磷酸键相反，因此称为倒位。因此在一个优选的实施方案中，在构建与催化性结构域的3’末端相邻的结构域中，3’末端的核苷酸残基是倒位的。除了倒位之外，本发明的DNAzyme可以含有修饰的核苷酸。修饰的核苷酸例如包括N3’-P5’亚磷酰胺键，和肽-核酸键。本领域熟知这些结构。
在一个特别优选的实施方案中，DNAzyme在3’位置包括一个倒位的T。
尽管治疗对象可以是任何动物或人，但优选的治疗对象是人。
在本发明中，EGR抑制剂可以单独或与本领域技术人员已知的一或多种另外的抗癌制剂组合施用。
可以使用本领域己知的各种方法和输送系统施用抑制剂。可例如通过静脉内，口服，通过植入体，经粘膜，经皮，局部，肌内，皮下或体外施用。另外，本发明药物组合物理想地含有一或多种常规使用的药物适当的载体。本领域技术人员熟知这种载体。应用许多常规使用的载体的以下输送系统，只是预想施用本发明组合物的一些实施方案的代表。在一个实施方案中，输送载体含有Mg2+或其它阳离子，以作为有效的DNAzyme生物活性的辅因子。
经皮输送系统包括贴片，凝胶，胶带和霜剂，并可以含有赋形剂如增溶剂，通透增强剂(例如脂肪酸，脂肪酸酯脂肪醇和氨基酸)，亲水性聚合物(例如polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)，和黏合剂和胶粘剂(例如聚异丁烯，基于硅氧烷的黏合剂，丙烯酸酯和聚丁烯)。
经粘膜输送系统包括贴片，片剂，栓剂，阴道栓剂，凝胶和霜剂，并可以含有赋形剂如增溶剂和通透增强剂(例如丙二醇，胆盐和氨基酸)，及其它载体(例如聚乙二醇，脂肪酸酯和衍生物，及亲水性聚合物如羟丙甲基纤维素和透明质酸)。
口服输送系统包括片剂和胶囊。这些剂型可以含有赋形剂如粘合剂(例如羟丙甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，其它纤维素性物质和淀粉)，稀释剂(例如乳糖和其它糖，淀粉，Ca2PO4和纤维素性物质)，分解剂(例如淀粉聚合物和纤维素性物质)及润滑剂(例如硬脂酸和滑石)。
溶液，悬浮液和用于可复水的输送系统的粉末包括载体如悬浮剂(例如树胶，zanthans，纤维素和糖)，湿润剂(例如山梨糖醇)，增溶剂(例如乙醇，水，PEG和丙二醇)，表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠，Spans，Tweens，和十六烷基嘧啶)，防腐剂和抗氧化剂(例如对羟基苯甲酸酯类，维生素E和C，及抗坏血酸)，抗结块剂，包衣和螯合剂(例如EDTA)。
局部输送系统例如包括凝胶和溶液，并可以含有赋形剂如增溶剂，通透增强剂(例如脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇和氨基酸)，和亲水性聚合物(例如polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)。在优选的实施方案中，药物适当的载体是磷脂或可生物降解的聚合物。可用于本发明的载体例如包括以下物质(1)Fugene6(Roche)；(2)SUPERFECT(Qiagen)；(3)Lipofectamine 2000(GIBCO BRL)；(4)CellFectin，阳离子脂质N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈基精胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1.5(M/M)脂质体配方(GIBCO BRL)；(5)Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE的2∶1(M/M)脂质体配方(Glen Research)；(6)DOTAP(N-(1-(2，3-二油酰基氧基)-N，N，N-三甲基—甲基硫酸铵)(Boehringer Manheim)；和(7)Lipofectamine，聚阳离子脂质体DOSPA和中性脂质DOPE的3∶1(M/M)脂质体配方(GIBCO BRL)。
在一优选的实施方案中，将制剂注射入固体肿瘤或其附近。可注射的药物输送系统包括溶液，悬浮液，凝胶，微球体和可注射的聚合物，并可包含赋形剂如改变溶解性的制剂(例如乙醇，丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚辛酰内酯和PLGA’s)。可植入的系统包括棒伏和盘状物，并可以含有赋形剂如PLGA和聚辛酰内酯。
所述的核酸制剂的输送还可以通过以下非限制性的一或多种载体进行(a)脂质体和脂质体—蛋白质的缀合物和混合物；(b)非脂质体脂质和阳离子脂质配方；(c)活性的树状物(dendrimer)配方；(d)在聚合物配方内如pluronic凝胶，或在乙烯乙烯基乙酸酯共聚物(EVAc)内。聚合物可以腔内输送；(e)在病毒—脂质体复合物内，如Sendai病毒；或(f)作为肽-DNA缀合物。
确定本发明药物组合物的预防有效剂量可以使用常规计算方法基于动物数据进行。在一个实施方案中，预防性有效剂量含有大约0.1mg-1g本发明DNAzyme。在另一实施方案中，预防性有效剂量含有大约1mg-100mg的本发明DNAzyme。在另一实施方案中，预防性有效剂量含有大约10mg-50mg的本发明DNAzyme。在另一实施方案中，预防性有效剂量含有大约25mg本发明DNAzyme。
也已确定定向于EGR的核酸制剂可以通过体内转染细胞悬浮液而施用，从而抑制肿瘤生长，分化和/或转移。
本发明的第二方面是提供了一种抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法，该方法包括将肿瘤细胞与抑制EGR诱导的制剂、降低EGR表达的制剂或降低EGR的核累积或活性的制剂接触。
本发明的第三方面是提供了一种肿瘤细胞，其已经通过在细胞中导入一种核酸分子而转化，此核酸分子包含或编码(i)抑制EGR诱导的制剂，(ii)降低EGR表达的制剂，(iii)降低EGR的和累积或活性的制剂。
在本发明的第三或第四方面的一个优选的实施方案中，制剂选自EGR反义寡核苷酸或mRNA，定向针对EGR的序列特异性核酶，定向针对EGR dsDNA的ssDNA，和定向针对EGR的序列特异性DNAzyme。
本发明的第四方面是提供了一种筛选抑制血管发生的制剂的方法，此方法包括对推定的制剂的抑制EGR诱导、降低EGR表达或降低EGR的核累积或活性的能力进行测试。
可通过任何适当方法对推定的制剂测试其抑制EGR的能力。例如，测试可包括将表达EGR的细胞与推定的制剂接触，并监测EGRmRNA(例如通过Northern印迹分析)，或EGR蛋白(例如通过免疫组织化学分析或Western印迹分析)的产生。本领域技术人员也已知其它适当的测试方法。
为进行参考，下表1列出了小鼠，大鼠和人EGR-1的DNA序列对比。
表1小鼠，大鼠和人EGR-1符号对照表GenRunDatapileupdna.cmp CompCheck6876GapWeight5.000GapLengthWeight0.300EGRlalign.msf MSF4388 TypeN April 7，1998 1207 Check5107名称mouseEGRl Len4388Check8340 Weight1.00(SEQ ID NO13)名称ratEGRl Len4388Check8587 Weight1.00(SEQ ID NO14)名称humanEGRl Len4388Check8180 Weight1.00(SEQ ID NO15)NB.这是大鼠NGFI-A编号1 50mouseEgrl .......... .......... .......... .......... ..........ratNGFIACCGCGGAGCC TCAGCTCTAC GCGCCTGGCG CCCTCCCTAC GCGGGCGTCChumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
51 100mouseEGRl .......... .......... .......... .......... ..........ratEGRl CCGACTCCCG CGCGCGTTCA GGCTCCGGGT TGGGAACCAA GGAGGGGGAGhumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
101150mouseEGRl .......... .......... .......... .......... ..........ratEGRl GGTGGGTGCG CCGACCCGGA AACACCATAT AAGGAGCAGG AAGGATCCCChumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
151200mouseEGRl .......... .......... .......... .......... ..........ratEGRl CGCCGGAACA GACCTTATTT GGGCAGCGCC TTATATGGAG TGGCCCAATAhumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
201250mouseEGRl .......... .......... .......... .......... ..........ratEGRl TGGCCCTGCC GCTTCCGGCT CTGGGAGGAG GGGCGAACGG GGGTTGGGGChumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
251 300mouseEGRI .......... .......... .......... .......... ..........ratEGRl GGGGGCAAGC TGGGAACTCC AGGAGCCTAG CCCGGGAGGC CACTGCCGCThumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
301350mouseEGRI .......... .......... .......... .......... ..........ratEGRl GTTCCAATAC TAGGCTTTCC AGGAGCCTGA GCGCTCAGGG TGCCGGAGCChumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
351400mouseEGRl .......... .......... .......... .......... ..........rstEGRl GGTCGCAGGG TGGAAGCGCC CACCGCTCTT GGATGGGAGG TCTTCACGTChumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
401450mouseEGRl .......... .......... .......... .......... ..........ratEGRl ACTCCGGGTC CTCCCGGTCG GTCCTTCCAT ATTAGGGCTT CCTGCTTCCChumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
451500mouseEGRl .......... .......... .......... .......... ..........rstEGRl ATATATGGCC ATGTACGTCA CGGCGGAGGC GGGCCCGTGC TGTTTCAGAChumanEGRl .......... .......... .......... .......... ..........
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901950mouseEGRI TGGACAACTA CCCCAAACTG GAGGAGATGA TGCTGCTGAG CAACGGGGCTratEGRITGGACAACTA CCCCAAACTG GAGGAGATGA TGCTGCTGAG CAACGGGGCThumanEGRl TGGACAACTA CCCTAAGCTG GAGGAGATGA TGCTGCTGAG CAACGGGGCT951 1000mouseEGRl CCCCAGTTCC TCGGTGCTGC CGGAACCCCA GAGGGCAGCG GCGGTAAT..ratEGRlCCCCAGTTCC TCGGTGCTGC CGGAACCCCA GAGGGCAGCG GCGGCAATAAhumanEGRI CCCCAGTTCC TCGGCGCCGC CGGGGCCCCA GAGGGCAGCG GCAGCAACAG1001 1050mouseEGRl .......AGC AGCAGCAGCA CCAGCAGCGG GGGCGGTGGT GGGGGCGGCAratEGRlCAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCGG GGGCGGTGGT GGGGGCGGCAhumanEGRl CAGCAGCAGC AGCAGCGGGG GCGGTGGAGG CGGCGGGGGC GGCAGCAACA1051 1100mouseEGRl GCAACAGCGG CAGCAGCGCC TTCAATCCTC AAGGGGAGCC GAGCGAACAAratEGRlGCAACAGCGG CAGCAGCGCT TTCAATCCTC AAGGGGAGCC GAGCGAACAAhumanEGRI GCAGCAGCAG CAGCAGCACC TTCAACCCTC AGGCGGACAC GGGCGAGCAG1101 1150mouseEGRl CCCTATGAGC ACCTGACCAC AG...AGTCC TTTTCTGACA TCGCTCTGAAratEGRlCCCTACGAGC ACCTGACCAC AGGTAAGCGG TGGTCTGCGC CGAGGCTGAAhumanEGRl CCCTACGAGC ACCTGACCGC AG...AGTCT TTTCCTGACA TCTCTCTGAA1151 1200mouseEGRl TAATGAGAAG GCGATGGTGG AGACGAGTTA TCCCAGCCAA ACGACTCGGTratEGRlTCCCCCTTCG TGACTACCCT AACGTCCAGT CCTTTGCAGC ACGGACCTGChumanEGRl CAACGAGAAG GTGCTGGTGG AGACCAGTTA CCCCAGCCAA ACCACTCGAC120l 1250mouseEGRl TGCCTCCCAT CACCTATACT GGCCGCTTCT CCCTGGAGCC CGCACCCAACratEGRlATCTAGATCT TAGGGACGGG ATTGGGATTT CCCTCTATTC ..CACACAGChumanEGRl TGCCCCCCAT CACCTATACT GGCCGCTTTT CCCTGGAGCC TGCACCCAAC1251 1300mouseEGRl AGTGGCAACA CTTTGTGGCC TGAACCCCTT TTCAGCCTAG TCAGTGGCCTratEGRlTCCAGGGACT TGTGTTAGAG GGATGTCTGG GGACCCCCCA ACCCTCCATChumanEGRI AGTGGCAACA CCTTGTGGCC CGAGCCCCTC TTCAGCTTGG TCAGTGGCCT1301 1350mouseEGRl CGTGAGCATG ACCAATCCTC CGACCTCTTC ATCCTCGGCG CCTTCTCCAGratEGRlCTTGCGGGTG CGCGGAGGGC AGACCGTTTG TTTTGGATGG AGAACTCAAGhumanEGRl AGTGAGCATG ACCAACCCAC CGGCCTCCTC GTCCTCAGCA CCATCTCCAG1351 1400mouseEGRl CTGCTTCATC GTCTTCCTCT GCCTCCCAGA GCCCGCCCCT GAGCTGTGCCratEGRlTTGCGTGGGT GGCT...... .....GGAGT GGGGGAGGGT TTGTTTTGAThumanEGRI CGGCCTCCTC CGC...CTCC GCCTCCCAGA GCCCACCCCT GAGCTGCGCA1401 1450mouseEGRl GTGCCGTCCA ACGACAGCAG TCCCATCTAC TCGGCTGCGC CCACCTTTCCratEGRlGAGCAGGGTT GC....CCCC TCCCCCGCGC GCGTTGTCGC GAGCCTTGTThumanEGRl GTGCCATCCA ACGACAGCAG TCCCATTTAC TCAGCGGCAC CCACCTTCCC1451 1500mouseEGRI TACTCCCAAC ACTGACATTT TTCCTGAGCC CCAAAGCCAG GCCTTTCCTGratEGRlTGCAGCTTGT TCCCAAGGAA GGGCTGAAAT CTGTCACCAG GGATGTCCCGhumanEGRI CACGCCGAAC ACTGACATTT TCCCTGAGCC ACAAAGCCAG GCCTTCCCGG1501 1550mouseEGRl GCTCGGCAGG CACAGCCTTG CAGTACCCGC CTCCTGCCTA CCCTGCCACCratEGRlCCGCCCAGGG TAGGGGCGCG CATTAGCTGT GGCC.ACTAG GGTGCTGGCGhumanEGRl GCTCGGCAGG GACAGCGCTC CAGTACCCGC CTCCTGCCTA CCCTGCCGCC1551 1600mouseEGRl AAAGGTGGTT TCCAGGTTCC CATGATCCCT GACTATCTGT TTCCACAACAratEGRlGGATTCCCTC ACCCCGGACG CCTGCTGCGG AGCGCTCTCA GAGCTGCAGThumanEGRI AAGGGTGGCT TCCAGGTTCC CATGATCCCC GACTACCTGT TTCCACAGCA1601 1650mouseEGRl ACAGGGAGAC CTGAGCCTGG GCACCCCAGA CCAGAAGCCC TTCCAGGGTCratEGRlAGAGGGGGAT TCTCTGTTTG CGTCAGCTGT CGAAATGGCT CT......GChumanEGRl GCAGGGGGAT CTGGGCCTGG GCACCCCAGA CCAGAAGCCC TTCCAGGGCC1651 1700mouseEGRl TGGAGAACCG TACCCAGCAG CCTTCGCTCA CTCCACTATC CACTATTAAAratEGRlCACTGGAGCA GGTCCAGGAA CATTGCAATC TGCTGCTATC AATTATTAAChumanEGRl TGGAGAGCCG CACCCAGCAG CCTTCGCTAA CCCCTCTGTC TACTATTAAG1701 1750mouseEGRl GCCTTCGCCA CTCAGTCGGG CTCCCAGGAC TTAAAG.... ...GCTCTTAratEGRlCACATCGAGA GTCAGTGGTA GCCGGGCGAC CTCTTGCCTG GCCGCTTCGGhumanEGRl GCCTTTGCCA CTCAGTCGGG CTCCCAGGAC CTGAAG.... ...GCCCTCA1751 1800mouseEGRl ATACCACCTA CCAATCCCAG CTCATCA..A ACCCAGCCGC ATGCGCAAGTratEGRlCTCTCATCGT CCAGTGATTG CTCTCCAGTA ACCAGGCCTC TCTGTTCTCThumanEGRl ATACCAGCTA CCAGTCCCAG CTCATCA..A ACCCAGCCGC ATGCGCAAGT1801 1850mouseEGRl ACCCCAACCG GCCCAGCAAG ACACCCCCCC ATGAACGCCC ATATGCTTGCratEGRlTTCCTGCCAG AGTCCTTTTC TGACATCGCT CTGAATAACG AGAAG..GCGhumanEGRl ATCCCAACCG GCCCAGCAAG ACGCCCCCCC ACGAACGCCC TTACGCTTGC1851 1900mouseEGRl CCTGTCGAGT CCTGCGATCG CCGCTTTTCT CGCTCGGATG AGCTTACCCGratEGRlCTGGTGGAGA CAAGTTATCC CAGCCAAACT ACCCGGTTGC CTCCCATCAChumanEGRI CCAGTGGAGT CCTGTGATCG CCGCTTCTCC CGCTCCGACG AGCTCACCCG1901 1950mouseEGRl CCATATCCGC ATCCACACAG GCCAGAAGCC CTTCCAGTGT CGAATCTGCAratEGRlCTATACTGGC CGCTTCTCCC TGGAGCCTGC ACCCAACAGT GGCAACACTThumanEGRl CCACATCCGC ATCCACACAG GCCAGAAGCC CTTCCAGTGC CGCATCTGCA1951 2000mouseEGRl TGCGTAACTT CAGTCGTAGT GACCACCTTA CCACCCACAT CCGCACCCACratEGRlTGTGGCCTGA ACCCCTTTTC AGCCTAGTCA GTGGCCTTGT GAGCATGACChumanEGRl TGCGCAACTT CAGCCGCAGC GACCACCTCA CCACCCACAT CCGCACCCAC2001 2050mouseEGRl ACAGGCGAGA AGCCTTTTGC CTGTGACATT TGTGGGAGGA AGTTTGCCAGratEGRlAACCCTCCAA CCTCTTCATC CTCAGCGCCT TCTCCAGCTG CTTCATCGTChumanEGRl ACAGGCGAAA AGCCCTTCGC CTGCGACATC TGTGGAAGAA AGTTTGCCAG2051 2100mouseEGRl GAGTGATGAA CGCAAGAGGC ATACCAAAAT CCATTTAAGA CAGAAGGACAratEGRlTTCCTCTGCC TCCCAGAGCC CACCCCTGAG CTGTGCCGTG CCGTCCAACGhumanEGRl GAGCGATGAA CGCAAGAGGC ATACCAAGAT CCACTTGCGG CAGAAGGACA2101 2150mouseEGRl AGAAAGCAGA CAAAAGTGTG GTGGCCTCCC CGGCTGC... .CTCTTCACTratEGRIACAGCAGTCC CATTTACTCA GCTGCACCCA CCTTTCCTAC TCCCAACACThumanEGRl AGAAAGCAGA CAAAAGTGTT GTGGCCTCTT CGGCCACCTC CTCTCTCTCT2151 2200mouseEGRI .......... .......... 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细胞培养 牛大动脉内皮细胞得自细胞应用公司并在第5-9代之间使用。将内皮细胞生长于Dulbecco’s修改的Eagles培养基中(LifeTechnologies)，pH7.4，该培养基含有补加50ug/ml链霉素和50IU/m1青霉素的10％胎牛血清。将细胞用胰蛋白酶/EDTA常规传代，并在37℃在5％CO2/95％空气的湿化环境中保持。
瞬时转染分析和CAT分析 将内皮细胞在100mm培养皿中生长至60-70％铺满，并用10ug指定的基于氯霉素乙酰转移酶(CAT)的启动子报道构建体，用FuGENE6(Roche)瞬时转染。通过将细胞在0.25％FBS中温育48小时而使其生长停滞，并用各种激动剂刺激24小时，之后收获并评估CAT活性。测定CAT活性，并如前述(Khachigian等，1999)以裂解物中蛋白质的浓度归一化CAT活性(通过Biorad蛋白质分析确定)。
Northern印迹分析 将预先暴露于各种激动剂1小时的生长停滞的内皮细胞的总RNA(12μg/ml)(用TRIzol试剂(Life Technologies)根据生产者的指导制备的)，通过在变性1％琼脂糖—甲醛凝胶上电泳而解离。在移至Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上过夜后，将印迹与32P标记的Egr-1 cDNA杂交过夜，该cDNA是用Nick翻译试剂盒(Roche)制备的。洗该膜并如前述通过放射自显影观测放射活性(Khachigian等，1995)。
RT-PCR用8μg的总RNA使用M-MLV逆转录酶进行逆转录。Egr-1 cDNA(334bp产物(Delbridge等，1997))是用Taq聚合酶通过在94℃加热1分钟，并在94℃1分钟，94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟循环而扩增的。在30次循环后，在72℃进行5分钟延伸。将样品在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，并在紫外光下照像。基本如上所述进行β-肌动蛋白扩增(690bp产物)。引物的序列是Egr-1正向引物(5’-GCA CCC AAC AGT GGCAAC-3’)(SEQ ID NO18)，Egr-1反向引物(5’-GGG ATC ATGGGA ACC TGG-3’)(SEQ ID NO19)，B-肌动蛋白正向引物(5’-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3’)(SEQ IDNO20)，β-肌动蛋白反向引物(5’-CTA GAA GCA TTT GCG GTGGAC GAT GGA GGG-3’)(SEQ ID NO21)。
反义寡核苷酸输送和Western印迹分析 将100mm培养皿中的生长停滞的细胞用指定的寡核苷酸温育24小时及在更换培养基后温育48小时。当第二次加入寡核苷酸时，将细胞用各种浓度的胰岛素温育并在随后的1小时收获。将细胞在冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4中洗，并溶解于RIPA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％Triton X-100，5mM EDTA，1％抑肽酶，10ug/ml亮肽素，1％抑酶肽，2μM PMSF)中。将裂解物通过在8％变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳而解离，移至PDVF尼龙膜上(NEN-DuPont)，用脱脂奶粉阻断，然后用Egr-1的多克隆抗体(SantaCruz生物技术公司)和单克隆辣根过氧化物酶连接的小鼠抗大鼠Ig二级抗体温育，随后进行化学发光测定(NEN-DuPont)。
3H-胸苷掺入DNA中将在96孔平板中90％铺满的生长停滞的内皮细胞用寡核苷酸温育两次，之后加入胰岛素。当在试验中使用信号传导抑制剂(PD98059，SB202190，渥曼青霉素)时，在加入胰岛素之前2小时加入这些试剂。在暴露于胰岛素18小时后，将细胞用200000 cpm/孔甲基3H-胸苷(NEN-DuPont)脉冲6小时。裂解物通过首先在冷的PBS，pH7.4中洗，然后用冷的10％三氯乙酸固定，用冷的乙醇洗及溶解于0.1M NaOH中而制备。裂解物中3H-胸苷的数量用ACSII闪烁剂使用β-闪烁计数器(Packard)确定。
体外损伤 将90％铺满的生长停滞的细胞用各种浓度的反义寡核苷酸和胰岛素如上述温育，然后用无菌的木制牙签划过单细胞层刮擦(Khachigian等，1996)。在48-72小时后，将细胞固定在4％福尔马林中，用苏木精/伊红染色，然后照像。
HMEC-1培养和增殖分析 将SV40转化的HMEC-1细胞生长于MCDB 131培养基中，该培养基补加了EGF(10ng/m1)和氢化可的松(1μg/ml)和10％FBS。在无补加物的无血清培养基中温育48小时后，将细胞用指定的DNAzyme(0.4μM)转染，并在加入10％血清更换培养基后72小时再转染。在加入血清24小时后，通过Coulter计数器确定细胞数。
反义Egr-1 mRNA过表达 将牛大动脉内皮细胞或大鼠血管平滑肌细胞在96孔平板中生长至60％铺满，然后用3μg的pcDNA3-A/SEgr-1构建体(其中将一个137bp的Egr-1 cDNA片段(732-869)以反义方向克隆入pcDNA3的BamHI/EcoRI位点中)，或用pcDNA3，根据生产者的指导使用Fugene6进行转染。将生长停滞的细胞与5％FBS在Waymouth’s培养基(SMC)或DMEM(EC)中温育，并在3天后用胰蛋白酶消化，之后通过Coulter计数器确定细胞群数量。结果和讨论是胰岛素而非葡萄糖在血管内皮细胞中刺激Egr-1活性高浓度葡萄糖通过刺激促分裂原激活的蛋白质(MAP)激酶活性和立即早期基因的表达，可以激活正常静止的血管内皮(Frodin等，1995；Kang等，1999)。这些信号和转录事件反过来可以诱导其它基因的表达，其产物然后改变内皮表型并促进病变的发展。为确定葡萄糖在血管内皮细胞中对Egr-1活性的作用，我们在用pEBSl3foscat转染的内皮细胞中进行了瞬时转染分析，pEBSl3foscat是一种基于氯霉素乙酰转移酶(CAT)的报道载体，由位于c-fos TATA框上游的3个高亲和性Egr-1结合位点驱动(Gashler等，1993)。将生长停滞的内皮细胞暴露于各种浓度的葡萄糖(5-30mM)超过24小时，并不能提高Egr-1结合活性(图1)。然而，Egr-1结合活性在暴露于胰岛素(100nM)的细胞中提高(图1)。在与FGF-2温育时，报道分子活性也提高，FGF-2是在血管内皮细胞中的一种已知的Egr-1转录和结合活性诱导因子(Santiago等，1999b)(图1)。
在血管内皮细胞中胰岛素和FGF-2诱导Egr-1 mRNA表达使再报道基因分析的前述发现，提供了在暴露于胰岛素的内皮细胞中提高Egr-1表达的证据。我们接着使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Northern印迹分析，以直接证实胰岛素提高Egr-1 mRNA水平的能力。RT-PCR证实Egr-1在生长静止的内皮细胞中微弱表达(数据未示出)。同FGF-2一样，在暴露于激动剂1小时之内，胰岛素提高Egr-1表达。相反，β-肌动蛋白mRNA的水平不变。Northern印迹分析证实这些定性数据通过胰岛素、FGF-2和佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)在1小时内提高稳态Egr-1 mRNA水平而不提高核糖体28S和18S mRNA的水平证实(数据未示出)，PMA是另一种Egr-1表达的潜在诱导剂(Khachigian等，1995)。
在内皮细胞中胰岛素刺激的Egr-1蛋白质合成通过定向于Egr-1mRNA的反义寡核苷酸抑制为顺应我们证实的胰岛素诱导的Egr-1mRNA表达具有转录因子的结合活性(图1)，我们使用抗Egr-1蛋白的多克隆抗体进行了Western免疫印迹分析。在生长停滞的内皮细胞中，在1小时内胰岛素(100nM和500nM)诱导Egr-1蛋白质合成。综合这些发现，证实在血管内皮细胞中胰岛素提高Egr-1 mRNA、蛋白质和结合活性。
我们近来开发了基于硫代磷酸的反义寡核苷酸，其定向于Egr-1mRNA中翻译起始位点(Santiago等，1999c)。这些寡核苷酸缺失与非特异性生物活性相关的硫代磷酸G-quartet序列(Stein，1997)。Western印迹分析证实，用0.8μM反义Egr-1寡核苷酸(AS2)预先温育生长停滞的内皮细胞会抑制胰岛素诱导的Egr-1蛋白质合成，尽管蛋白质的荷载相同。在将细胞暴露于相同浓度的AS2C之后，胰岛素诱导的Egr-1蛋白质没有弱化表明反义Egr-1寡核苷酸的序列特异性抑制效应。
胰岛素刺激由定向于Egr-1 mRNA的反义寡核苷酸抑制的内皮细胞DNA合成将减弱Egr-1蛋白质诱导的这些寡核苷酸用于3H-胸苷掺入分析中，以确定在胰岛素诱导的DNA合成中包含Egr-1。此分析评价了可用三氯乙酸(TCA)沉淀的DNA中3H-胸苷的吸收(Khachigian等，1992)。在初始的实验中，将生长停滞的内皮细胞暴露于胰岛素(100nM)，使DNA合成提高100％，而暴露于500nM胰岛素使DNA合成提高200％(图2A)。
我们接着测定AS2和AS2C对胰岛素诱导的内皮细胞DNA合成的作用。在不加入胰岛素的情况下，AS2(0.8μM)抑制由低浓度血清(0.25％v/v)促进的基础内皮DNA合成(图2B)。相反，混杂的对照组(0.8μM)或第三种寡核苷酸E3(0.8μM)对基础DNA合成的作用较小(图2B)，E3是一种针对Egr-1mRNA的另一个区域的大小匹配的硫代磷酸(Santiago等，1999c)。另外，与AS2C和E3不同，AS2明显地抑制由胰岛素(500nM和1000nM)诱导的DNA合成(图2B)。为证实DNA合成的抑制依赖于浓度，我们用0.4μM以及0.8μM的Egr-1寡核苷酸与内皮细胞温育。由于这种较低浓度的AS2对3H-胸苷掺入的抑制不很有效(与AS2C相比)，表明反义Egr-1寡核苷酸的抑制作用是剂量依赖性和序列特异性的(图2C)。这些发现表明在由胰岛素诱导的内皮细胞DNA合成中需要Egr-1蛋白。
内皮细胞中胰岛素刺激的DNA合成受PD98059和Wortmannin抑制，但不受SB202190抑制诱导型Egr-1转录是由胞外信号调节的激酶(EPK)的活性支配的(Santiago等，1999b)，其使Egr-1启动子中的血清应答元件的因子磷酸化(Gashler等，1995)。由于对介导血管内皮细胞的胰岛素诱导的增殖的信号途径了解较少，我们用特异性MEK/ERK抑制剂PD98059测定MEK/ERK在此过程中的相关性。这种化合物(在10和30μM)以剂量依赖性方式抑制胰岛素诱导的DNA合成(图3)。同样，Wortmannin(0.3和1μM)也以剂量依赖性方式抑制DNA合成(图3)，Wortmannin是磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂，其还抑制c-Jun N-末端激酶(JNK)(Ishizuka等，1999；Day等，1999；Kumahara等，1999)，EPK(Barry等，1999)和p38激酶(Barry等，1999)。相反，特异性p38激酶抑制剂SB202190(100nM和500nM)不影响DNA合成(图3)。这些发现表明在胰岛素诱导的内皮细胞增殖中MEK/ERK的关键作用，和JNK的可能作用，及在此过程中不包含p38激酶。
在体外机械性创伤后，胰岛素以Egr-1依赖性方式刺激内皮细胞再生培养的机械性创伤的血管内皮细胞(和平滑肌细胞)，在伤口边缘产生迁移和增殖，并最后又覆盖裸露区域。我们猜测胰岛素促进了对机械性创伤的这种细胞应答。尖锐地刮削生长静止的(通过在0.25％血清中温育48小时所致)单层内皮细胞，产生一明显的伤口边缘(数据未示出)。在含有低浓度血清的培养基中将培养物持续温育3天后，裸露区产生微弱的再生，但在最佳量血清(10％)的情况下发生侵占性再生。当在创伤时向生长静止的培养物中加入胰岛素(500nM)时，裸露区中的细胞群明显增加，虽然如所期望的，低于10％血清对照组的效力。
为研究在创伤后由胰岛素加强的内皮细胞再生中涉及Egr-1，我们用反义Egr-1寡核苷酸温育培养物，之后刮削并再一次在创伤时加入胰岛素。AS2(0.8μM)明显抑制由胰岛素刺激的内皮细胞再生。相反，在存在AS2C(0.8μM)情况下的再生与其中没有寡核苷酸的培养物无明显不同。当使用较高浓度(1.2μM)的AS2和AS2C时，观测到相似的结果。因此，在创伤后由胰岛素刺激的内皮细胞再生以Egr-1依赖性方式进行。这些观测在图4中加以定量。
这些结果示出在创伤后胰岛素诱导的增殖和再生关键依赖于Egr-1的活化。Northern印迹，RT-PCR和Western免疫印迹分析证明胰岛素诱导Egr-1 mRNA和蛋白质表达。以序列特异性和剂量依赖性方式阻断胰岛素诱导的Egr-1蛋白合成的反义寡核苷酸，在机械性创伤后也抑制增殖和再生。使用特异定向于Egr-1的核酸所得的这些结果表明这种转录因子功能性参与内皮细胞生长。
胰岛素信号传导包括激活许多立即早期基因和转录因子。这些因子包括c-fos(Mohn等，1990；Jhun等，1995；Harade等，1996)，c-iun(Mohn等，1990)，核因子cB(Bertrand等，1998)，SOCS3(Emanuelli等，2000)和叉头转录因子FKHR(Nakae等，1999)。胰岛素还诱导Egr-1在血管系膜细胞(Solow等，1999)，成纤维细胞(Jhun等，1995)，脂肪细胞(Alexander-Bridges等，1992)和中国仓鼠卵巢细胞(Harada等，1996)中表达。本发明的研究首次阐述了在血管内皮细胞中胰岛素对Egr-1的诱导。
胰岛素激活MAP激酶超家族内的一些亚类，包括ERK，JNK和p38激酶(Guo等，1998)。我们的发现表明特异性ERK抑制剂PD98059结合MEK并通过Raf防止磷酸化，抑制胰岛素诱导的内皮细胞增殖。Egr-1转录自身依赖于ERK的磷酸化活性，通过其活化Egr-1启动子中血清应答元件(SRE)的三元复合物因子(如Elk-1)进行。Egr-1启动子中有6个SRE，而在c-fos启动子中只存在1个(Gashler等，1995)。在血管内皮细胞中c-fos SRE处，PD98059阻断胰岛素诱导的Elk-1转录活性(Xi等，1997)。这些公布的结果与本发明结论即胰岛素诱导的增殖中涉及Egr-1相一致。
为提供内皮细胞增殖是一种Egr-1依赖性过程，而不依赖于胰岛素的证据，我们将人微血管内皮细胞(HMEC-1)分别用两种DNAzymes(DzA和DzF)以终浓度0.4μM温育，这两种酶定向于人EGR-1mRNA中的不同位点。DzA和DzF在存在5％血清的情况下，均抑制HMEC-1复制(总细胞计数)(图5)。相反，在相同浓度DzFscr不能调节增殖(图5)。DzFscr携带与DzF相同活性的15nt的催化性结构域，及具有相同净电荷，但具有混杂的杂交臂。使用另一种内皮细胞类型所得的这些数据表明使用定向于人EGR-1的序列特异性策略抑制内皮细胞增殖。
最后，我们发现CMV介导的反义Egr-1mRNA的过表达抑制内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。内皮细胞和平滑肌细胞pcDNA3-A/Segr-1转染物的复制明显低于只用骨架载体pcDNA3转染的那些转染物的复制(数据未示出)。这些发现表明反义EGR mRNA策略可以抑制动脉内皮细胞和至少一种其它类型血管内皮细胞的增殖。
尽管可以临床使用大量化疗剂以临床控制肿瘤形成，固体肿瘤在西方世界仍然是导致死亡的一种主要因素。目前用于治疗这种肿瘤的药物通常是非特异性毒剂，其对非癌组织可能是有毒性的，并需要大剂量才能生效。逐渐增多的迹象是肿瘤生长的细胞学和分子学机制不只包括肿瘤细胞增殖和迁移。重要的是肿瘤生长和转移关键依赖于血管发生，新血管形成的过程(Crystal等，1999)。本发明的发现表明Egr-1在血管内皮细胞复制和迁移中是关键的，明显意味着这种转录因子在血管发生和肿瘤发生中是关键的调节因子。实施例2定向于大鼠Egr-1(NGFI-A)的DNAzyme的鉴定物质和方法ODN合成除非特别说明，DNAzymes是商业合成的(Oligos Etc.公司)，其在3’位置有一倒位T。合成的裂解反应中的底物不含这种修饰。指定的ODNs用γ32p-dATP和T4多核苷酸激酶在5’末端标记(新英格兰生物实验室)。将未掺入的标记通过在Chromaspin-10层析柱(Clontech)上离心从放射标记的物质中分离。
体外转录和裂解实验32P标记的206nt的NGFI-A RNA转录物是通过体外转录(T3聚合酶)预先用BglII切割的质粒构建体pJDM8而制备的(如Milbrandt，1987所述，以其全文并入参考)。除非特别说明，以20μ1总体积进行反应，含有10mM MgCl2，5mM Tris pH7.5，150mM NaCl，4.8pmol的体外转录的或合成的RNA底物和60pmolDNAzyme(底物与DNAzyme比率为1∶12.5)。将反应在37℃进行指定的时间，并通过将等份移至含有甲酰胺加样缓冲液(Sambrook等，1989)的试管中而猝灭。将样品在12％的变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并在-80℃放射自显影过夜。
培养条件和DNAzymes转染 原始大鼠大动脉SMCs得自细胞应用公司，并将其在含有10％胎牛血清(FBS)，50ug/ml链霉素和50IU/ml青霉素的Waymouth’s培养基，pH7.4中，在37℃在5％CO2的湿润环境中生长。用于实验的SMCs在第3-7代之间。将大鼠幼仔SMCs(WKY12-22(如Lemire等，1994所述，以其全文并入参考))在相似条件下生长。将亚铺满(60-70％)的SMCs在无血清的培养基(SFM)中温育6小时，之后根据生产者的指导(Qiagen)用Superfect进行DNAzvme(或指定的反义ODN)转染(0.1μM)。在18小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4冲洗，之后在5％FBS中再一次转染。
Northern印迹分析 总RNA是用TRIzol试剂(Life Technologies公司)分离的，并将25μg RNA通过电泳分离，之后移至Hybond-N+膜(NEN-DuPont)。基本如前所述与α32P-dCTP标记的Egr-1或β肌动蛋白cDNA预杂交，杂交，并冲洗(Khachigian等，1995)。
Western印迹分析 将100mm平板中生长静止的SMCs(Nunc-InterMed)如上述用ED5或ED5SCR转染，并用5％FBS温育1小时。将细胞在冷的PBS，pH7.4中洗，并在150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％Triton X-100，5mM EDTA，1％抑肽酶，10ug/ml亮抑蛋白酶肽，1％抑酶肽和2mM PMSF中提取。将24μg蛋白质样品加样于10％变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并在PVDF尼龙膜(NEU-DuPont)上电印迹。将此膜在空气中干燥，之后用在含有0.05％(w∶v)Tween 20的PBS中的脱脂奶粉阻断。将此膜用Egr-1或Spl的兔抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)(1∶1000)温育，然后用HRP连接的小鼠抗兔Ig二级抗血清(1∶2000)温育。当使用小鼠单克隆c-Fos(Santa Cruz Biotechnology公司)时，用HRP连接的兔抗小鼠Ig进行检测。通过化学发光检测观测蛋白质(NEU-DuPont)。
细胞增殖分析 将96孔滴定平板(Nunc-InterMed)中生长静止的SMCs如上述用ED5或ED5SCR转染，然后在37℃暴露于5％FBS72小时。将细胞用PBS，pH7.4漂洗，经胰蛋白酶消化，并用自动Coulter计数器对悬浮液定量。
测定DNAzyme稳定性 DNAzymes是用γ32P-dCTP在5’末端标记的，并通过离心与游离标记分离。将放射标记的DNAzymes在5％FBS或无血清的培养基中，在37℃温育指定的时间。将反应等份通过移至含有甲酰胺加样缓冲液(Sambrook等，1989)的试管中猝灭。将样品上样于12％变性的聚丙烯酰胺凝胶中，并在-80℃放射自显影过夜。
SMC创伤分析 将分室玻片(Nunc-InterMed)中铺满的生长静止的SMCs暴露于ED5或ED5SCR 18小时，之后用无菌牙签单一刮削。将细胞用丝裂霉素C(Sigma)(20uM)处理2小时，之后进行创伤(Pitsch等，1996；Horodyski&Powell，1996)。在创伤后72小时，将细胞用PBS pH7.4洗，用甲醛固定，然后用苏木精-伊红染色。
大鼠动脉结扎模型及分析 将体重为300-350g的成熟雄性Sprague Dawley大鼠用氯胺酮(60mg/kg，i.p.)和甲苯噻嗪(8mg/kg，i.p.)麻醉。通过正中颈部切口将右侧颈动脉暴露至颈动脉分叉处。用6/0规格的不可吸收的缝合线在最接近分叉处结扎颈动脉，确保远侧血流停止。在4℃将含有500ug DNAzymes(在DEPC处理的水中)，lmM MgCl2，30ul转染剂(Fugene 6)和Pluronic凝胶P127(BASF)的200ul溶液，用于每组5只大鼠的距结扎处最近12-15mm周围的血管中。这些制剂在37℃不抑制凝胶的固化。3天后，再次施用有或无500ug DNAzymes的载体。在结扎18天后，通过致死注射苯巴比妥将动物处死，并用10％(v∶v)甲醛在120mm Hg灌注固定。然后将两侧的颈动脉均切下并置于10％甲醛中，切成2mm长并包埋于3％(w∶v)琼脂糖中，之后在石腊中固定。从结扎点开始沿着血管以250um间隔制备5um的切片，并用苏木精和伊红染色。用定制的软件程序包(Magellan)(Halasz&Martin，1984)数字化确定每只大鼠的5个连续切片的新内膜和基膜区域，并以每组5只大鼠的平均比率表示。
结果和讨论将在原始DNAzymes设计(Santoro和Joyce，1997)中的15ntDNAzymes催化性结构域两侧的7×7nt的臂，通过每个臂延伸2nt以改良特异性(L.-Q.Sun，数据未示出)(图6)。将此分子的3’末端用倒位的3，-3’连接的胸苷(T)加帽，以授予对3’-→5’外切核酸酶消化的抗性。在ED5的两个臂中的序列是混杂的(SCR)，不改变催化性结构域，产生DNAzyme ED5SCR(图6)。
将由与NGFI-A mRNA的805-827位nt匹配的23nt组成的合成的RNA底物(图6)用于确定ED5是否具有裂解靶RNA的能力。ED5在10分钟内裂解32P-5’末端标记的23-mer部分(数据未示出)。12-mer产物相当于A(816)-U(817)接头与底物的5’末端之间的长度(图6)。相反，ED5SCR对这种合成底物没有可证实的作用。特异性ED5催化通过这种DNAzyme的人等价物(hED5)在宽范围化学计量比率不能裂解大鼠底物而得以进一步证实(数据未示出)。施用ED5SCR获得相似的结果(数据未示出)。hED5在其杂交臂的18个nt中的3个nt不同于大鼠ED5序列(表2)。然后确定ED5对天然NGFI-A mRNA的32p标记的206nt片段的催化作用，所述片段是通过体外转录制备的。裂解反应产生两个放射标记的163nt和43nt长度的产物，与在A(816)-U(817)接头的DNAzyme裂解一致。在另一实验中，ED5还以特异性和依赖于时间的方式裂解一种长度为l960nt的32P标记的NGFI-A转录物(数据未示出)。
表2mRNA中DNAzyme的靶位点ED5或hED5的18nt臂与大鼠NGFI-A或人EGR-1(及其它转录因子)的mRNA之间的相似性以百分率表示。NGFI-A mRNA中ED5的靶序列是5’-807-A CGU CCG GGA UGG CAG CGG-825-3’(SEQID NO22)(大鼠NGFI-A序列)，EGR-1中hED5的序列是5’-262-U CGU CCA GGA UGG CCG CGG-280-3’(SEQ ID NO23)(人EGR-1序列)。黑体字核苷酸表示大鼠和人序列之间的错配。数据是用得自基因库和EMBL的序列，在ANGIS中通过缺口最佳适合搜索而获得的。Spl和c-Fos的大鼠序列还未报道。基因 登记号 18个nt上的最佳同源性(％)ED5hED5大鼠NGFI-A M18416 10084.2人EGR-1X52541 84.2 100小鼠SplAF022363 66.7 66.7人c-FosK00650 66.7 66.7小鼠c-Fos X06769 61.1 66.7人Spl AF044026 38.9 28.9为确定DNAzymes对NGFI-A mRNA的内源性水平的作用，将生长静止的SMCs暴露于ED5，之后用血清刺激。Northern印迹和光密度分析表明，ED5(0.1uM)将血清诱导的稳态NGFI-A mRNA水平抑制55％(数据未示出)，而ED5SCR无此作用(数据未示出)。ED5在蛋白质水平抑制NGFI-A合成的能力通过Western印迹分析确定。NGFI-A蛋白的血清诱导受ED5抑制。相反，ED5SCR和EDC对NGFI-A的诱导均无任何影响，EDC是一种携带与ED5和ED5SCR相同的催化性结构域的DNAzyme，但侧翼为无义臂。ED5不能影响组成型表达的结构相关的锌指蛋白Spl的水平(图7)，其也不能阻断立即早期基因产物c-Fos的血清诱导(图7)，c-Fos的诱导与NGFI-A一样，依赖于其启动子中的血清应答因子和由胞外信号调节激酶介导的磷酸化(Treisman，1990，1994和1995；Gashler&Sukhatme，1995)。综合这些发现表明，ED5以基因特异性和序列特异性方式抑制NGFI-AmRNA和蛋白质产生的能力，这与其在NGFI-A mRNA的靶位点和其它mRNA之间缺乏明显同源性相一致(表2)。
接下来确定ED5对SMC复制的作用。将生长静止的SMCs用DNAzyme温育，之后暴露于血清，并在3天后确定细胞数目。ED5(0.1μM)将血清刺激的SMC增殖抑制70％(图8a)。相反，ED5SCR不能影响SMC生长(图8a)。AS2，一种在1μM能抑制SMC生长的反义NGFI-A ODN，在较低浓度不能抑制增殖(图8a)。另外的实验表明ED5也阻断血清诱导的3H胸苷掺入DNA中(数据未示出)。ED5抑制不是细胞死亡的结果，因为观测到形态学未发生改变，及在存在血清的情况下掺入锥虫蓝的细胞比例不受DNAzyme影响(图8b)。
得自2周龄大鼠(WKY12-22)主动脉的培养的SMCs，其形态学和表型与得自囊损伤的大鼠动脉新生内膜的SMCs相似(Seifert等，1984；Majesky等，1992)。WKY12-22细胞和新生内膜细胞的上皮表观，与得自正常静止基膜的SMCs的延伸的两极性质相反(Majesky等，1988)。WKY12-22细胞比基膜SMCs生长得更迅速，及过表达大量生长调节分子(Lemire等，1994)，如NGFI-A(Rafty&Khachigian，1998)，与“合成”表型一致(Majesky等，1992；Campbell&Campbell，1985)。ED5将血清诱导的WKY12-22增殖弱化将近75％(图8c)。令人惊奇地，ED5SCR没有抑制作用，其表现为刺激生长(图8c)。锥虫蓝排除表明DNAzyme抑制不是胞毒性的结果(数据未示出)。
为确保ED5和ED5SCR的生物学作用中的不同不是胞内定位不相似的结果，将两种DNAzymes用异硫氰酸荧光素(FITC)在5’末端标记，并与SMCs温育。通过荧光显微镜观测表明FITC-ED5和FITC-ED5SCR均主要位于核内。在此细胞区室中的点荧光是非DNAzyme序列依赖性的。尽管强度较弱，但在细胞质中也观测到荧光。未暴露于DNAzyme的培养物示出没有自身荧光的迹象。
将这两种分子均用γ32P-dATP在5’末端标记，并在培养基中温育，以确定对ED5和ED5SCR的细胞应答是否是DNAzyme稳定性不同的结果。32P-ED5和32P-ED5SCR即使在48小时后仍保持完整(数据未示出)。与携带3’倒位T的32P-ED5相反，携带正确方向3’T的32P-ED5的降解在早如1小时就观测到。暴露于无血清培养基即使在48小时后也不产生分子降解(数据未示出)。这些发现表明DNAzyme中3’碱基的反转方向保护分子免于被血清成分核溶解性裂解。
对培养物中SMCs进行物理损伤导致从伤口边缘向外迁移及在裸露区增殖。我们通过将生长静止的SMCs暴露于DNAzyme或丝裂霉素C(一种增殖抑制剂，Pitsch等，1996；Horodyski&Powell)，之后刮削，从而确定ED5是否能介导对损伤的这种应答。没有DNAzyme的培养物在3天内全部裸露区重新恢复。ED5即使在6天后仍然抑制对损伤的这种修复应答，并防止在此区域内另外生长(数据未示出)。ED5SCR在此系统中无作用进一步表明由ED5所致的序列特异性抑制。
ED5对新生内膜形成的作用在大鼠模型中进行评价。在距离分叉处最近的右侧颈动脉进行完全结扎，导致SMCs从基膜迁移至内膜，增殖最终导致新生内膜形成(Kumar&Lindner，1997；Bhawan等，1977；Buck，1961)。在结扎18天后内膜的厚度被ED5抑制50％(图9)。相反，其混杂的配对物(图9)或载体对照物(图9)对新生内膜形成均不具有作用。这些发现表明ED5在血管腔中以特异性方式抑制SMC积聚的能力，并说明抗抑制仅是“质量作用”的结果(Kitze等，1998；Tharlow等，1996)。ED5对可诱导的NGFI-A蛋白表达和内膜增厚的序列特异性抑制，在大鼠颈动脉囊性损伤模型中也观测到(Santiago等，1999a)。
另外的实验证明了hED5裂解(人)EGR-1 RNA的能力。hED5以计量依赖性方式在宽范围化学计量比率裂解其底物。hED5还以时间依赖性方式裂解，而其混杂的配对物hED5SCR不具有这种催化性质(数据未示出)。
本发明所报道的反义EGR-1策略的特异性生长抑制性质，提示EGR-1抑制剂可以用于治疗血管疾病，包括不适当的SMC生长，内皮细胞生长和肿瘤生长。实施例3使用DNAzymes抑制恶性细胞生长材料和方法将HepG2细胞常规生长于DMEM，pH7.4中，该培养基中含有补加抗生素的10％胎牛血清。将细胞用胰蛋白酶消化，再悬浮于生长培养基中(至10000个细胞/200μl)，并将200μl移至无菌的96孔滴定板中。2天后，除去180μl培养上清，将细胞用PBS，pH7.4冲洗，并再添加180μl无血清培养基。6小时后，在含有无血清培养基的试管中，用FuGENE6以1∶3比率(μg∶μl)进行DNAzyme第一次转染(2μg/200μl孔，终浓度0.75μM)。在室温温育15分钟后，将180μl培养上清用180μl新的转染混合物更换，但这次是在5％FBS培养基中。3天后，将细胞用PBS，pH7.4冲洗，并通过在100μl胰蛋白酶一EDTA中经胰蛋白酶消化而再悬浮。将细胞摇动大约5分钟，以保证细胞是悬浮的。将全部悬浮液置于10ml Isoton II中。通过将Isoton II溶液从试管抽吸到孔中反复多次，以保证所有细胞均转移。只使用Isoton II，确定背景细胞数。将每个样品均计数3次，并计算平均值和每个平均值的标准误差。结果和讨论我们的结果表明在3天后血清刺激HepG2细胞增殖(图10)。增殖几乎被0.75μM的DzA(5’-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO3)，大写字母是催化性部分)完全抑制，DzA是一种定向于人EGR-1 mRNA的DNAzyme(臂与189-207位核苷酸杂交)(图10)。相反，HepG2细胞生长不受ED5SCR抑制(图10)。Western印迹分析表明DzA在HepG2细胞中强有力地抑制EGR-1表达，而具有不同序列的大小匹配的DNAzyme(5’-tcagctgcaGGCTAGCTACAACGActcggcctt)(SEQ ID NO24)无此作用(数据未示出)。这些数据表明这种人恶性细胞系模型的诱导增殖可以被EGR-1DNAzymes阻断。这些发现提示EGR抑制剂可以临床用于定向人体癌症的治疗策略。
本领域技术人员意识到在不偏离所述本发明精神和范围的情况下，对本发明可以加以各种变化和/或修改。因此本发明的实施方案只是例证而无限制之意。在本说明书中引用了许多出版物，这些出版物的内容并入本说明书中，以更充分地阐述本发明所属的技术领域。
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1.一种治疗肿瘤的方法，该方法包括为需要治疗的对象施用抑制EGR诱导的制剂、降低EGR表达的制剂或降低EGR的核累积或活性的制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述制剂抑制血管发生。
3.权利要求1或2的方法，其中所述制剂直接抑制肿瘤细胞增殖。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述肿瘤是固体肿瘤。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中EGR是EGR-1。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中EGR表达被降低。
7.权利要求6的方法，其中EGR的表达是通过使用EGR反义寡核苷酸而被降低。
8.权利要求7所述的方法，其中反义寡核苷酸具有选自以下一组的一种的序列(i) ACA CTT TTG TCT GCT(SEQ ID NO4)，and(ii)CTT GGC CGC TGC CAT(SEQ ID NO2).
9.权利要求6的方法，其中EGR的表达是通过一种序列特异性核酶裂解EGR mRNA而被降低。
10.权利要求6的方法，其中EGR的表达是通过使用定向针对EGR dsDNA的ssDNA而被降低，ssDNA分子的选择是使得其与dsDNA形成三螺旋。
11.权利要求6的方法，其中EGR的表达是通过使用核酸转录诱饵(decoy)抑制EGR基因的转录而被降低。
12.权利要求6的方法，其中EGR的表达是通过表达反义EGRmRNA而降低。
13.权利要求6的方法，其中EGR的表达是通过使用序列特异性DNAzyme裂解EGR mRNA而降低。
14.权利要求13的方法，其中所述DNAzyme包含(i)在嘌呤嘧啶裂解位点裂解mRNA的催化性结构域；(ii)与催化性结构域的5’末端相邻的第一个结合结构域；和(iii)与催化性结构域的3’末端相邻的第二个结合结构域，其中结合结构域与位于相当于SEQ ID NO15的168-332位核苷酸的EGR mRNA区域内的嘌呤嘧啶裂解位点两侧的两个区域充分互补，这样DNAzyme裂解EGR mRNA。
15.权利要求13或14的方法，其中催化性结构域具有核苷酸序列GGCTAGCTACAACGA。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中裂解位点选自(i)相当于198-199位核苷酸的GU位点；(ii)相当于200-201位核苷酸的GU位点；(iii)相当于264-265位核酸的GU位点；(iv)相当于271-272位核苷酸的AU位点；(v)相当于301-302位核苷酸的AU位点；(vi)相当于303-304位核苷酸的GU位点；(vii)相当于316-317位核苷酸的AU位点。
17.权利要求16的方法，其中裂解位点是相当于198-199位核苷酸的GU位点，相当于271-272位核苷酸的AU位点，或相当于301-302位核苷酸的AU位点。
18.权利要求16的方法，其中所述DNAzyme具有选自以下一组的序列(i) 5′-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO3)；(ii) 5′-tgcaggggaGGCTAGCTACAACGAaccgttgcg(SEQ ID NO6)；(iii)5′-catcctggaGGCTAGCTACAACGAgagcaggct(SEQ ID NO7)；(iV) 5′-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO8)；(V) 5′-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggacgt(SEQ ID NO9)；(Vi) 5′-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat(SEQ ID NO10)；(Vii) 5′-cagcggggaGGCTAGCTACAACGAatcagctgc(SEQ ID NO11)；和(viii)5′-ggtcagagaGGCTAGCTACAACGActgcagcgg(SEQ ID NO12)。
19.权利要求18的方法，其中DNAzyme具有序列5’-caggggacaGGCTAGCTACAACGAcgttgcggg(SEQ ID NO3)，或5’-gcggggacaGGCTAGCTACAACGAcagctgcat(SEQ ID NO10)。
20.权利要求18的方法，其中DNAzyme具有序列5’-ccgcggccaGGCTAGCTACAACGAcctggacga(SEQ ID NO8)或5’-ccgctgccaGGCTAGCTACAACGAcccggaag(SEQ ID NO9)。
21.权利要求13-19任一项的方法，其中DNAzyme的3’末端核苷酸残基在与催化性结构域的3’末端相邻的结合结构域中是倒位的。
22.权利要求1-21任一项的方法，还包含施用一或多种其它的抗癌剂。
23.一种抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法，这种方法包括将肿瘤细胞与抑制EGR诱导的制剂、降低EGR表达的制剂或降低EGR的核累积或活性的制剂接触。
24.一种通过在细胞中导入一种核酸分子而转化的肿瘤细胞，所述核酸分子包含或编码(i)抑制EGR诱导的制剂，(ii)降低EGR表达的制剂，或(iii)降低EGR的核累积或活性的制剂。
25.一种筛选抑制血管发生的制剂的方法，所述方法包括对一种推定的制剂的抑制EGR诱导、降低EGR表达或降低EGR的核累积或活性的能力进行测试。
全文摘要
本发明涉及治疗肿瘤的方法，该方法包括在需要治疗的个体中抑制血管发生，其特征在于通过给予该个体抑制EGR诱导的制剂、降低EGR表达的制剂或降低EGR的核累积或活性的制剂而抑制血管发生。本发明还涉及筛选抑制血管发生的制剂的方法。
文档编号A61P35/00GK1414865SQ00817821
公开日2003年4月30日 申请日期2000年10月26日 优先权日1999年10月26日
发明者莱翁·迈克尔·卡奇吉安 申请人:尤尼瑟驰有限公司