其余五种制剂 耐受45mg/kg剂量的脂质体奥沙利铂而无严重毒性迹象。
[°252]将脂质体奥沙利钼制剂（25mg/kg)、乐沙定（10，15mg/kg)和盐水每周给予具有 HT29人异种移植瘤的小鼠达三周。表2所示的六种脂质体奥沙利铂制剂产生严重毒性，而表 3所示的其他二十五种制剂耐受此给药水平。二十五种耐受的制剂中有二十四种产生肿瘤 体积显著小于盐水处理小鼠的肿瘤体积的效力(P〈〇.05)。这些二十四种脂质体奥沙利铂制 剂抑制肿瘤生长，产生25% (效果最大)至58% (效果最小）范围内的处理与对照肿瘤体积比 (%T/C)。与盐水处理相比，一种耐受的脂质体奥沙利铂制剂(MP-3796)没有显著抑制肿瘤 生长并产生81%的％了/(：。与盐水处理相比，每周给予10或15mg/kgIV剂量的乐沙定（比较细 胞毒性剂)三次仅在四个研究中有一个显著抑制肿瘤生长(p〈〇. 05)并产生53%至88%范围 内的％T/C。
[0253]表1.急性小鼠耐受分析
[0256] 表2.在具有肿瘤的小鼠中多剂量后严重毒性的制剂
[0257]
[0261] 3盐水处理的小鼠的平均肿瘤体积的统计比较，单向ANOVA，Neuman_Keuls事后检 验。ns =不显著。
[0262]使用EtOH稀释方法制备脂质体奥沙利铂制剂，所述EtOH稀释方法本质上是"被动" 的包封方法。满足几个特征的制剂可作为潜在的治疗、可注射材料。对于肠胃外施用，关键 的考虑因素是形成的囊泡的粒径。已发现肠胃外脂质体制剂的粒径最佳在80_120nm的范围 内。已报道，更大的粒径导致网状内皮系统(RES)吸收更多，而较小的颗粒倾向于稳定性较 差，易于释放包封物质。因此，在我们的选择过程中初始标准是产生体积平均尺寸在80-120nm的脂质体颗粒。
[0263] 囊泡的水性内部中的奥沙利铂的包封依赖于囊泡形成过程中EtOH中的脂质浓度 和水相中的奥沙利铂浓度。囊泡在处理过程中保留奥沙利铂的能力对于获得最大的包封率 是至关重要的。对加工完成后制剂的脂质浓度、总奥沙利铂含量和未包封的奥沙利铂进行 了分析。给出20至100的脂质奥沙利铂比例的那些制剂被视为可接受用于进一步的评估。给 出更高比例的那些表明奥沙利铂的保留在处理过程中严重受限，因此，获得的物质含有不 被认为足够用于有效使用的浓度的奥沙利铂。将分析后含有高水平的未包封的奥沙利铂的 制剂排除，因为这些制剂在储存时本质上是不稳定的，易于释放奥沙利铂。通常，具有含有〈 C14链长的脂肪酸的二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱或含有低胆固醇量的那些制剂没有包封足 够量的奥沙利铂。
[0264] 对具有20-100的药物脂质比例且尺寸在80_120nm的奥沙利铂制剂的奥沙利铂体 外释放进行了评价。体外释放法测试囊泡的热稳定性(37°C)并在两个pH值(5和7.4)评价制 剂。高的奥沙利铂释放表示脂质体不能保留奥沙利铂且过量释放表示稳定性差。在我们的 这些奥沙利铂制剂的测试过程中，我们观察到，在几种情况下，在较低的pH(5)下发生奥沙 利铂释放的较大(大于2X)差异。在二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱组分中含有至少一种不饱和 脂肪酸的组合物观察到最大的差异。未预料到该pH值敏感性;然而，这一观察结果的原因还 不清楚，其对性能有任何体内作用也不是显而易见的。许多制备的制剂显示相当缓慢的奥 沙利铂释放(在37°C经48hr〈5% )。缓慢释放的那些被视为在循环中保持恒定低水平的未包 封的奥沙利铂和可能显示最小毒性的潜在制剂。然而，缓慢释放的那些制剂可能不会在体 内提供充足的奥沙利铂生物利用度且可能表现出最小的效力。
[0265] 除了pH 5和7.4下的体外释放研究以外，还在90%胎牛血清(FBS)基质中在37°C在 血清蛋白和其他生物材料存在下评价奥沙利铂的释放。该释放测量旨在模拟潜在的体内释 放。奥沙利铂在I 7BS中的快速或突发释放将指示囊泡不能在延长的时间段中维持奥沙利铂 递送，而在循环中，尽管这未明确显示与体内奥沙利铂释放入循环直接相关。奥沙利铂在体 外(FBS介质）的快速释放的发生被视为制剂的消极方面且那些制剂在后续的体内研究中可 能导致更多成问题的毒性。体外显示缓慢释放(在37°C经48hr〈5%)的那些制剂被视为潜在 的低毒性材料;然而，不清楚释放速率(如体外所观察到的）是否将为效力(通过体内肿瘤生 长抑制所测定的）提供足够量的可用的奥沙利铂。通常，观察到脂肪酸链越短(DLPC)和胆固 醇的摩尔％ (基于总脂质)越低，奥沙利铂的释放增加。对于含有相等链长的脂肪酸的二-烷 基-甘油-磷脂酰胆碱，具有不饱和度的那些显示比完全饱和的对应物更大的奥沙利铂释放 速率。
[0266] 提供体积平均粒径为80_120nm的囊泡、包封率小于100(脂质与奥沙利铂）和经 48hrs显示〈25%的体外释放的奥沙利铂制剂被考虑用于体内研究。被认为是潜在的药物产 品的奥沙利铂制剂必须满足两个重要标准：
[0267] 1)所配制的奥沙利铂必须保留抑制肿瘤生长和与乐沙定相媲美的能力;和
[0268] 2)所配制的奥沙利铂相对于乐沙定不应显示额外的毒性，且优选地其相对于乐沙 定应显示有利的患者安全性。
[0269]使用小鼠的HT29人结肠直肠异种移植瘤模型来评价满足如上所述的体外标准的 制剂。
[0270]在45mg/kg(单剂量)或25mg/kg(3-弱剂量）的特定剂量下造成死亡或显著重量损 失的制剂被认为是有毒的。这些制剂包括低胆固醇、短链制剂C14)和含有D 0 P C或 DiPetPC的所有制剂。两种制剂均含有二-烷基-甘油-磷脂酰胆碱，其具有两个含有不饱和 度的脂肪酸链。这些制剂的毒性性质不能很好地理解并且是基于其体外特征不可预测的。 事实上，体外观察到的释放速率和获得的IC50值基本上与含POPC(具有不饱和度的单链）的 制剂相同，其在这些研究中耐受。
[0271 ]显示缓慢体外释放的所有制剂在以25mg/kg每周3次剂量后很少至无体重减轻都 是可以接受的。这包括所有包含含有大于C14的饱和脂肪酸链的二-烷基磷脂酰胆碱和含有 至少25% (摩尔％ )胆固醇的制剂。含有POPC和SOPC(具有一种饱和脂肪酸和一种不饱和脂 肪酸）的制剂以25mg/kg每周3次剂量也得到很少至无体重减轻的良好结果。虽然这种给药 方案是可耐受的，但未测定这些制剂的最大耐受剂量且对于每周3次剂量可能高于25mg/ kg。剂量的减少仍可提供效力而没有在25mg/kg下(每周3次剂量)产生不可接受的毒性的那 些制剂的毒性事件。测定乐沙定(奥沙利铂的商业制剂)具有10至15mg/kg的MTD(每周3次剂 量）。如从上述结果所判断，含有至少一种饱和脂肪酸且含有大于C14的链以及至少25重 量％的胆固醇的所有制剂均能达到乐沙定的167%水平下的奥沙利铂等效剂量水平。
[0272]在小鼠的HT29人结肠直肠异种移植瘤模型中评价满足可接受的体外标准的奥沙 利铂制剂的效力。作为比较纳入每个研究组的是作为对照的盐水和乐沙定(作为目前的金 标准）。显示效力（如通S%t/c所判断；处理的与盐水对照的肿瘤体积比）的那些制剂包括 显示具有大于乐沙定的安全性的所有制剂，只要含PEG的部分含有DSPE。含胆固醇锚定的 PEG的制剂在该模型中不显示效力。虽然在所有情况下都无统计学意义，但除胆固醇锚定的 PEG制剂和对以25mg/kg每周3次剂量表现出不可接受的耐受性的那些制剂外的所有制剂均 显示出与乐沙定的差异化。我们可以推出结论:含有具有两个饱和烷基链的PC部分的制剂 比含有一种不饱和链的那些(P0PC和S0PC)得到更高的％T/C。然而，这仅是未经统计学意义 验证的趋势。该趋势的一个例外是在含有饱和C20链的PC的情况下。该PC的较大效力(较低 的％1/〇是未预料到的，也不是基于任何体外研究或从它的任何物理/化学性质可预测的。 [0273]猜想奥沙利铂从囊泡中的释放对于生物活性是必要的且释放速率在肿瘤生长抑 制中起重要作用。上述制剂在体外所观察到的奥沙利铂释放速率的不同范围对体外释放与 体内活性的相关性提出重要问题。在体外给予高达20 %的释放速率(含有POPC)的制剂和低 至1-2% (DSPC、HSPC)的那些制剂均抑制肿瘤生长并给予低于（或统计分析等于）乐沙定 的％1/(：，而不会在小鼠中导致病态或不利的重量减轻。这些制剂如何产生作为体内奥沙利 铂释放的函数的效力尚未确定。如前面所概述的，已在体内广泛研究了奥沙利铂从P0PC:胆 固醇:DSPE-PEG(2000)制剂(MP-3628)中的释放，并已证实循环中奥沙利铂的延长释放曲 线。因此，本文提供一组制剂，其比乐沙定更可耐受，同时维持至少相当的（如果不大于）乐 沙定的效力。这组制剂包括：
[0274] 1)具有至少一个长度大于C14的饱和脂肪酸链的PC
[0275] 2)具有两个长度大于C14的饱和脂肪酸链的PC
[0276] 3)具有一个含有一个不饱和键且长度大于C14的脂肪酸链的PC
[0277] 4)制剂中含有至少25mole%的胆固醇
[0278] 5)小于 7.5mole% 的 PEG 化 PC
[0279]令人惊讶的是，在所有胆固醇水平下使用DOPC似乎引起比相应的POPC系列大的毒 性。还令人惊讶的是，使用具有缓慢体外释放曲线（即，DSPC和HSPC)的制剂将显示效力，尤 其是二C20PC制剂所见的不寻常的高效力(低％T/C)。
[0280]虽然为了清楚和理解的目的，已通过说明和实例的方式详细地描述了上述发明， 但本领域技术人员应理解，可在所附的权利要求的范围内进行某些改变和修饰。此外，本文 提供的各参考文献通过引用整体并入，如同各参考文献通过引用各自并入一样。
【主权项】
1. 用于治疗癌症的组合物，其包含： (a) 基本上由约50mol%至约70mol%的磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物、约 25mo1 %至约45mo1 %的胆固醇和约2mo1 %至约8mo1 %的PEG-脂质组成的两性离子脂质体； 和 (b) 奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1的量包 封在所述脂质体中； 其中所述磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物具有14个碳原子或更多的脂肪酸 链，并且两个脂肪酸链中不多于一个是不饱和的。2. 权利要求1的组合物，其中奥沙利铂以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约 30:1至约45:1的量包封在所述脂质体中。3. 权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物不是氢化 大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或不是包含HSPC的混合物。4. 权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质或磷脂酰胆碱脂质混合物具有15个 碳原子或更多的脂肪酸链。5. 权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质选自棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、 二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC)、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱（SOPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)〇6. 权利要求1的组合物，其中所述磷脂酰胆碱脂质为P0PC。7. 权利要求1的组合物，其中PEG-脂质为二酰基-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二 醇)]。8. 权利要求1至7中任一项的组合物，其中PEG-脂质选自二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000](DSPE-PEG-2000)和二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙 二醇）-5000 ] (DSPE-PEG-5000)。9. 权利要求1的组合物，其中两性离子脂质体包含约55mol%P0PC、约40mol%胆固醇和 约 5mo1 %DSPE-PEG(2000)。10. 权利要求1的组合物，其中两性离子脂质体包含约65mo1 %P0PC、约30mo1 %胆固醇 和约 5mo1 %DSPE-PEG(2000)。11. 权利要求9或权利要求10的组合物，其中总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约 50:1〇12. 权利要求9或权利要求10的组合物，其中总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约 30:1 至约 35:1。13. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体具有约75至约125nm的平均粒径。14. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体具有约90nm的平均粒径。15. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体通过包括以下步骤的方法制备： a) 形成脂质溶液，该脂质溶液包含磷脂酰胆碱脂质、胆固醇、PEG-脂质和选自Ch烧醇 和&-4烷醇/水混合物的溶剂； b) 将脂质溶液与水性缓冲液混合以形成多层囊泡(MLV);和 c) 通过多孔过滤器挤出MLV以形成小单层囊泡(SUV); d) 渗滤以从脂质体制剂中除去未包封的奥沙利铂； 由此形成所述两性离子脂质体。16. 权利要求15的组合物，其中奥沙利铂的包封通过在MLV形成期间将奥沙利铂包括在 水性缓冲液中来进行。17. 权利要求15的组合物，其中所述方法进一步包括： e)无菌过滤所述两性离子脂质体。18. 治疗癌症的方法，所述方法包括向需要其的受试者给予权利要求1至17中任一项的 组合物。19. 权利要求18的方法，其中所述癌症为选自膀胱癌、结肠直肠癌、胃癌、食道癌、非小 细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的实体瘤癌症。20. 权利要求18的方法，其中所述组合物包含： a) 基本上由55mol%P0PC、40mol%胆固醇和5mol%DSPE-PEG(2000)组成的两性离子脂 质体;和 b) 奥沙利铂，其以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约50:1的量包封在所述脂 质体中。21. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体:HSPC/Chol/ DSPE-PEG(2000)，65/30/5;P0PC/Chol/DSPE-PEG(2000)，65/30/5jPDPPC/Chol/DSPE-PEG (2000)，65/30/5 脂质体。22. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体:POPC/Chol/ DSPE-PEG(2000),50/45/5；PSPC/Chol/DSPE-PEG(2000),50/45/5；DiC20PC/Chol/DSPE-PEG (2000)，50/45/5;HSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5;DPPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/ 45/5;DSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，50/45/5;和SOPC/Cho1/DSPE-PEG(2000)，50/45/5脂质 体。23. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体:P0PC/Chol/ DSPE-PEG(2000),70/25/5；PSPC/Cho1/DSPE-PEG(2000),70/25/5；HSPC/Chol/DSPE-PEG (2000)，70/25/5;DSPC/Chol/DSPE-PEG(2000)，70/25/5;和SOPC/Chol/DSPE-PEG(2000)， 70/25/5脂质体。24. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为选自以下的脂质体:P0PC/Chol/ DSPE-PEG(2000)，60/35/5;PSPC/Cho1/DSPE-PEG(2000)，60/35/5;HSPC/Chol/DSPE-PEG (2000),60/35/5；DSPC/Chol/DSPE-PEG(2000),60/35/5；DPPC/Chol/DSPE-PEG(2000),60/ 35/5;DiC20PC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5;和S0PC/Chol/DSPE-PEG(2000)，60/35/5脂 质体。25. 权利要求1的组合物，其中所述两性离子脂质体为POPC/Chol/DSPE-PEG(5000)，65/ 30/5脂质体。
【专利摘要】本发明提供用于治疗癌症的组合物，其包括基本上由50-70mol％的磷脂酰胆碱脂质、25-45mol％的胆固醇和2-8mol％的PEG-脂质组成的两性离子脂质体；和奥沙利铂。奥沙利铂以使得总脂质重量与奥沙利铂重量的比例为约20:1至约65:1的量包封在所述脂质体中。还公开了用于制备脂质体奥沙利铂和治疗癌症的方法。
【IPC分类】A61K9/127, A61K31/282
【公开号】CN105451720
【申请号】CN201480026494
【发明人】W·麦吉
【申请人】马林克罗特有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年3月12日
【公告号】CA2903234A1, EP2968144A1, US20140271820, WO2014159760A1