用于治疗和/或护理皮肤、粘膜和/或指甲的外泌多糖的制作方法
【专利说明】用于治疗和/或护理皮肤、粘膜和/或指甲的外泌多糖 发明领域
[0001]本发明涉及抑制神经元胞吐作用且刺激成纤维细胞增殖的外泌多糖(EPS)。所述 外泌多糖由具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属(Vibrio sp)的物种分泌。本发明还涉及这种 在化妆品或皮肤用药物组合物中的外泌多糖在治疗和/或护理皮肤、粘膜、毛发和/或指甲 中的用途。
[0002] 背景
[0003] 用于预防和减少皱纹、特别是面部皱纹的化妆品行业中的策略之一在于施用通过 抑制该区域中神经元胞吐作用阻断肌肉收缩的化合物。牵涉表情线的形状的主要肌肉是围 绕眼和睫毛的那些、额、唇、嘴、颊和颈肌上的那些。这些肌肉在面部的皮下连接额部中发 现，它们从其中升至皮肤并且使其插入表皮层的最深部。其收缩可以导致皮肤隆起、压缩或 缓慢运动。早期皱纹的形状是皮肤衰老和正在衰老的最具有特征性的征兆。
[0004] 自从上世纪九十年的10年以来，注入肌肉毒素肉毒梭菌（Cl ostridium botulinum)(作为B〇t〇X?^AlIergan销售)在减少肌肉收缩和治疗例如张力失调和/或疼 痛这样的相关疾病的用途已经广泛传播。神经毒素注射也用于治疗和/或护理皮肤，目的在 于减轻、延迟或预防衰老和/或光老化征兆，且特别是松弛面部表情并且减少皱纹形成或将 其出现减少到最低限度。其作用机制基于阻断神经肌肉接点上的轴突的突触前末梢中的乙 酰胆碱释放，由此避免神经传导和肌肉收缩。该毒素结合突触前膜中的受体、被胞质摄入并 且通过胞质。其活性负责打断突触泡蛋白、SNAP-25和突出融合蛋白的三分子SNARE复合物， 这避免了突触小泡结合质膜和乙酰胆碱释放至神经间隙。受控施用肉毒毒素已经用于治疗 广泛的病症、障碍和疾病，例如出汗和多汗(US 6974578 B2和US 6683049 B2)、不同的皮肤 障碍和疾病例如皮肤胼胝、疣、溃疡和损害(US 8048423 B2、US 2011/206731)、银肩病和皮 炎(US 5670484 A)、血管高反应性和酒渣鼻(W0 2010/114828)、痤疮(W0 03/011333)、毛发 生长和维持（US 6299893 B1)、面部皱纹（US 7255865B2)、眉毛和前额下垂（US 2011/ 280978)或下垂的口角（US 6358917 BI)以及不同类型的疼痛和炎症（US 2010/266638、US 7811586 B2、US 7704524 B2、US 7704511 B2、US 7468189 B2、US 7255866 B2、US 7091176 B2、US 6887476 B2、US 6869610 B2、US 6838434 B2、US 6641820 B2，US 6623742B2、US 6565870 B1、US 6500436 B1、US 6458365 B1、US 6423319 B1、US 6113915 A、US 5714468 A和US 6063768 B2)等。
[0005] 然而，肉毒毒素中固有的毒性导致其以宽泛剂量施用造成不期望的副作用，例如 免疫源应答、头痛、恶性、麻痹或肌无力、呼吸衰竭，且在更极端的情况中甚至导致所治疗的 受试者死亡[FDA News，2008年2月8 日，"FDA Notifies Public of Adverse Reactions Linked to Botox Use" ；Cote，T.R.等人"Botulinum toxin type A injections：Adverse events reported to the US Food and Drug Administration in therapeutic and cosmetic cases" J.Amer.Acad.Derm. 2005，53(3)，407-415]。这些严重的副作用与高治疗 成本一起严重地制约了肉毒毒素以治疗或美容为目的的应用，这归因于长期应用和/或存 在不适合其治疗的疾病。因此，迫切需求研发模拟肉毒毒素的麻痹效应、而配有非常简单和 更稳定的分子结构的分子，其不会诱导免疫反应且其生产成本是可承受得起的。肽性质的 分子满足这些特性。
[0006] 皱纹与真皮中的多种生物学改变相关。在真皮中，存在真皮成纤维细胞数量减少， 它们产生胞外基质的不同成分，其负责皮肤的坚实度和弹性和恢复皮肤的机械性能。
[0007] 在伤口愈合过程中，存在几种另外的过程，它们有助于皮肤再生并且还可以用于 抗皱治疗。在愈合过程中，存在细胞增殖和迀移的增加 [Grose等人，"A crucial role of β I integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair"，Development ·，2002,2303-2315]，这有助于表皮细胞再生，从而恢复(revertint) 与年龄相关的表皮厚度减少[Varani等人，"Vitamin A Antagonizes Decreased Cell Growth and Elevated Collagen-Degrading Matrix Metalloproteinases and Stimulates Collagen Accumulation in Natural Iy Aged Human Skin''， J· Invest .Dermatol ·，2000,114，480-486]，且更特别地在皱纹更频繁出现的区域（眼、前 额、鼻颊(nasogenian)区等区域周围）中观察到。此后，在愈合过程中，存在成纤维细胞增殖 的增加，它负责进行胞外基质的合成，也有助于减少皱纹。
[0008] 自从20世纪70年代以来，外泌多糖的存在是已知的，它们由生活在因其极端条件 而为人所知的生态系统中的细菌物种产生。由生活在这些生态系统中的细菌产生胞外多糖 主要与存活功能有关(Ragugngs 等人 J Appl Microbiol·，1997年4 月，82(4) :422-30)。
[0009] 在化妆品领域中，外泌多糖已经广泛应用，主要作为胶凝剂和/或调质剂 (texturizing agent)，添加到终产品中。现有技术中已知一些外泌多糖类广泛应用于化妆 品和/或皮肤药物目的，例如描述于专利EP0534855B1中的假单胞菌属(Pseudomonas)细菌 菌株产生的外泌多糖，其用作增稠剂、胶凝剂和/或调质剂。专利申请FR2871476A1描述了产 生已经显示用作愈合剂的用途的外泌多糖的互生平胞菌属(Alteromonas)的热液起源的 GY785菌株;专利EP0987010B1描述了改善皮肤防御系统的由热液起源的嗜常温菌产生的一 种外泌多糖，并且专利申请US2010/009931描述了用作绷紧剂(tensing agent)还改善皮肤 紧实度、弹性以及张力的由紫球藻属(Porphyridium)微藻菌株产生的外泌多糖。类似地，专 利申请US2009/069213A1公开了产生一种显示抗皱纹和水合特性的多糖的紫球藻属物种微 藻菌株。此外，专利US6344346B1描述了具有由根瘤菌属(Rhizobium)细菌分泌的天然多糖 引起的水合特性的化妆品组合物。
[0010]对皮肤具有很多优点的另一种外泌多糖是已经被证明描述于申请W02009/127057 中的、由表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)或金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)的细菌物种的菌株产生的外泌多糖。在应用这种外泌多糖的化 妆品组合物之后，角质层提取物的水合作用和形态学得到改善，并且发生皮肤的脱皮。 [0011]此外，应提及专利申请JP2003-313131，因为它描述了互生平胞菌属物种的菌株 SN-1009(FERM BP-5747)产生的、具有抗皱纹特性的硫酸多糖。
[0012]最后，申请WO 20 1 2 /0 7 2 24 5描述具有水合特性的假交替单胞菌属 (Pseudoal teromonas)物种的菌株产生的外泌多糖，且专利申请P2012-30432公开了弧菌属 物种的菌株产生的外泌多糖，其刺激皮肤细胞中透明质酸产生。
[0013]出人意料地，本发明申请人已经发现由弧菌属物种的非热液细菌菌株分泌的一种 新的外泌多糖的活性，根据布达佩斯条约（Budapest Treaty)在编号CNCM 1-4239下保藏， 其抑制神经元胞吐作用并且预防和/或减少皮肤皱纹，且还刺激成纤维细胞增殖和增加皮 肤坚实度。
[0014]发明详述
[0015] 本发明涉及由具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属物种的细菌菌株分泌的外泌多糖 的化妆品和/或皮肤药物用途。出人意料地，本发明的发明人已经发现上述外泌多糖抑制神 经元胞吐作用且刺激成纤维细胞增殖。特别地，神经元胞吐作用的抑制减少和/或预防皮肤 皱纹，且刺激成纤维细胞增殖、增加皮肤坚实度。
[0016]
[0017] 为了促进本发明的理解，一些术语和表述的含义，正如在本发明的上下文中所使 用的，被包括在内。
[0018] 在本发明的上下文中，"皮肤"被理解为包括它的多个层，从最上层或角质层至最 下层或皮下组织都包含在内。这些层由不同类型的细胞如角质形成细胞、成纤维细胞、黑色 素细胞和/或脂肪细胞等等组成。在本发明的上下文中，术语"皮肤"包括头皮。
[0019] 本说明书上下文中使用的术语"治疗"在未附带限制"美容、非治疗"时是指施用本 发明的化合物以缓解或消除疾病或障碍或与这种疾病或障碍相关的一种或多种症状。术语 "治疗"还涵盖缓解或消除疾病或障碍的生理学后果的能力。
[0020] 当术语"治疗"附带限制"美容、非治疗"时是指将所述化合物应用于皮肤、毛发和/ 或粘膜，特别是目的在于改善皮肤、毛发和/或粘膜的美容质量，例如、但不限于其水化水 平、弹性、坚实度、光泽、品质或纹理等。本发明中的术语"护理"是指维持皮肤、毛发和/或粘 膜的质量。这些质量通过在健康受试者以及那些存在皮肤和/或粘膜疾病和/或障碍的那些 受试者中的化妆品处理和/或皮肤、毛发和/或粘膜护理得以改善或维持，所述疾病和/或障 碍例如、但不限于皮肤上的溃疡和损害、银肩病、皮炎、痤疮或酒渣鼻等。
[0021] 本发明中使用的术语"预防"是指本发明化合物预防、延迟或阻止疾病或障碍在其 出现前的出现或发生的能力。
[0022]在本发明的上下文中，术语"衰老"指随着年龄(慢性衰老（chronoaging))或通过 暴露于阳光(光老化)或环境因素如烟草烟雾、冷、热或风的极端气候条件、化学污染剂或污 染物所经历的皮肤变化，并且包括所有的外部可见和/或通过触摸可察觉的变化，例如但不 限于皮肤不连续性的产生，如皱纹(wrinkle)、细纹(fine line)、沟纹(furrow)、不规则性 (irregularity)或粗糙(roughness)、毛孔尺寸增加、弹性丧失、紧实度丧失、平滑度丧失、 从变形中恢复的能力的丧失、皮肤下垂如脸颊下垂、眼下眼袋的出现或双下巴的出现，等 等，皮肤颜色的改变，如斑点、发红、眼下眼袋或色素沉着过度区域的出现(如老年斑或雀斑 等等），异常分化，角化过度，弹性组织变性，角化病，脱发，桔皮样外观（orange-peel skin)，真皮、表皮、血管系统或靠近皮肤的那些组织的、角质层的、胶原蛋白结构的丧失和 其他组织学改变(例如蜘蛛痣或毛细血管扩张的出现），等等。术语"光老化"将由于导致皮 肤的过早衰老并且出现与衰老相同的物理特征的延长的皮肤紫外辐射暴露的一系列过程 归为一类，这些特征例如但不限于，肌肉松弛、下垂、颜色改变或色素沉着的不规则性、异常 和/或过度角化。
[0023]产生本发明中的胞外多糖的菌株依照布达佩斯条约于2009年9月4日保藏在国立 微生物保藏中心（"Collection Nationale de Culture de Microorganismes" [National Microorganism Culture Collection]) (CNCM)，巴斯德研究所（Pasteur Institute)， 28rue du Docteur Roux，75724巴黎，法国，在代码CNCM 1-4239下。
[0024] 因此，本发明的第一方面涉及用于皮肤、粘膜、头发和/或指甲的治疗和/或护理的 具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属(Vibrio sp.)物种的菌株的胞外多糖。特别地，治疗涉及 治疗和/或预防疼痛、炎症、瘙痒或多汗，或使皮肤和/或粘膜的上皮再生和/或愈合治疗。
[0025] 在一个优选的实施方案中，疼痛选自与病症、疾病和/或障碍相关的疼痛，例如、但 不限于接触敏感性、对冷敏感、对热敏感、皮肤刺激、毛发去除后皮肤刺激、剃毛后皮肤刺 激、银肩病、敏感性皮肤、皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、尿布皮炎、脂溢性皮炎、湿疹、扁平 苔藓、烧伤、晒伤、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎、超敏反应、术后、强脉 冲光线疗法(IPL)后、用单色脉冲光(激光)处理后、用化学脱肩剂治疗后或过度暴露于外部 攻击性试剂治疗后的皮肤疼痛或刺激等。
[0026] 在另一个优选的实施方案中，炎症选自，例如、但不限于银肩病、敏感性皮肤、皮 炎、特应性皮炎、接触性皮炎、尿布皮炎、脂溢性皮炎、湿疹、酒渣鼻、痤疮、过度增生性皮肤 病、烧伤、晒伤、爪间鬃、术后、强脉冲光线疗法（IPL)后、用单色脉冲光(激光)处理后、用化 学脱肩剂治疗后或过度暴露于外部攻击性试剂治疗后的皮肤炎症、阴道粘膜炎症、口腔粘 膜炎症、牙龈炎、牙周炎、鼻炎、过敏性鼻炎等。