iogenesis and proliferation of endothelial cells'，， J. Cell Biol. 1999 ;274(13) :8455-8459]所述的方法替换每个孔中的培养基。用多孔平板 读出器（1420￥1(：1'01?2 46&6 13113(3)在人_ = 48511111和人(》= 53〇11111测定荧光。将增殖计算为： T/C X 100,其中T表示测试孔的吸光度，且C表示对照孔的吸光度。
[0092]本试验中使用钙黄绿素-AM得到的结果如表2中所示：
[0095]表 2
[0096 ]实施例5:通过ELI SA作为检测方法对SNARE复合物形成的抑制作用的研究 [0097]由于目的在于用本发明的外泌多糖测定对SNARE复合物形成抑制作用的能力，所 以研究用该化合物与SNAP-25相比在有关这种复合物形成方面的竞争抑制作用。通过ELISA 技术、使用来自结合GST的复合物的蛋白质之一测定所形成的SNARE复合物比例。
[0098] 在96-孔培养板中，固定VAMP(使用0.037μΜ溶液），随后用BSA(牛血清白蛋白） (3 % )封闭游离空间。与该方法平行，测试结合GST (谷胱甘肽S-转移酶（611^&^〇113-transferase))(0.0185yM)的SNAP-25、突触融合蛋白（0·037μΜ)和具有保藏号CNCM 1-4239 的弧菌属物种菌株产生的外泌多糖(在lmg/mL、0.5mg/mL和0. lmg/mL)，温育1小时。
[0099]温育后，将样品转入固定了 VAMP的培养板，温育1小时，以允许形成SNARE复合物。 此后，洗涤培养板，用初级抗体抗-GST(抗体抗-GST表位TAG，Fisher目录号:PA1-982A)检测 该复合物。用TECAN GENios分光光度测量读出器在490nm波长读取吸光度。
[0100]为了有利于测试产品与形成SNARE复合物的蛋白质之一 (SNAP-25)的竞争，以等摩 尔浓度混合这种比例的蛋白质与其余的蛋白质。
[0101] 表3显示用本发明外泌多糖与SNAP-25对形成SNARE复合物的竞争性抑制的结果。 对复合物形成的抑制百分比与通过分光光度法检测的SNARE复合物的量成反比。
[0103]表3
[0104]实施例6:通过作为检测方法的电泳对SNARE复合物形成的抑制作用的研究 [0105] 将VAMP(6yM)、突触融合蛋白（6μΜ)和具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属物种菌株 产生的外泌多糖（lmg/mL和0. lmg/mL)温育3小时。在使用超纯水（18.2m Ω )形成复合物的阴 性对照中生成测试外泌多糖产生的相同稀释液。随后加入SNAP-25(0.6yM)，将该混合物再 温育15小时，以使SNARE复合物形成。温育后，加入加样缓冲液(Laemli样品缓冲液），用凝胶 SDS-PAGE在10%丙烯酰胺凝胶中分析该混合物。通过图像采集和分析软件测定复合物的 量。
[0106]表4显示对形成SNARE复合物的抑制结果。对复合物形成的抑制百分比与检测的 SNARE复合物的量成反比。
[0108]表4
[0109]实施例7:通过ELISA方法TPA/离子霉素在成神经瘤细胞中诱导的去甲肾上腺素释 放的定量
[0110] 使用TPA(12-0-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯)/离子霉素诱导去甲肾上腺素释放能 够直接测定神经元的胞吐作用。为了研究本发明外泌多糖对去甲肾上腺素释放的抑制作 用，将人神经母细胞瘤细胞系的细胞与具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属物种菌株产生的 外泌多糖一起预温育（IxlO6细胞/孔)60分钟，所述具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属物种 菌株产生的外泌多糖的测试浓度为2mg/mL、lmg/mL和0. lmg/mL。然后通过用动员胞内囊泡 (包含神经递质）的12-0-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA) IOOnM溶液预处理8分钟诱导去 甲肾上腺素神经递质释放，随后与TPA/离子霉素（ΙΟΟηΜ/ΙΟμΜ) -起温育5分钟，这诱导这些 囊泡中包含的神经递质释放。在通过针对去甲肾上腺素的特异性抗体介导并且通过基于碱 性磷酸酶反应的酶反应完成的试验中，通过ELISA(去甲肾上腺素 ELISA试剂盒，IBL国际参 考号RE59261)对释放入培养基中的神经递质的量进行定量，产生用Thermo Scientific Mu 11 i skan As cent仪器在405nm测定的可定量颜色吸光度信号。
[0111] 用本发明的外泌多糖阻断SNARE复合物导致对神经元胞吐的抑制作用，因此导致 释放的去甲肾上腺素水平降低(表5)。
[0113] 表5
[0114] 实施例8:具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属物种菌株分泌的外泌多糖的化妆品组 合物的制备
[0115] 用水[INCI:水(AQUA)]与磷酸氢二钠[INCI:磷酸二钠]、磷酸钠2-水合物[INCI:磷 酸钠]、2：6111找@丙二醇[1%1:丙二醇]、1)61*111(?〇我 @610￥[1从：1:辛酸甘油酯]和黄原胶 [INCI:黄原胶](相Cl的成分)制备具有保藏号CNCM 1-4239的弧菌属物种菌株分泌的外泌 多糖的1 %重量的溶液。
[0116] 另一方面，在适合的容器中，将水解物5 2/016020[INCI:戊二醇]和Microcare BNA [ INCI:苄醇]溶于纯水[INCI:水（AQUA)]。然后缓慢地加入Carbopol? U11reZ 10
[INCI:卡波姆]。在下一步中，在搅拌下加入Arlatone MAP，160K[ INCI:鲸蜡磷酸钾]，直到 其分散，将成分的混合物加热至70-75°C。该组成分构成A相。
[0117] 另外将来自相B的成分Finsolv-TN[ INCI: C12-15苯甲酸烷基酯]、Phytocream 2000[INCI:硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇、棕榈酰钾水解的小麦蛋白]、Massocare EC[INCI: 椰油酸乙基己酯]、苯氧乙醇[INCI:苯氧乙醇]醋酸维生素 E[INCI:醋酸生育酚]在70-75°C 溶解。一旦溶解，则在涡旋搅拌下缓慢地将它们加入到相A的成分的混合物中。
[0118] 将该混合物冷却至50°C，将Silicone dc 200[INCI:二甲硅油]与相Cl的成分一起 加入到A和B的成分的混合物中。
[0119] 在涡旋搅拌下，将Sepigel 305[INCI:水(AQUA)、聚丙烯酰胺、C13-14异链烷烃、聚 乙二醇单十二醚-7] (D相)加入到从不同相的混合物中得到的乳剂中。然后在涡旋搅拌下将 E相、香料Ocean 12720[ INCI:香精(香料）]加入到该混合物中。通过在搅拌下滴加氢氧化钠 [INCI:氢氧化钠](F相)将pH调整至6.0-6.5。
[0120] 得到的化妆品组合物的比例如表6中所示：
【主权项】
1. 具有保藏号CNC1-4239的弧菌属(Vibriosp.)菌株的外泌多糖，其用于治疗和/或 护理皮肤、粘膜、毛发和/或指甲。2. 根据权利要求1的外泌多糖，其中这种治疗和/或护理是疼痛、炎症、瘙痒或多汗症的 治疗和/或预防，或皮肤和/或粘膜的再生上皮化和/或愈合性治疗。3. 根据权利要求1-2任一项的外泌多糖，其中所述治疗抑制神经元胞吐作用。4. 根据权利要求1-2任一项的外泌多糖，其中所述治疗刺激成纤维细胞增殖。5. 具有保藏号CNC1-4239的弧菌属菌株的外泌多糖在美容、非治疗性治疗和/或皮肤、 粘膜、毛发和/或指甲的护理中的用途。6. 根据权利要求5的外泌多糖的用途，其中所述美容、非治疗性治疗和/或护理是皮肤 衰老的治疗和/或预防、皮肤皱纹的治疗和/或预防；皮肤坚实度缺失的治疗和/或预防；出 汗的治疗和/或预防；皮肤障碍的治疗和/或护理，所述皮肤障碍选疣、胼胝形成;治疗刺激 性毛发生长和/或预防脱发。7. 根据权利要求5-6任一项的外泌多糖的用途，其中所述美容、非治疗性治疗和/或护 理抑制神经元胞吐作用。8. 根据权利要求5-6任一项的外泌多糖的用途，其中所述美容、非治疗性治疗和/或护 理刺激成纤维细胞增殖。9. 根据权利要求1-4任一项的外泌多糖，其具有选自以下的化学修饰:磷酸化、磺化、酰 化、酯化、外泌多糖的金属配合物的形成和/或化学硫酸化。10. 根据权利要求1-4任一项的外泌多糖，其包含两种不同的中性单糖类和一种酸性单 糖。11. 根据权利要求1的外泌多糖，其中所述中性单糖类是N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰半乳 糖胺且所述酸性单糖是葡糖醛酸。12. 化妆品或皮肤药物组合物，其包含化妆品或皮肤药学有效量的根据权利要求1-4任 一项的外泌多糖和至少一种化妆品和/或皮肤药学上可接受的赋形剂、辅剂和/或成分。13. 根据权利要求12的化妆品或皮肤药物组合物，其中将外泌多糖掺入化妆品或皮肤 药学上可接受的递送系统或缓释系统中，所述化妆品或皮肤药学上可接受的递送系统或缓 释系统选自：脂质体、混合脂质体、油质体、类脂质体、短链醇类的磷脂脂质体、毫米粒、微 粒、纳米粒、固体脂质纳米粒、纳米结构的脂质载体、海绵状物、环糊精、囊泡、胶束、表面活 性剂的混合微胶粒、表面活性剂-磷脂混合微胶粒、毫米球、微球和纳米球、毫米囊、微囊、纳 米囊、微乳和纳米乳。14. 根据权利要求12-13中任一项的化妆品或皮肤药物组合物，其中这种组合物以一种 制剂存在，这种制剂选自：霜剂、复合型乳剂、溶液、液晶、无水组合物、无水组合物、水分散 体、油、乳液、香脂、泡沫、洗剂、凝胶、乳膏状凝胶、含水酒精溶液、水甘醇溶液、水凝胶、搽 剂、浆液、肥皂、洗发水、调理剂、浆液、多糖膜、软膏、摩丝、润发油、粉末、化妆棒、化妆笔和 喷雾剂或气雾剂。15. 根据权利要求12-14任一项的化妆品或皮肤药物组合物，其中所述的赋形剂、辅剂 和/或成分选自：神经元胞吐抑制剂、抗胆碱能药物、肌收缩抑制剂、抗衰老药物、抗皱纹剂、 止汗药、抗炎药和/或镇痛药、止痒药、镇静剂、麻醉药、抑制乙酰胆碱受体群集的活性剂、抑 制乙酰胆碱酯酶的活性剂、皮肤松弛剂、黑色素合成刺激剂或抑制剂、增白或脱色剂、色素 沉着促进剂、自晒黑剂、NO-合酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂、赖氨酰和/或脯氨酰羟化酶抑制 剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗大气污染剂、活性羰基类清除剂、抗糖化剂、抗组胺剂、 抗病毒药、抗寄生虫药、乳化剂、润肤剂、有机溶剂、液体推进剂、皮肤调理剂、保湿剂、保持 水分的物质、α羟基酸、β羟基酸、润肤霜、表皮水解酶、维生素、氨基酸、蛋白质、色素或着色 剂、染料、生物聚合物、胶凝聚合物、增稠剂、表面活性剂、软化剂、乳化剂、粘合剂、防腐剂、 能够减轻或治疗眼下眼袋的活性剂、去角质剂、角质剥离溶解剂、角质溶解药、抗微生物剂、 抗真菌药、抑真菌剂、杀菌剂、抑菌剂、刺激真皮或表皮大分子合成和/或能够抑制或阻止它 们降解的活性剂、胶原蛋白合成刺激剂、弹性蛋白合成刺激剂、核心蛋白聚糖合成刺激剂、 层粘连蛋白合成刺激剂、防御素合成刺激剂、伴侣分子合成刺激剂、cAMP合成刺激剂、调节 AQP-3的活性剂、调节水通道蛋白合成的活性剂、来自水通道蛋白家族的蛋白质、透明质酸 合成刺激剂、糖胺聚糖合成刺激剂、纤维连接蛋白合成刺激剂、sirtuiη合成刺激剂、 sirtuin活化剂、热激蛋白、热激蛋白合成刺激剂、刺激角质层脂质和成分的活性剂、神经酰 胺类、脂肪酸、抑制胶原蛋白降解的活性剂、抑制基质金属蛋白酶的活性剂、抑制弹性蛋白 降解的活性剂、抑制丝氨酸蛋白酶的活性剂。刺激成纤维细胞增殖的活性剂、刺激角化细胞 增殖的活性剂、刺激脂肪细胞增殖的活性剂、刺激黑素细胞增殖的活性剂、刺激角化细胞分 化的活性剂、加速或延缓脂肪细胞分化的活性剂、抗角化过度剂、粉刺溶解剂、抗银肩病药、 DNA修复剂、DNA保护剂、干细胞保护剂、稳定剂、用于治疗和/或护理敏感性皮肤的活性剂、 固化剂、抗拉长痣剂、粘合剂、调节皮脂产生的活性剂、脂肪分解剂或刺激脂解的活性剂、月旨 肪形成剂、调节PGC-la表达的活性剂、调节PPARy的活性剂、增加或减少脂肪细胞的甘油三 酯含量的活性剂、抗蜂窝组织剂、PAR-2活性抑制剂、刺激愈合的活性剂、愈合剂辅佐剂、刺 激表皮细胞再生的活性剂、表皮细胞再生剂辅佐剂、细胞因子、生长因子、作用于毛细血管 循环和/或微循环的活性剂、刺激血管生成的活性剂、抑制血管通透性的活性剂、静脉紧张 剂、作用于细胞新陈代谢的活性剂、改善真皮表皮连接的活性剂、诱导毛发生长的活性剂、 毛发生长抑制或阻滞剂、延迟脱发的活性剂、香料、美容除臭剂和/或体臭吸收剂和/或体臭 掩蔽剂、螯合剂、植物提取物、精油、海洋萃取物、从生物技术工艺获得的活性剂、矿物盐、细 胞提取物、和抵抗紫外线A和/或B射线和/或红外A射线的防晒剂或有机或矿物光保护剂，或 其混合物。
【专利摘要】细菌菌株的外泌多糖，其用于在皮肤、粘膜、毛发和/或指甲的治疗和/或护理中，及其化妆品或皮肤药物组合物。具体地，其用于皮肤老化且特别是用于皱纹的治疗和/或预防。CNCM I-423920091104
【IPC分类】A61Q19/08, A61Q7/00, A61K8/73
【公开号】CN105451710
【申请号】CN201480017115
【发明人】冈萨雷斯 R·德尔加多, 阿斯塔尔 A·索莱, A·库尔图瓦, B·托拉
【申请人】利普泰股份公司, 波利马里斯生物技术公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年3月21日
【公告号】CA2907800A1, EP2976060A1, US20160045423, WO2014147255A1