工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性t细胞的方法
【专利说明】工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性T细胞的方 法
[0001] 相关申请的相互引用
[0002] 在35U.S.C. 119(e)下，本申请要求于2012年5月25日提交的美国临时申请号 61/651,933 ;以及2012年9月4日提交的美国临时申请号61/696,612的优先权，其全部内 容通过引用结合于此。
技术领域
[0003] 本发明涉及开发用于免疫疗法的工程化T细胞（工程T细胞，设计T细 胞，engineered T-cell)的方法，该工程化T细胞是非同种反应性（非异体反应性， non-alIoreactive)的且对免疫抑制药物具有耐受性。本发明涉及通过灭活免疫抑制剂和 T细胞受体的基因编码革El标以改变（修饰，modifying) T细胞的方法。这种方法涉及使用具 体稀切内切核酸酶（rare-cutting endonuclease)、尤其是TALE-核酸酶（TAL效应器内切 核酸酶）和编码这种多肽的多核苷酸，以精确靶向T细胞中关键基因的选择，该T细胞从供 体或初始细胞的培养物可获得。本发明也涉及前TCRa ("ρΤα "）及其功能衍生物、嵌合抗 原受体（CAR)、多链（CAR)及其提高免疫疗法的效率的用途。本发明为治疗癌症和病毒感染 的标准和可负担过继免疫疗法（adoptive immunotherapy)策略开拓了途径。
【背景技术】
[0004] 过继免疫疗法涉及离体产生的自体抗原特异性T细胞的转移，其是一种治疗病毒 感染和癌症有前景的策略。过继免疫疗法使用的T细胞可以通过抗原特异性T细胞的扩增 (增殖，expansion)或通过基因工程重定向T细胞而产生（Park, Rosenberg et al. 2011)。 病毒抗原特异性T细胞的转移是存在已久的程序，其用于治疗与病毒感染相关的移植体和 稀切病毒相关恶性肿瘤（malignancy)。同样，已经证明肿瘤特异性T细胞的分离和转移在 治疗黑色素瘤中获得成功。
[0005] 通过转基因 T细胞受体或嵌合抗原受体（CAR)的基因转移，已经成功产生T细胞 新的特异性（Jena, Dotti et al. 2010)。CAR是合成受体，由与在单个融合分子中与一个或 多个信号结构域（域，domain)相关的靶向部分组成。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体 (scFv)的抗原结合结构域组成，该单链抗体包括通过柔性连接子相连的单克隆抗体的轻和 可变片段。也已经成功使用基于受体或配体结构域的结合部分。第一代CAR的信号结构域 来源于⑶3 ζ或Fc受体γ链的细胞质区域。已经显示，第一代CAR成功地重定向T细胞 细胞毒性，然而，它们在体内未能提供延长的扩增和抗肿瘤活性。已单独（第二代）或组合 (第三代）加入了来自包括CD28、0X-40(CD134)和4-IBB(CD137)的协同刺激分子的信号结 构域，以增强生存并且增加 CAR修饰的T细胞的增殖。CAR已经成功允许T细胞针对在来自 各种恶性肿瘤（包括淋巴瘤和实体瘤）的肿瘤细胞表面处表达的抗原重定向（Jena, Dotti et al. 2010) 〇
[0006] 目前的CAR体系结构建立在所有相关的结构域包括在单个多肽内的设计之上。 这种设计需要信号结构域的连续附加 （serial appending)，从而需要从它们的天然近膜 (juxtamembrane)位置去除一些结构域。因此，其中配体和信号结构域分开的体系结构可 以允许位于它们的通常近膜位置的不同链上的协同刺激结构域具有改善的功能，而不是与 远离质膜定位的一些结构域一起附加。天然受体，IgE(FceRI)的高亲和受体将提供这样 的体系结构。在肥大细胞和嗜碱性细胞上呈现的Fc ε RI以高亲和力结合IgE。Fc ε RI是 四聚体受体复合物，由配体结合α亚基、β亚基和两个信号转导γ亚基的同型二聚体组 成（Metzger, Alcaraz et al. 1986)。Fee RI的α结构域由胞外结构域组成，该胞外结构 域包括两个Ig-样结构域，其结合IgE，跨膜结构域和短的细胞质尾部。β亚基包括将氨基 和羧基端细胞质尾部分开的四个跨膜区段。γ链主要由跨膜区域和细胞质尾部组成，该细 胞质尾部包括一个免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM) (Cambier 1995)。TCR复合物的ζ链 与γ链紧密相关，并且可以取代Fc ε RI的γ链（Howard, Rodewald et al. 1990)。
[0007] 使用过继免疫疗法，患者治疗的目前方案是基于自体细胞转移。在这个方法中， T淋巴细胞从患者回收、基因改变或离体选择、体外培养，以在必要时扩大细胞的数量，并 且最终灌注至患者体内。除淋巴细胞灌注外，可以以支持T细胞移入或它们参与免疫响应 的其他方法，例如预处理（预治疗，pre-conditioning)(用福射或化疗），和给予淋巴细 胞生长因子（如IL-2)处理宿主。每个患者接受个体构建的治疗，使用患者自己的淋巴细 胞（即，自体治疗）。自体治疗在实际应用中面临大量技术和逻辑障碍，它们的产生需要 昂贵的专用设备和专家人员，它们必须在患者的诊断之后很短时间内进行，并且在许多情 况下，患者的预治疗已经导致下降的免疫功能，以致患者的淋巴细胞可能是功能不足的并 且以非常低的数量存在。因为这些障碍，每个患者的自体细胞制备是有效的新产品，致使 效能和安全性显著变化。理想地，个体希望使用标准治疗，其中，异体（同种异体，异基因， allogeneic)治疗细胞可以是预制备的、详细表征的，并且可用于直接给予患者。异体指的 是细胞是从属于相同物种但基因不同的个体中获得的。然而，异体细胞的使用目前具有许 多缺点。在免疫功能正常的宿主中，异体细胞被快速排斥（称为宿主抗移植物反应（HvG)的 过程），并且这显著限制被转移细胞的效能。在免疫无能宿主中，异体细胞能够移植，但是它 们的内源TCR特异性将宿主组织识别为外来物（foreign)，导致移植物抗宿主反应（GvHD)， 其可以导致严重的组织损伤和死亡。为了有效地使用异体细胞，必须克服这些问题。
[0008] 在免疫功能正常的宿主中，宿主免疫系统快速排斥异体细胞。已经证明，存在于未 照射的血液制品的异体白细胞将继续存在不超过5至6天。（Boni, Muranski et al. 2008)。 因此，为了防止异体细胞的排斥，必须有效抑制宿主的免疫系统。糖皮质激素类固醇广泛地 治疗性用于免疫抑制（Coutinho and Chapman 2011)。这类类固醇激素结合存在于T细胞 的胞质溶胶中的糖皮质激素受体（GR)，导致易位至核，并且结合调节参与免疫学过程的大 量基因表达的具体DNA基序。利用糖皮质激素类固醇的T细胞治疗导致减少水平的细胞因 子产生，导致T细胞无反应性并且妨碍T细胞活化。阿仑珠单抗（Alemtuzumab)，也被称为 CAMPATH1-H，是靶向⑶52的人化单克隆抗体，12个氨基酸糖基磷脂酰基-肌醇-(GPI)连接 的糖蛋白（Waldmann and Hale 2005)。⑶52在T和B淋巴细胞上以高水平表达并且在单 核细胞上以较低水平表达，而不存在于粒细胞和骨髓前体上。利用阿仑珠单抗（一种对抗 CD52的人化单克隆抗体）治疗，已经显示出引起循环的淋巴细胞和单核细胞的快速损耗。 其经常在T细胞淋巴瘤的治疗中使用，并且在某些情况下，作为移植的调理疗法（预处理方 案，conditioning regimen)的部分。然而，在过继免疫疗法的情况下，免疫抑制药物的使 用也将对引入的治疗性T细胞造成不利影响。因此，为了有效地在这些病症中使用过继免 疫疗法方法，引入的细胞将需要对免疫抑制治疗具有耐受性。
[0009] 另一方面，T细胞受体（TCR)是细胞表面受体，参与T细胞的活化以响应抗原的呈 现。一般来说，TCR由α和β两条链（其装配以形成异源二聚体）组成，并且与⑶3转导 亚基相连以在细胞表面上呈现形成T-细胞受体复合物。TCR的每条α和β链由免疫球蛋 白样N-端可变（V)和恒定（C)区、疏水跨膜结构域和短的细胞质区域组成。关于免疫球蛋 白分子，α和β链的可变区由V(D)J重组产生，在T细胞群中产生抗原特异性的大量多样 性。然而，同识别完整抗原的免疫球蛋白相比，T细胞被与MHC分子相关的经处理肽片段活 化，通过T细胞将另外的特征引入至抗原识别，被称为MHC限制性。通过T细胞受体在供体 和受体之间的MHC差异识别，导致T细胞增殖和GVHD的潜在发展。已经指出，TCR的正常表 面表达取决于复合物所有七种组件（component)的协调合成和装配（Ashwell and Klusner 1990)。TCRa或TCRf3的灭活可以导致从防止同种抗原识别的T细胞表面消除TCR并且 因此消除GVHD。然而，TCR断裂导致CD3信号组件的消除，并且改变进一步T细胞扩增的方 式。
[0010] 在正常的T细胞中，T细胞受体从由不成熟的胸腺细胞表达的前-T细胞受体 (PTCR)放出，并且对于从双阴性（⑶4-⑶8-)至双阳性（⑶4+⑶8+)阶段的T细胞发展是至 关重要的。在TCRI3基因座成功地有效重排的前T细胞表达功能性TCRf3链，该TCRf3链 与不变的前Ta链和CD3信号组件配对以形成前TCR复合物。在细胞表面处前TCR的表达 对于触发β-选择是必要的，β-选择是诱导发展T细胞扩增、迫使TCRf3基因座的等位排 除以及导致在TCR a基因座引入重排的过程（von Boehmer 2005)。在有效TCR a重排和通 过TCR a的pT a取代以形成成熟的TCR之后，胸腺细胞经历选择的第二步，称为在胸腺上 皮细胞上表达的自身肽MHC复合物结合后的阳性或TCRa/β选择。因此，成熟的T细胞通 过它们的TCR识别和响应抗原/MHC复合物。TCR活化的最直接结果是经由相关的CD3亚基 引发信号通路，导致多个事件，这些事件包括T细胞的克隆扩增、在细胞表面活化标记的上 调和细胞毒性或细胞因子分泌的引入。
[0011] 由于在胸腺生长期间，通过与前Ta配对的TCRf3链选择的性质，因此在其中 TCRa已被灭活的T细胞中，pTa转基因的异源引入可以导致前TCR的形成。这种pTCR可 以以非-MHC依赖的方式充当T细胞活化或刺激的方式，因此例如在TCRa灭活之后允许 a / β T细胞的持续不断的扩增。重要地，pTCR复合物在相关的⑶3亚基方面与TCR显示出 类似的生物化学组成（Carrasco，Ramiro et al.2001)。此外，同TCR相比，前TCR信号可 以通过配体独立事件部分发生。PTCR细胞外结构域的晶体结构已经向pTCR信号的可能配 体-独立性提供了结构基础。已经显示PTCR形成头至尾（头接尾，head to tail)的二聚 体，其中，两个pTa-TCR β异源二聚体结合（Pang, Berry et al. 2010)。
[0012] 在本发明中，本发明人已经实现基因改变的T细胞的生产，其克服了目前的免疫 疗法策略的限制，允许它们同时具有非同种反应性和对免疫抑制剂的耐受性。伴随着不同 免疫抑制剂的基因编码靶标、尤其是CD52和GR的灭活，通过使用对抗TCRa或TCR β的特 定TALE-核酸酶使基因灭活使这成为可能。
[0013] 尤其是，通过消除负责MHC差异识别的TCR，同时允许引入的淋巴细胞在防止这 些细胞排斥的免疫抑制药物（如阿仑珠单抗或糖皮质激素类固醇）存在下增殖和有活性， TCRa或TCR β的灭活以及CD52或在来自于异体供体的T淋巴细胞中糖皮质激素受体的灭 活显著降低了 GVHD的风险。因此，预期这些改变的异体T细胞在患者的血液中更高效地扩 增，其中它们可以靶向肿瘤细胞或受感染的细胞。
[0014] 除了基因改变的T细胞（其可以是非同种反应性的和免疫抑制剂耐受性的）的以 上构思之外，本发明人通过特定TALE-核酸酶的使用和设计，已经伴随地在T细胞中使这些 不同的基因灭活，从而获得了双突变体（double mutant)。事实上，由于随着时间的推移在 培养物中获得和维持T细胞的困难、由于它们的低转化速率以及在选择过程期间的损失， 通过DSB的双基因靶向迄今为止未在T细胞中实现。这些困难导致获得这样的细胞的低成 功率。
[0015] 因此，本发明的一个显著部分是得到经设计的特定TALE-核酸酶，允许在T细胞内 DSB事件的较高比率，其被细胞很好地忍受（特别是在共转染后），能够靶向根据本发明的 基因的选择。通过使用稀切内切核酸酶，如在其中描述的TALE-核酸酶，在转染的T细胞中 获得基因双灭活的概率显著增加，使得目前看起来可以产生使用标准程序可从供体中定期 获得的工程化T细胞。
[0016] 此外，本发明提出了一个实施方式，其中在TCRa灭活时，工程化T细胞以允许增 殖。已经受TCR亚基灭活的T细胞带来的重大问题是这些细胞不能再通过⑶3复合物扩增。 为了克服这个问题，本发明人事实上提供了方式以扩增T细胞（其中，TCRa已经通过⑶3 复合物灭活），其通过前T a在细胞中的表达，从而在不存在功能性α/β TCR时，恢复功能 性⑶3复合物。
[0017] 最终，用CAR进一步转化T细胞以重定向异体细胞针对不依赖于MHC的肿瘤相关 抗原的特异性。尤其是，本发明涉及多链CAR，其中，协同刺激结构域位于它们正常的近膜位 置以改善它们的功能，并且因此增强生存和提高工程化T细胞的增殖。因此，本发明提供了 方法、多肽和多核苷酸，其允许过继免疫疗法的异体T细胞的有效转化，以及通过CD3复合 物的容易扩增。
【发明内容】
[0018] 一方面，本发明公开了工程化T细胞、尤其是从供体可获得的异体T细胞的方法， 以使得它们适合免疫疗法的目的。本发明的方法更特别地允许通过灭活或取代参与MHC识 别的基因和/或用于癌症和/或病毒感染治疗的免疫抑制药物的靶标，对免疫疗法相关细 胞的基因组的精确改变。在特定的实施方式中，与免疫疗法相关的改变的细胞进一步包括 用于具体细胞识别的外源重组多核苷酸编码CAR。目前的CAR是需要信号结构域的连续附 加的单个融合分子。从它们的天然近膜位置移除信号结构域可以影响它们的功能。因此，为 了克服这个缺点，本发明人设计了来源于Fc ε RI的多链CAR以允许所有相关信号结构域的 天然近膜位置。Fc ε RI a链的高亲和IgE结合结构域被细胞外配体结合结构域（如scFv) 取代，以重定向T细胞对细胞靶标的特异性，并且Fe ε RI β链的N和/或C-端尾部用于使 协同刺激信号位于正常的近膜位置。
[0019] 另一方面，为了促进其中TCRa已灭活的T细胞的活化或刺激，将PTa或其功能 变体引入工程化T细胞中。使用的pT a或其功能变体可以是全长的pT a、剪接变体（splice variant) (Saint-Ruf, Lechner et al. 1998)，已经显示C端短切版本增加前TCR细胞表面 表达（Carrasco, Ramiro et al. 2001)。可以使用其它另外的比描述的更小或更大的短切体 (truncation)。不同的前Ta版本可以进一步包括来自其它分子（⑶28、⑶137、⑶8、TCRa 等）的信号部分以促进增殖和生存，或者包括影响其二聚能力的突变，如在小鼠中先前描 述的 D22A、R24A、R102A 或 Rl 17A 突变（Yamasaki, Ishikawa etal. 2006)，或在人类中描述 的评461?突变（?&叩，861'巧6七&1.2010)以减少增殖潜力。也可以将041?的8〇? ￥部分融合 至PT α或其功能变体的细胞外结构域，从而将针对靶抗原的特异性与前TCR的增殖活性直 接偶联。
[0020] 另一方面，本发明涉及多肽和多核苷酸，其编码稀切内切核酸酶，从而精确地靶向 感兴趣的上述基因，尤其是TCRa、TCRf3、GR和⑶52,从而使得用于免疫疗法的T细胞基因 改变。更特别地，本发明提供了在这些基因内的特异性靶序列和旨在分别靶向那些基因的 TALE-核酸酶。
[0021] 本发明也涉及包括在本文中描述的任何蛋白质、多肽或载体的分离细胞或细胞 系。在某些实施方式中，本发明的T细胞包括灭活的TCR a、
[0022] TCRf3、GR或⑶52基因在免疫疗法中的应用。本发明的分离细胞或细胞系可以进 一步包括外源重组多核苷酸、尤其是编码PT a的多核苷酸或其功能变体，CAR或多链CAR。
[0023] 在优选的实施方式中，改变的T细胞用作治疗产品，理想地用作"现货"产品。
[0024] 另一方面，本发明涉及通过给予通过上述方法可获得的工程化T细胞治疗或防止 患者中的癌症或感染的方法。
【附图说明】
[0025] 除了上述特征之外，本发明进一步包括将从以下的描述以及附图中显示出的其它 特征。本发明更完全的理解以及其很多伴随的优势将很容易地获得，因为通过参考附图结 合以下详细说明其变得更好理解。
[0026] 图I :T细胞和抗原呈递细胞之间的正常关系的示意图。
[0027] 图2 :根据本发明的基因改变的治疗T细胞和患者的肿瘤细胞的示意图。
[0028] 图3 :多链CAR的示意图。
[0029] 图4 :多链CAR的不同版本的示意图。A. FC ε RI受体的示意图。B-C包括融合至 FcsRI a链的跨膜结构域的scFv和CD茎区域（stalk region)的多链CAR的不同版本（csml 至csmlO)。至少一个41BB、⑶28和/或⑶3 ζ结构域可以融合至Fc ε RI α、β和/或γ 链。
[0030] 图5 :工程化用于免疫疗法的人类异基因细胞的方法的一个实施例的示意图。
[0031] 图6 :在用具有补体的抗-⑶52抗体（CAMPATH1-H)或对照治疗后，每毫升活 ⑶52-阳性或⑶52-阴性细胞的细胞浓度。
[0032] 图7 :在TCR-阳性和TCR-阴性细胞之间、或在⑶52-阳性和⑶52-阴性细胞之间 以及非活化细胞作为对照，前方散射光（FSC)分布（细胞尺寸的指示）的比较。
[0033] 图8 :靶向的⑶52和TCR α灭活的T细胞上⑶107a表达（去粒的标记）的流式 细胞术分析。用道迪（Daudi)细胞孵育之前（A)和之后（B)在
[0034] CD52+TCR α β + 细胞（第一柱）、CD52-TCR α β -细胞（第二柱）、CD52-TCR α β + 细胞（第三柱）和⑶52+TCRa β-细胞（第四柱）上分析⑶107表达；C)代表进一步用CAR 转染和用道迪细胞孵育的T细胞的流式细胞术分析；D)代表用CAR转染但不用道迪孵育的 T细胞流式细胞术分析，以及E)代表用CAR转染和对PM/离子霉素（阳性对照）处理的T 细胞的流式细胞术分析。
[0035] 图9 :CD52和TRAC TALE-核酸酶潜在离位靶标（off-site target)的深度序列分 析。
[0036] 图10 :通过T7-内切核酸酶试验的ro⑶1和CTLA-4基因组基因座的分析。箭头 指向消化的PCR产物。
[0037] 图11 :代表前Ta结构的一些实施例的示意图。
[0038] 图12 :在TCRa灭活的Jurkat细胞中，FL、Δ18、Δ48ρΤα结构的转导效率 BFP+细胞）和活性（％ CD3表面表达）的流式细胞术分析。
[0039] 图13 :代表编码ρΤα蛋白的慢病毒结构（前TCRa)的示意图。
[0040] 图14 :Α.实验方案的示意图。Β.在纯化前后用BFP-2A_pTa Λ48(Κ 0/Λ48)或 对照BFP慢病毒载体（K0/BFP)转导的TCR a灭活的T细胞（KO)上TCR a /