β、⑶3表达和 BFP表达的流式细胞术分析。C.用BFP-2A-pT α Λ 48慢病毒载体转导的（BFPpos)或未转 导的（BFPneg)的纯化的TCRa灭活细胞上TCRa/β和⑶3表达的流式细胞术分析。NEP 代表未用TRAC TALE-核酸酶电穿孔的细胞。
[0041] 图 15 :Α-Β·在用 BFP-2A_pTa-Δ48 慢病毒载体（P T a - Δ 48)、 BFP-2A_pTa - Λ48. 41BB慢病毒载体（ρΤ α - Λ48. B B)或对照BFP载体（BFP)转导的非电 穿孔细胞（NEP)和TCR a灭活的细胞（KO)上分别用抗-CD3/CD28珠粒再活化24和48小时 之后，早期活化标记物⑶69 (A)、晚期活化标记物⑶25 (B)的流式细胞术分析。p T a - Λ 48 直方图相当于在表达pT a-A48(BFP+细胞）的TCR灭活的细胞中检测的信号，而KO直 方图相当于不表达pT a-A48(BFP_细胞）的TCRa灭活的细胞。ΡΤ α-Λ48. B B直方 图相当于在表达ρΤ α-Λ48. 41 B B (BFP+细胞）的TCR灭活的细胞中检测的信号，而KO 直方图相当于不表达ρΤ α-Λ48. 41 B B (BFP-细胞）的TCRa灭活的细胞。NEP(非电穿 孔的）直方图相当于在非工程化细胞中检测的信号。C.用BFP-2A_pTa-A48慢病毒载体 (p T a - Δ 48)、BFP-2A-pT a - Δ 48. 41BB 慢病毒载体（p T a - Δ 48. B B )或对照 BFP 载体 (BFP)转导的非电穿孔的细胞（NEP)和TCRa灭活的细胞（KO)上用抗-CD3/CD28珠粒再活 化72小时之后，细胞尺寸的流式细胞术分析。在每张图的靠上部分中标明的值相当于每个 群的荧光的几何平均值。
[0042] 图16 :在不同的时间点（X-轴）处，在IL2或带有抗-CD3/CD28珠粒的IL2中保 持的用PT a - Λ 48 (pTa Λ 48)或对照BFP载体（BFP)转导的TCR α灭活的细胞（KO)的细胞 生长分析。BFP+细胞数量在每个条件的不同时间点处估计，并且相对于在第2天再活化后 获得的值估计这些细胞的倍数诱导（fold induction) (Y-轴）。结果从两个独立的供体获 得。对于第二供体，也确定了用口了(1-八48.4188(?了&-八48.88)和全长？了€1-(抑 &41^)转 导的细胞的细胞生长。
[0043] 图17 :用五种不同的细胞波（细胞脉冲，cytopulse)程序电穿孔的PBMC上GFP阳 性细胞的流式细胞术分析。靠上的线相当于每个凹槽（槽，cuvette)转染6xl0 6个细胞，而 较低的线相当于每个凹槽转染3xl06个细胞。
[0044] 图18 :在用GFP mRNA、GFP DNA和对照pUC DNA电穿孔之后，使用活性染料 (eFluor-450)的纯化T细胞死亡率和在活力群之间GFP阳性细胞的流式细胞术分析。NEP 相当于在电穿孔但不是电穿孔的缓冲液中保持的细胞，并且NT相当于在培养基中保持的 非电穿孔细胞。
[0045] 图19 :在TRAC TALE-核酸酶mRNA电穿孔之后，在人类初级T细胞上TCR α / β和 ⑶3表达的流式细胞术分析（顶部）。在TRAC TALE-核酸酶mRNA电穿孔之后，从人类初级 T细胞提取的染色体DNA的深度测序分析（底部）。
[0046] 图20 :A.在带有或不带有编码单链CAR的mRNA的T细胞电穿孔之后，CAR表达 (抗F(ab'）2)的流式细胞术分析。B.用道迪细胞共培养的电穿孔T细胞上CD107a表达 (去粒标记物）的流式细胞术分析。
[0047] 图21 :A. mRNA编码的多链CAR的示意图。B.用或没用编码多链CAR的多顺反子 mRNA电穿孔的活力T细胞上CAR表达（抗F(ab'）2)的流式细胞术。C.用道迪细胞共培养 的电穿孔T细胞上的⑶107a表达（去粒标记物）的流式细胞术分析。
[0048] 表1 :在人GR基因中GR TALE-核酸酶和TALE-核酸酶靶标部位的序列的描述。
[0049] 表2 :在酵母中GR TAL-核酸酶的断裂活性。值包括在0至1之间。最大值是1。
[0050] 表3 :在293细胞中在内源TALE-核酸酶靶标部位处定向诱变的百分比。
[0051] 表4 :在初级T细胞中在内源TALE-核酸酶靶标部位处定向诱变的百分比。
[0052] 表5 :在人相应基因中⑶52、TRAC和TRBC TALE-核酸酶以及TALE-核酸酶靶标部 位的序列的描述。
[0053] 表6 :TRAC和⑶52TALE-核酸酶的另外的靶标序列。
[0054] 表 7 :靶向 CD52_T02、TRAC_T01、TRBC_T01 和 TRBC_T02 靶标的 TALE-核酸酶的插 入和缺失（indels)的百分比。
[0055] 表8 :在相应的表达TALE-核酸酶的多核苷酸转染之后⑶52-阴性、TCR-阴性和 ⑶52/TCR-双阴性T淋巴细胞的百分比。
[0056] 表9 :在表达TRBC TALE-核酸酶的多核酸酶转染之后TCR-阴性T淋巴细胞的百 分比。
[0057] 表10 :在人相应的基因中CTLA4和⑶ITALE-核酸酶以及TALE-核酸酶靶标部 位的序列的描述。
[0058] 表11 :ρΤα结构的亚组（子组，subset)的描述。
[0059] 表12 :在Jurkat TCRa灭活的细胞中不同ρΤα结构的活性。通过在用不同前Ta 结构转染的Jurkat TCRa灭活的细胞上的CD3表达的流式细胞术分析测量活性。
[0060] 表13 :用以确定在来源于PBMC的T细胞中电穿孔所需要的最小电压的不同细胞 波程序。
[0061] 表14 :用以电穿孔纯化的T细胞的细胞波程序。
【具体实施方式】
[0062] 除非在本文中特别限定，使用的所有科技术语具有与基因疗法、生物化学、遗传学 和分子生物学领域的技术人员通常理解的相同意义。
[0063] 在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的那些类似或等价的所有方法和 材料，适合的方法和材料在本文中描述。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参 考文献，将其全部内容通过引用结合于此。在冲突的情况下，包括定义在内的本说明书将优 先。而且除非另有说明，否则材料、方法和实施例仅是说明性的并且不意图限制。
[0064] 除非另外指出，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、 转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规的技术，它们都在本领域的技 术范围内。在文献中充分解释了这些技术。参见，例如，CurrenTProtocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL, 2000,Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) ；Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)； Oligonucleotide Synthesis (M. J. GaiTed. , 1984) ;Mullis 等，美国专利号 4, 683, 195 ; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Harries&S. J. Higgins eds.1984) ；Transcription And Translation(B. D. Hames&S. J. Higgins eds.1984) ；Culture Of Animal Cells(R. I.Freshney,Alan R.Liss, Inc., 1987) ； Immobi Iized Cells And Enzymes (IRL Press,1986) ;B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);丛书 Methods In ENZYM0L0GY(J. Abelson and M.Simon, eds. -in-chief, AcademiCPress, Inc. ,New York)，分别在第 154 和 155 卷（Wu et al. eds.)以及第 185 卷，〃 Gene Expression Technology"（D.Goeddel, ed. ) ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds. , 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds. , AcademiCPress ,London, 1987) ；Handbook Of Experimental Immunology,第 I-IV 卷(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. , 1986);以及Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1986)〇
[0065] 在一般方面，本发明涉及在治疗癌症和感染中的新过继免疫疗法策略的方法。
[0066] 非同种反应件和免痔抑制剂耐#件T细朐：
[0067] 在具体的方面，本发明涉及工程化特别是用于免疫疗法的T细胞的方法。具体地， 该方法包括：
[0068] (a)通过灭活至少以下各项改变T细胞：
[0069] -表达免疫抑制剂的靶标的第一基因，和 [0070]-编码T细胞受体（TCR)的组件的第二基因
[0071] (b)可选地在所述免疫抑制剂存在下，扩增所述细胞。
[0072] 免疫抑制剂是通过几种作用机制中的一种抑制免疫功能的试剂。换句话说，免 疫抑制剂通过以下化合物发挥作用，其表现出减少免疫响应的程度和/或剧烈度（贪婪， voracity)的能力。作为非限制的实例，免疫抑制剂可以是钙神经素抑制剂、雷帕霉素的靶 标、白介素-2 α -链阻滞剂、单磷酸肌苷脱氢酶的抑制剂、二氢叶酸还原酶的抑制剂、皮质 类固醇（皮质醇，corticosteroid)或免疫抑制剂抗代谢物。常见的细胞毒性免疫抑制剂 通过抑制DNA合成起作用。其它可以通过T细胞活化或通过抑制辅助细胞（helper cell) 的活化起作用。根据本发明的方法允许通过在T细胞中免疫抑制剂靶标的灭活，赋予对用 于免疫疗法的T细胞的免疫抑制耐受性。作为非限制的实例，免疫抑制剂的靶标可以是免 疫抑制剂的受体，如：CD52、糖皮质激素受体（GR)、FKBP家族基因成员和亲环素（环孢素 α 受体，cyclophilin)家族基因成员。
[0073] 在具体的实施方式中，该方法的基因改变步骤依赖于选自由以下各项组成的组中 的一种基因的灭活：⑶52、GR、TCRa和TCRI3。在另一种实施方式中，该方法的基因改变步 骤依赖于选自由以下各项组成的组中的两种基因的灭活：⑶52和GR、⑶52和TCRa、⑶R52 和TCR^、GR和TCRa、GR和TCR^、TCR a和TCR β。在另一种实施方式中，该方法的基因 改变步骤依赖于大于两种基因的灭活。优选地，离体操作基因改变。
[0074] 灭活基因指的是感兴趣的基因不以功能蛋白的形式表达。在具体的实施方式中， 该方法的基因修饰依赖于在提供的需工程化的细胞中，表达一种稀切内切核酸酶以使所述 稀切内切核酸酶在一种靶标基因中特异性地催化断裂，从而使所述靶标基因灭活。由稀切 内切核酸酶所引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源性末端连接（NHEJ)的不同机 制修复。然而，NHEJ是有缺点的修复过程，其常常在断裂部位处导致DNA序列的改变。机制 涉及两个DNA末端的剩余物通过直接再连接（Critchlow and Jackson 1998)或经由所谓 的微同源性介导的末端连接（Ma，Kim et al. 2003)的重连接。经由非同源末端连接（NHEJ) 的修复常常导致小的插入或缺失，并且可以用于产生特异性基因敲除。所述改变可以是取 代、缺失或增加至少一个核苷酸。可以通过本领域公知的方法识别和/或选择其中已经发 生断裂诱导的诱变事件（即NHEJ事件继发的诱变事件）的细胞。在具体的实施方式中，工 程化细胞的所述方法包括以下步骤中的至少一个：
[0075] (a)提供T细胞，优选地来自细胞培养物或来自血液样本；
[0076] (b)在表达免疫抑制剂的靶标的所述T细胞中选择基因；
[0077] (c)向所述T细胞中引入能够通过DNA断裂、优选地通过双链切断分别选择性地使 以下各项灭活的稀切内切核酸酶：
[0078] -编码所述免疫抑制剂的靶标的所述基因，和
[0079] -编码T细胞受体（TCR)的组件的至少一种基因。
[0080] (d)可选地在所述免疫抑制剂存在下，扩增所述细胞。
[0081] 在更优选的实施方式中，所述方法包括：
[0082] (a)提供T细胞，优选地来自细胞培养物或来自血液样本；
[0083] (b)在表达免疫抑制剂的靶标的所述T细胞中选择基因；
[0084] (C)用编码能够通过DNA断裂、优选地通过双链切断分别选择性地使以下各项灭 活的稀切内切核酸酶的核酸转化所述T细胞：
[0085] -编码所述免疫抑制剂的靶标的所述基因，和
[0086] -编码T细胞受体（TCR)的组件的至少一种基因；
[0087] (d)将所述稀切内切核酸酶表达至所述T细胞中；
[0088] (e)分类经转化的T细胞，其不在它们的细胞表面上表达TCR ;
[0089] (f)可选地在所述免疫抑制剂存在下，不断扩增所述细胞。
[0090] 在具体的实施方式中，所述稀切内切核酸酶特异性地靶向选自由⑶52、GR、TCRa 和TCRf3组成的组中的一种基因。在另一种实施方式中，该方法的基因改变依赖于在提供 的需工程化的细胞中表达两种稀切内切核酸酶以使所述两种稀切内切核酸酶中的每一种 特异性地和分别催化断裂选自由以下各项组成的组中的基因对中的每一个：CD52和GR、 CD52 和 TCR a、CDR52 和 TCR β、GR 和 TCR a、GR 和 TCR β、TCR a 和 TCR β，从而使所述靶标 基因灭活。在另一种实施方式中，在需工程化的细胞中可以表达超过两种稀切内切核酸酶， 以靶向和/或灭活大于两种基因。
[0091] 在另一种实施方式中，步骤（b)的所述基因特异性地用于免疫抑制治疗，其是 CD52,并且步骤（d)或（e)的免疫抑制治疗包括靶向CD52抗原的人化抗体。
[0092] 在另一种实施方式中，步骤（b)的所述基因特异性地用于免疫抑制治疗，其是糖 皮质激素受体，并且步骤（d)或（e)的免疫抑制治疗包括诸如地塞米松的皮质类固醇。 [0093] 在另一种实施方式中，步骤（b)的所述靶标基因特异性地用于免疫抑制治疗，其 是FKBP家族基因成员或其变体，并且步骤（d)或（e)的免疫抑制治疗包括FK506,也称为他 罗利姆（他克莫司，tacrolimus)或藤霉素。在另一种实施方式中，所述FKBP家族基因成 员是FKBP12或其变体。
[0094] 在另一种实施方式中，步骤（b)的所述基因特异性地用于免疫抑制治疗，其是亲 环素家族基因成员或其变体，并且步骤（d)或（e)的免疫抑制治疗包括环孢菌素。
[0095] 在另一种实施方式中，所述稀切内切核酸酶可以是大范围核酸酶 (meganuclease)、锌指核酸酶或TALE-核酸酶。在优选的实施方式中，所述稀切内切核 酸酶是TALE-核酸酶。TALE-核酸酶指的是由来源于转录激活子样效应因子（TALE)的 DNA结合结构域和用于断裂核酸靶标序列的一个核酸酶催化结构域组成的融合蛋白。 (Boch,Scholze et al. 2009 ；Moscou and Bogdanove 2009) (Deng, Yan et al. 2012 ； Mak, Bradley et al.2012) (Christian, Cermak et al. 2010 ；Cermak, Doyle et al. 2011 ； Geissler,Scholze et al.2011 ；Huang, Xiao et al.2011 ；Li, Huang et al.2011 ； Mahfouz, Li et al.2011 ；Miller, Tan et al.2011 ；Morbitzer, Romer et al.2011 ； Mussolino, Morbitzer et al. 2011 ；Sander, Cade et al. 2011 ；Tesson, Usal et al. 2011 ； Weber,Gruetzner et al.2011 ；Zhang, Cong et al.2011 ；Li, Piatek et al.2012 ； Mahfouz, Li et al. 2012)。在本发明中，新的TALE-核酸酶已设计用于精确革El向过继免疫 疗法策略的相关基因。
[0096] 根据本发明优选的TALE-核酸酶是识别和断裂选自由以下组成的组中的靶标序 列的那些：
[0097] -SEQ ID N0:1 至 6(GR)，
[0098] -SEQ ID NO:37、57 至 60 (TCRa )，
[0099] -SEQ ID NO: 38 或 39 (TCR β )，和
[0100] -SEQ ID Ν0:40、61 至 65(CD52)。
[0101] 所述TALE-核酸酶优选地包括选自SEQ ID N0:7至SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:41 至SEQ ID N0:48的多肽序列，以断裂各自的靶标序列SEQ ID N0:1至6和SEQ ID N0:37 至40。
[0102] 在另一种实施方式中，可以进一步将另外的催化结构域引入至具有所述稀切内切 核酸酶的细胞中以增加诱变，以增强它们使靶标基因灭活的能力。尤其是，所述另外的催化 结构域是DNA末端加工酶（processing enzyme)。DNA末端加工酶的非限制实例包括5-3' 外切核酸酶、3-5'外切核酸酶、5-3'碱性外切核酸酶、5'片状内切核酸酶、解旋酶、磷酸酶 (hosphatase)、水解酶和非模板依赖性DNA聚合酶。这样的催化结构域的非限制实例由 蛋白结构域或选自由以下组成的组中的蛋白结构域的催化活性衍生物组成：hExoI (EX01_ 人）、酵母 ExoI (EXOI_ 酵母）、大肠杆菌 ΕχοΙ、人 TREX2、鼠 TREX1、人 TREX1、牛 TREX1、鼠 TREX1、TdT (末端脱氧核苷酸转移酶）、人DNA2、酵母DNA2 (DNA2_酵母）。在优选的实施方 式中，所述另外的催化结构域具有3'-5'-外切核酸酶活性，在更优选的实施方式中，所述 另外的催化结构域是TREX，更优选地，TRE