X2催化结构域（W02012/058458)。在另一个优选 的实施方式中，由单链TREX多肽编码所述催化结构域。可选地通过肽连接子，可以将所述 另外的催化结构域融合至根据本发明的核酸酶融合蛋白或嵌合蛋白。
[0103] 已知内切核苷酸断裂刺激同源重组的比率。因此，在另一种实施方式中，该方法 的基因改变步骤进一步包括向细胞中引入包括与靶标核酸序列的部分同源的至少一种序 列的外源核酸的步骤，以在靶标核酸序列和外源核酸之间发生同源重组。在具体的实施方 式中，所述外源核酸包括第一和第二部分，这些部分分别与靶标核酸序列中的区域5'和3' 是同源的。在这些实施方式中，所述外源核酸也包括第三部分，该部分位于第一部分和第二 部分之间，其与靶标核酸序列中的区域5'和3'不具有同源性。在靶标核酸序列断裂之后， 在靶标核酸序列和外源核酸之间刺激同源重组事件。在所述供体基质内使用优选地至少 50bp，优选地大于lOObp，更优选地大于200bp的同源序列。因此，外源核酸是优选地200bp 至6000bp，更优选地1000 bp至2000bp。实际上，共享的核酸同源性位于断裂部位上游侧和 下游侧的区域，并且将要引入的核酸序列应当位于两臂之间。
[0104] 特别地，所述外源核酸连续包括与所述断裂的上游序列同源的第一区域，灭活选 自由⑶52、GR、TCR α和TCR β组成的组中的一种靶向基因的序列和与断裂的下游序列同源 的第二区域。所述多核苷酸引入步骤可以在所述稀切内切核酸酶的引入或表达的同时、之 前或之后。取决于靶标核酸序列的位置，其中，断裂事件已经发生，可以使用这样的外源核 酸敲出基因，例如当外源核酸位于所述基因的可译框架之内时，或引入感兴趣的新序列或 基因。通过使用这种外源核酸的序列插入可以用于改变靶向的现有基因，通过所述基因的 校正或取代（等位基因交换（allele swap)作为非限制的实例），或者上调或下调靶向的基 因的表达（启动子交换（promoter swap)作为非限制的实例）、所述祀向的基因的校正或取 代。在优选的实施方式中，通过特异性TALE-核酸酶，在靶向的精确基因组位置处可以进行 来自由⑶52、GR、TCRa和TCRI3组成的组中的基因的灭活，其中，所述特异性TALE-核酸 酶催化断裂，并且其中，所述外源核酸连续包括至少一个同源区域和用于灭活选自由CD52、 GR、TCRa和TCRf3组成的组中的至少一个靶向的基因的序列，其通过同源重组整合。在另 一种实施方式中，可以通过使用分别和特异性地靶向一种限定基因的几种TALE-核酸酶和 用于特异性基因灭活的几种特异性多核苷酸，连续或同时灭活多种基因。
[0105] 通过另外的基因组改变步骤，也可以进行选自由⑶52、GR、TCRa和TCRI3组成的 的组的另外的基因的灭活。如上所述，所述另外的基因组改变步骤可以是灭活步骤，包括：
[0106] (a)将至少一种稀切内切核酸酶引入至所述细胞，以使所述稀切内切核酸酶特异 性地催化所述细胞的基因组的一种靶向序列的断裂。
[0107] (b)可选地将外源核酸引入至所述细胞，该外源核酸连续包括与所述断裂的上游 序列同源的第一区域，将要插入所述细胞的基因组中的序列和与所述断裂的下游序列同源 的第二区域。
[0108] 其中，所述引入的外源核酸使基因灭活并且整合至少一种编码至少一种感兴趣的 重组蛋白的外源多核苷酸序列。在另一种实施方式中，在选自由⑶52、GR、TCRa和TCR0 组成的组中的基因内整合所述外源多核苷酸序列。
[0109] 在具体的实施方式中，工程化细胞的所述方法进一步包括另外的基因组改变步 骤。另外的基因组改变步骤可以指的是将感兴趣的一种蛋白质引入至需工程化的细胞中。 作为非限制的实例，感兴趣的所述蛋白质可以是PTa或其功能变体、嵌合抗原受体（CAR)、 多链CAR、双特异性抗体或如在本公开内容中所描述的靶向roCDl或CTLA-4的稀切内切核 酸酶。
[0110] 本发明也涉及TALE-核酸酶。一般来说，本发明涉及的TALE-核酸酶包括：
[0111] (a)转录激活子样效应因子（TALE)DNA结合结构域，其已被工程化为与选自由 ⑶52、GR、TCRa和TCRI3组成的的组中的基因内的靶标序列结合；
[0112] (b)断裂结构域或断裂半结构域（half-domain)。
[0113] 根据本发明优选的TALE-核酸酶是识别和断裂选自由以下组成的组中的靶标序 列的那些：
[0114] -SEQ ID N0:1 至 6(GR)，
[0115] -SEQ ID N0:37、57 至 60(TCRa )，
[0116] -SEQ ID NO: 38 或 39 (TCR β )，和
[0117] -SEQ ID N0:40、61 至 65(CD52)。
[0118] 所述TALE-核酸酶优选地包括选自SEQ ID N0:7至SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:41 至SEQ ID N0:48的多肽序列，以断裂各自的靶标序列SEQ ID N0:1至6和SEQ ID N0:37 至40。
[0119] 因为一些可变性可以来源于衍生得到这些多肽的基因组数据，而且考虑到取代存 在于这些多肽中的一些氨基酸而不显著损灭活性的可能性（功能变体），本发明包括与该 专利申请中提供的序列享有至少70%、优选地至少80%、更优选地至少90%和甚至更优选 至少95%的同一性的上述多肽的多肽变体。
[0120] 本发明因而涉及包括以下多肽序列的多肽，该多肽序列具有与选自由SEQ ID NO:7至SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:48组成的组中的氨基酸序列具有至 少70 %、优选地至少80 %、更优选地至少90 %、95 %、97 %或99 %的序列同一性。
[0121] 本发明的范围也包括多核苷酸，编码根据本发明的上述稀切内切核酸酶的载体。
[0122] 在本发明的范围中也包括易于通过工程化细胞、特别是T细胞的所述方法获得的 分离细胞或细胞系，其中，选自由⑶52、GR、TCRa和TCRI3组成的组的至少一种基因已经灭 活。优选地，选自由 CD52 和 GR、CD52 和 TCR a、CDR52 和 TCR β、GR 和 TCR a、GR 和 TCR β、 TCRa和TCRI3组成的组的两种基因已经灭活。
[0123] 根据本发明，优选地通过至少一种稀切内切核酸酶灭活那些基因。本发明人已经 显示，TALE-核酸酶的使用对在T细胞中实现双灭活尤其有利。本发明包括分离的T细胞， 其包括至少2种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少第一和第二TALE-核酸酶，优选地，针对 编码TCR基因的第一 TALE-核酸酶以及针对编码免疫抑制剂的受体的基因（如CD52或GR) 的第二TALE-核酸酶。
[0124] 在另一种实施方式中，所述分离的细胞进一步包括一种另外的基因组改变。在另 一种实施方式中，所述另外的基因组改变是至少一种外源多核苷酸序列的整合。在另一种 实施方式中，所述外源序列整合到选自由⑶52、GR、TCR a和TCR β组成的组中的至少一种 基因中。
[0125] 前 Τα
[0126] 在另一方面中，本发明涉及扩增TCRa缺陷T细胞的方法，该方法包括将ρΤα (也 称为前TCR a )或其功能变体引入至所述T细胞，并且可选地通过CD3复合物的刺激，扩增 所述细胞。在优选的实施方式中，该方法包括：
[0127] a)用编码至少一个pT a的片段的核酸转化所述细胞以支持⑶3表面表达，
[0128] b)使所述pT a表达至所述细胞中，
[0129] c)可选地通过⑶3复合物的刺激，可选地扩增所述细胞。
[0130] 本发明也涉及一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括用于T细胞扩增的方 法的步骤。
[0131] 在具体的实施方式中，可以随机或者通过同源重组引入PT a多核苷酸序列，尤其 是插入可以与TCRa基因的灭活有关。
[0132] 根据本发明，使用ρΤα的不同功能变体。肽的"功能变体"是指基本上类似于整个 肽或其片段的分子。本发明中PTa的"片段"或其功能变体是指该分子的任何亚组，也就 是说，较短的肽。优选的PTa或其功能变体可以是全长ρΤα，或者C-端短切的ρΤα版本。 C-端短切的ρΤα缺少C-端的一个或多个残基。作为非限制的实例，C-端短切的ρΤα版本 缺少来自蛋白质的C-端的18、48、62、78、92、110或114个残基（SEQIDN0 :107至SEQID NO: 114)。此外，肽的氨基酸序列变体可以通过编码肽的DNA的突变制备。例如，这样的功 能变体包括在氨基酸序列内残基的缺失或插入或取代。也可以进行缺失、插入和取代的任 何组合以得到最终结构，条件是最终结构具有期望的活性，尤其是功能性CD3复合物的恢 复。在优选的实施方式中，在如上面描述的不同PTa版本中引入至少一个突变以影响二聚 化。作为非限制的实例，突变的残基可以至少是人口了€1蛋白的1461?、0224、1(244、1?102八或 R117A，或者使用CLUSTALW方法在ρΤα家族或同系物成员上的对齐位置。优选地，如上面描 述的PTa或其变体包括突变的残基W46R(SEQ ID Ν0:123)或突变的残基D22A、K24A、R102A 和R117A(SEQ ID N0:124)。在具体的实施方式中，所述ρΤα或变体也融合至信号转导结 构域，如CD28、0X40、IC0S、CD27、CD137(4-1BB)和CD8作为非限制的实例（SEQIDN0:115 至SEQ ID NO: 120)。如上面描述的pT a或变体的细胞外结构域也可以融合至TCRa蛋白 的片段，尤其是TCRa的跨膜和细胞内结构域（SEQ ID Ν0:122)。ρΤα变体也可以融合至 TCRa的细胞内结构域（SEQ ID NO: 121)。
[0133] 在另一种实施方式中，所述pT a版本融合至细胞外配体结合结构域，并且更优选 地，pT a或其功能变体融合至单链抗体片段（scFV)，其包括通过柔性连接子连接的祀标抗 原特异性单克隆抗体的轻（')和重（V h)可变片段。作为非限制的实例，pT a或其功能变 体的氨基酸序列选自由SEQ ID NO: 107至SEQ ID NO: 124组成的组。
[0134] 因为一些可变性可以来源于衍生得到这些多肽的基因组数据，而且考虑到取代存 在于这些多肽中的一些氨基酸而不显著损灭活性的可能性（功能变体），本发明包括与该 专利申请中提供的序列享有至少70%、优选地至少80%、更优选地至少90%和甚至更优选 至少95%的同一性的上述多肽的多肽变体。
[0135] 本发明因而涉及包括以下多肽序列的多肽，该多肽序列具有与选自由SEQ ID NO: 107至SEQ ID NO: 124组成的组中的氨基酸序列具有至少70%、优选地至少80%、更优 选地至少90%、95%、97%或99%的序列同一性。
[0136] TCRa缺陷T细胞指的是缺少功能性TCRa链的表达的分离T细胞。这可以通过 不同方式达到，作为非限制的实例，通过工程化T细胞以使在它的细胞表面上不表达任何 功能性TCRa，或者通过工程化T细胞以使在它的表面上产生非常少的功能性TCR a链或通 过工程化T细胞以表达TCRa链的突变或短切形式。
[0137] TCRa缺陷细胞可以不再通过⑶3复合物扩增。因此，为了克服这个问题，并且允 许TCR a缺陷细胞增殖，将pT a或其功能变体引入至所述细胞，从而恢复功能性CD3复合 物。在优选的实施方式中，该方法进一步包括将能够通过DNA断裂选择性地灭活编码T细胞 受体（TCR)的一种组件的一种基因的稀切内切核酸酶引入至所述T细胞。在具体的实施方 式中，所述稀切内切核酸酶是TALE-核酸酶。作为非限制的实例，TALE-核酸酶针对选自由 SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO: 57至60组成的组的至少一种基因靶标序列。优选地，TALE-核 酸酶选自由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成的组。
[0138] 在具体的实施方式中，TCRa缺陷T细胞扩增的所述方法包括另外的基因组改变 步骤。另外的基因组改变步骤可以指的是向需工程化的细胞中引入一种感兴趣的蛋白质。 作为非限制的实例，所述感兴趣的蛋白质可以是嵌合抗原受体（CAR)、尤其是包括氨基酸序 列SEQ ID NO: 73的CAR，多链CAR、尤其是包括氨基酸序列SEQ ID NO: 125的多链CAR，双特 异性抗体，靶向TO⑶1或CTLA-4的稀切内切核酸酶、尤其是靶向核酸序列SEQ ID NO: 74至 SEQ ID NO:78或靶向如在本公开内容中所描述的免疫抑制剂的靶标的稀切内切核酸酶。
[0139] 在本发明中也包括编码pT a、特别是上面描述的功能性变体的多肽。在优选的实 施方式中，本发明涉及融合至信号转导结构域，如^28、(《40、1〇)5、^137和^8的？了€ [或 其功能变体。更特别地，本发明涉及PT a功能变体，其包括选自由SEQ ID NO: 107至SEQ ID N0:124组成的组中的氨基酸序列。在本发明中还包括多核苷酸、编码上面描述的pTa 或其功能变体的载体。
[0140] 在本发明的范围中，也包括易于通过所述方法获得的分离的细胞或细胞系。尤其 是，通过将PT a或其功能变体引入至所述细胞获得的分离的细胞或细胞系以支持CD3表面 表达。在优选的实施方式中，通过使TCRa基因灭活，进一步基因改变所述分离的细胞或细 胞系。优选地，通过至少一种稀切内切核酸酶灭活该基因。在优选的实施方式中，所述稀切 内切核酸酶是TALE-核酸酶。
[0141] 多链嵌合抗原#体（CAR)
[0142] 在另一种实施方式中，本发明涉及多链嵌合抗原受体（CAR)，其特别适合于本发明 工程化T细胞的生产和扩增。多链CAR包括以下组件中的至少两种：
[0143] a)包括Fc ε RI a链的跨膜结构域和细胞外配体结合结构域的一种多肽，
[0144] b)包括Fc ε RI β链的N-端和C-端细胞质尾部和跨膜结构域的部分的一种多肽 和/或
[0145] c)各自包括FcsRI γ链的胞质内尾部和跨膜结构域的部分的两种多肽，由此不同 的多肽多聚在一起自发地形成二聚体、三聚体或四聚体CAR。
[0146] 在图3中示出了四聚体CAR的一个实例。在图4中显示了多链CAR的不同版本。 多链CAR的一个实例包括氨基酸序列SEQ ID NO: 125。在本文中使用的术语"的部分"是 指分子的任何亚组，其是较短的肽。或者，多肽的氨基酸序列功能变体可以通过编码多肽的 DNA的突变制备。例如，这样的功能变体包括在氨基酸序列内残基的缺失、或插入或取代。也 可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终结构，条件是最终结构具有期望的活性， 特别是显示出特异性抗祀标细胞免疫活性。
[0147] 在优选的实施方式中，所述细胞外配体结合结构域是scFv。可以使用除scFv之外 的其它结合结构域，用于淋巴细胞的预定靶向，如骆驼状单结构域抗体片段或诸如血管内 皮生长因子多肽、整联蛋白结合肽、神经生长因子（heregulin)或IL-13突变蛋白的受体配 体，抗体结合结构域，抗体超变量环（hypervariable loop)或⑶R作为非限制的实例的。
[0148] 在优选的实施方式中，a)的所述多肽进一步包括在所述细胞外配体结合结构域和 所述跨膜结构域之间的茎区域。在本文中使用的术语"茎区域"通常指的是任何寡肽或多 肽，其起到连接跨膜结构域细胞与细胞外配体结合结构域的作用。尤其是，使用茎区域以向 细胞外配体结合结构域提供更多的柔性和可及性（accessibility)。茎区域可以包括至多 达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸，最优选地25至50个氨基酸。莖区域可以来 源于天然产生的分子的所有或部分，如来自CD8、CD4或CD28的所有或部分细胞外区域，或 来自抗体恒定区的所有或部分。或者，茎区域可以是合成的序列，其相当于天然存在的茎序 列，或者可以是完全合成的茎序列。
[0149] 在优选的实施方式中，a)、b)和/或c)的所述多肽进一步包括至少一种信号转导 结构域。在优选的实施方式中，所述信号转导结构域选自由⑶28、0X40、IC0S、⑶137和⑶8 组成的组。
[0150] 在优选的实施方式中，Fc ε RI α、β和/或γ链片段的所述C-端细胞质尾部进 一步包括TNFR相关因子2 (TRAF2)结合基序。在优选的实施方式中，FceRIa、β和/或 γ链片段的所述C-端细胞质尾部由协同刺激TNFR成员家族的胞质内尾部取代。协同刺激 TNFR家族成员的细胞质尾部包括，由大的保守基序（P/S/A)X(Q/E)E)或较小基序（PXQXXD) 组成的TRAF2结合基序，其中X是任何氨基酸。响应于受体三聚化，TRAF蛋白质补充至许 多TNFR的细胞内尾部。
[0151] 在另外的优选实施方式中，FceRIa、β和/或γ链的所述细胞质内结构域由 TCRG链的细胞质内结构域取代（也称为⑶3 ζ )。在另外的优选实施方式中，Fc ε RI a、β 和/或γ链的所述细胞质内结构域包括至少一种另外的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM)。 ITAM为在各种受体的胞质内尾部中发现的公知信号基序，其充当syk/zap70类酪氨酸激 酶的结合部位。在本发明中使用的ITAM的实例包括来源于TCR ζ、FCRy、FCRβ、⑶3 γ、 CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的那些。
[0152] 作为非限制的实例，在图4中示出了多链CAR的不同版本。
[0153] 在优选的实施方式中，多链CAR包括氨基酸序列SEQ ID NO: 125。本发明涉及包括 以下多肽序列的多肽，该多肽序列与选自由SEQ ID NO: 125组成的组中的氨基酸序列具有 至少70 %、优选地至少80 %、更优选地至少90 %、95 %、97 %或99 %的序列同一性。
[0154] 在本发明的范围中也包括多核苷酸，编码根据本发明的上面描述的多链CAR的载 体。
[0155] 在包括的【具体实施方式】中，本发明涉及一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法， 该方法包括将组成所述多链CAR的不同多肽引入至所述T细胞和扩增所述细胞。
[0156] 在另一种实施方式中，所述方法进一步包括基因改变所述细胞的步骤，其通过灭 活表达TCR的一种组件和/或免疫抑制剂的靶标的至少一种基因。在优选的实施方式中，所 述基因选自由TCR a、TCR β、⑶52和GR组成的组。在优选的实施方式中，所述方法进一步 包括将能够通过DNA断裂选择性地灭活所述基因的稀切内切核酸酶引入至所述T细胞。在 更优选的实施方式中，所述稀切内切核酸酶是TALE-核酸酶。根据本发明的优选的TALE-核 酸酶是识别和断裂选自由 SEQ ID Ν0:1 至 6(GR)，SEQ ID Ν0:37、57 至 60(TCRa)、SEQ ID N0:38或39(TCRβ)和SEQIDN0:40、SEQIDN0:61至SEQIDN0:65(CD52)组成的组的 靶标序列的那些。
[0157] 在具体的实施方式中，所述方法进一步包括另外的基因组改变步骤。另外的基因 组改变步骤可以指的是将一种感兴趣的蛋白质引入至需工程化的细胞中。所述感兴趣的蛋 白质可以是作为非限制的实例的双特异性抗体，靶向I 3DCDl或CTLA-4、pTa或其功能变体 的稀切内切核酸酶，如在本公开内容中所描述的。