B/t淋巴细胞弱化因子免疫原多肽及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的B/T淋巴细胞弱化因子免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR?T细胞免疫治疗的应用。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞增殖，（2）能促进T细胞与肿瘤表面抗原的特异性结合，（3）在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR?T等细胞疗法。
【专利说明】
B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽及其用途
技术领域
[0001] 本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的B/T淋巴细胞 弱化因子免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免 疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行 体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗 肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0003] B/T细胞弱化分子(BTLA)是最近发现的B/T淋巴细胞弱化因子家族共抑制分子，是 CD28家族成员，是与细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4及程序性死亡分子-1类似的抑制性受体。 主要表达于B细胞、T细胞和抗原递呈细胞表面。BTLA的配体是TNF超家族成员疱疹病毒进入 介质(HVEM) ^VEM-BTLA信号途径对T、B细胞的活化起负调节作用，在调节机体免疫应答，维 持自身免疫稳定中起着十分重要的作用，是目前肿瘤免疫治疗研究的热点之一。
[0004] 最近Gertner-Dardenne等认为淋巴瘤细胞可能通过BTLA介导的信号途径抑制y 5 T细胞的增殖(阻滞S期），使得肿瘤细胞免疫逃逸的发生。另外，BTLA在黑色素瘤特异性⑶8+ T细胞上高表达，并通过与其配体HVEM介导信号途径抑制肿瘤特异性CD8+T细胞的功能，对 BTLA信号途径封闭后可增强其增值活性及细胞因子的产生;对黑色素瘤患者接种CpG疫苗 后，可下调BTLA在肿瘤特异性CD8+T细胞和B细胞的表达，并且其下降程度与免疫接种的次 数呈正相关。Hobo等采用同种异基因干细胞过继治疗恶性血液病的研究中发现，BTLA在次 级组织相容性抗原(Minor histocompatibility antigens，MiHA)特异性⑶8+T细胞上高表 达并削弱T细胞的增值及细胞因子的产生，阻断其信号途径后可恢复其功能。这些研究均为 以BTLA作为靶点的肿瘤免疫治疗提供了线索。BTLA可与多重共抑制性分子(如PD-1、HM-3 等）同时表达在肿瘤特异性⑶8+T细胞并使T细胞功能障碍。Radvanyi等采用体外扩增黑色 素瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞进行过继细胞治疗时发现，BTLA+CDS+TILs数量与临床治 疗疗效呈高度正相关。提示BTLA在TILs细胞过继治疗恶性黑色素瘤中可能是一个新的重要 的生物标记物。
[0005] 随着对BTLA的深入研究，我们发现BTLA不但在T、B淋巴细胞、巨噬细胞、DC、NK、单 核细胞等固有免疫细胞表面表达，而且新近发现Y ST细胞、血液系统肿瘤细胞B细胞型恶性 肿瘤、多发性骨髓瘤细胞(MM)、急性髓系白血病细胞(AML)上也有表达。BTLA在肿瘤细胞上 的表达提示其可能是一个肿瘤标记物，检测其表达可能对临床诊断具有重要指导作用。
[0006] B/T淋巴细胞弱化因子可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，B/T淋巴细胞弱 化因子由414个氨基酸的蛋白，分子量较大，较难得到纯度高的B/T淋巴细胞弱化因子。这 样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明 提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
【发明内容】
[0007] 发明目的
[0008] 本发明提供一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫 原，增强T细胞免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
[0009] 技术方案
[0010] 本发明的技术方案在于提供一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，序列为 RRGDPWLLYSLLPSSLDFTTCFCLFCCLFFL(SEQ ID N0:1)。该氨基酸序列为全新的序列，在制备 用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的 应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
[0011] 有益效果
[0012] 本发明的B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞 技术中的免疫原。有益效果在于（1)促进T细胞增殖，（2)能促进T细胞与肿瘤表面抗原的特 异性结合，⑶在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR-T等细胞疗法。
【具体实施方式】
[0013]多肽由上海生工吉尔合成。
[0014] 实施例1
[0015]用人弥漫性大B细胞淋巴瘤移植瘤模型检测B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽的 体内活力。
[0016] 6-8W龄SCID小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。（1)空白组；（2)多肽低 剂量组；（3)多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。建立人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)移植瘤 模型，在接种DLBCL细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为:空白组加入相同体积的溶 剂，实验组多肽设3个剂量:0.5、1.0、2. Omg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存 活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效地保护小白鼠，在剂量〇.5、1.0、2.0mg/Kg时可 以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分别为41.27，65.12，78.31 %。
[0017] 实施例2
[0018]用人小细胞肺癌肿瘤模型检测B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽的体内活力。 [0019] 6-8w龄C57BL/6裸鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。（1)空白组；（2)多肽 低剂量组；（3)多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。建立人小细胞肺癌肿瘤模型，在接种肿瘤 细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3 个剂量：1.0、2.0、4. Omg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活 率。结果显不，多妝可有效地保护小白鼠，在剂量1.0、2.0、4. Omg/Kg时可以提尚荷瘤小鼠的 生存率，生存率分别为36.89，57.12，69.21 %。
[0020] 实施例3
[0021] T淋巴细胞的增殖作用:无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心（1000r/min，5min)，弃上清，TriS-NH4CL破解红细 胞，冰水浴静置3_5min，离心（1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷roS洗涤细胞两次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5 X106 个/ml，于96孔培养板中培养。
[0022] 实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买）、多肽各剂量(5.0、10.0、 20.0mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液lOOiil/孔后，空白对照组加入1640培养液 lOOyl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加 ConA(终浓度为5邱/1111)。37°(：细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20yl MTT，继 续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100y 1DMS0，震荡，用酶标仪检测570nm处0D值， 每孔设5个平行。
[0023]表1多肽对T淋巴细胞的增殖作用
[0025] *P〈0 ? 05，#P〈0 ? 01 与模型组相比。
[0026]实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5 ~20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
[0027] 实施例4
[0028] B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽的T细胞结合试验:采用玫瑰花环试验评价T细 胞与人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株(SUDHL-4)的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1640培养基 清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心1000转/分，10分钟，弃 上清，以Hank's液调细胞浓度为3 X 10%1。于96孔培养板中培养。
[0029] 实验设空白对照组、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入胸腺淋巴细胞 悬液100yl/孔后，空白对照组加入1640培养液500yl，多肽各剂量组在加入不同浓度的多 肽。37°C细胞培养箱，培养48h，培养结束后每孔中加入100iil/孔人弥漫性大B细胞淋巴瘤细 胞SUDHL-4(细胞浓度为1 X 106/ml，含10 %胎牛血清），混匀，500转/分，离心5分钟。弃上清， 加少量戊二醛，轻轻晃动，使细胞悬浮，加甲紫染色，400倍显微镜观察。凡结合3个以上肿瘤 细胞的T淋巴细胞为花环阳性细胞。记数100个T细胞中形成花环的淋巴细胞百分率，即为T 细胞与SUDHL-4细胞的结合率。每孔设5个平行。
[0030] 实验结果见表2,与空白组比较，B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽可以显著性增 加 T细胞与SUDHL-4细胞的结合率(P〈0.01)，低中高剂量组的结合率分别为67.33、81.33和 86.82%。在剂量为5~20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
[0031] 表2多肽对T细胞结合的影响
[0033] *P〈〇 ? 05，#P〈0 ? 01 与空白组相比。
【主权项】
1. 一种B/T淋巴细胞弱化因子免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列为SEQ ID NO: 1〇2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于:在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于:在制备用于肿瘤免疫细胞，增强Τ细胞免疫 应答药物中的应用。4. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于:在制备用于CAR-Τ细胞免疫治疗的应用。
【文档编号】C07K14/705GK105968189SQ201610438242
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司