[0158] 本发明也涉及易于通过工程化细胞的所述方法获得的分离的细胞或细胞系。尤其 是所述分离的细胞包括编码组成所述多链CAR的多肽的外源多核苷酸序列。
[0159] 灭活的PD⑶1或CTLA4T细朐
[0160] 另一种活化治疗性肿瘤免疫的方法是免疫检查点的阻断（封锁，blockade)。免 疫响应是通过刺激信号和抑制信号的制衡（抗衡，counterbalancing)调节。免疫检查点 蛋白质的表达可以通过肿瘤的异常调节，并且可以是重要的抗免疫机制。T-细胞功能的负 调节剂包括如CTLA-4的分子，其为一种关键的负调节分子，其下调T细胞活化和程序性死 亡-I (PDi)(也称为ro⑶1)的通路，ro⑶1是一种跨膜受体，当其结合至其配体（程序性死 亡配体1，ro-Ll)导致减少的细胞因子产量和T细胞增殖（Pardoll 2012)时，在活化的T 细胞上被上调。因此，抑制性信号的拮抗剂导致抗原特异性T细胞响应的放大。
[0161] 因此，本发明涉及工程化T细胞、尤其是用于免疫疗法的T细胞的方法，该方法包 括通过灭活参与免疫检测点，特别是I 3DCDl和/或CTLA-4的至少一种蛋白质基因改变T细 胞。
[0162] 在具体的实施方式中，该方法包括以下步骤之一：
[0163] (a)提供T细胞，
[0164] (b)向所述T细胞引入能够通过DNA断裂选择性灭活⑶1基因或CTLA-4基因的 稀切内切核酸酶；以及
[0165] (C)扩增所述细胞。
[0166] 在优选的实施方式中，所述稀切内切核酸酶是TALE-核酸酶。在本发明中，为了精 确靶向过继免疫疗法策略的相关基因，已经设计了新的TALE-核酸酶。根据本发明的优选 TALE-核酸酶是识别和断裂选自由 SEQ ID NO: 77 和 SEQ ID NO: 78 (PDCD-I)、SEQ ID NO: 74 至SEQ ID NO: 76 (CTLA-4)组成的组的靶标序列。本发明也涉及TALE-核酸酶多肽，其包括 选自由SEQ ID NO:79至SEQ ID N0:88组成的组的氨基酸序列。
[0167] 本发明也涉及包括以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与选自由SEQ ID N0:79 至SEQ ID N0:88组成的组中的氨基酸序列具有至少70%、优选地至少80%、更优选至少 90%、95%、97%或99%的序列同一性。在本发明的范围内也包括多核苷酸，编码根据本发 明的上述稀切内切核酸酶的载体。这种方法可以与在本公开内容中描述的不同方法的任何 一种有关。
[0168] 双特异件抗体
[0169] 根据进一步的实施方式，通过如先前描述的不同方法获得的工程化T细胞可以进 一步暴露于双特异性抗体。在离体给予患者之前或在体内给予患者之后，可以将所述T细 胞暴露至双特异性抗体。所述双特异性抗体包括具有不同抗原特性的两个可变区，其使得 工程化细胞能够接近靶标抗原。作为非限制的实例，所述双特异性抗体针对肿瘤标记物和 淋巴细胞抗原（如CD3)，并且具有再次引导和活化任何循环T细胞对抗肿瘤的潜力。
[0170] 涕送方法
[0171] 上面描述的不同方法涉及将PT α或其功能变体，稀切内切核酸酶、TALE-核酸酶， CAR或多链CAR，可选地用DNA末端加工酶或外源核酸引入至细胞中。
[0172] 作为非限制的实例，可以将所述ρΤα或其功能变体，稀切内切核酸酶、TALE-核 酸酶，CAR或多链CAR，可选地用DNA末端加工酶或外源核酸作为通过一种或作为不同的 质粒载体编码的转基因引入。不同的转基因可以包含在一种载体中，该载体包括编码核糖 体跳跃（ribosomal skip)序列的核酸序列，如编码2A肽的序列。2A肽，在小核糖核酸病 毒科的口蹄疫病毒亚组中被识别，引起在通过密码子编码的两个氨基酸之间没有肽键形成 的情况下，从一个密码子核糖体"跳跃"至下一个（参见Donnelly et al.，J. of General Virology 82:1013-1025(2001) ；Donnelly et al. , J. of Gen. Virology 78:13-21 (1997)； Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13):4227-4239 (2008) ；Atkins et al.，RNA13:803-810(2007))。"密码子"指的是在mRNA上（或在DNA分子的有义链上）的 三个核苷酸，其通过核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当通过在框架中的2A寡肽序列 分离多肽时，在mRNA内的单个连续开放读码框可以合成两种多肽。这样的核糖体跳跃机制 在本领域中是众所周知的，并且已知通过几种载体使用，用于通过单一信使RNA编码的几 种蛋白质的表达。作为非限制的实例，在本发明中，已经使用2A肽以将稀切内切核酸酶以 及DNA末端加工酶或多链CAR的不同多肽表达至细胞里。
[0173] 所述质粒载体可以包括选择标记，该选择标记提供接收所述载体的细胞的识别和 /或选择。
[0174] 由于编码所述多肽的多核苷酸引入至细胞，可以在细胞中原位合成多肽。或者，所 述多肽可以在细胞外产生，随后引入至其中。用于将多核苷酸结构引入至动物细胞的方法 在本领域中是已知的，并且包括作为非限制的实例的稳定转化方法，其中，多核苷酸结构整 合至细胞的基因组中；瞬时转化方法，其中，多核苷酸结构不整合至细胞的基因组中；以及 病毒介导的方法。可以将所述多核苷酸引入至细胞，通过例如，重组体病毒载体（例如逆转 录病毒、腺病毒）、脂质体等。例如，瞬时转化方法包括例如显微注射、电穿孔或粒子轰击。 考虑到在细胞中被表达，所述多核苷酸可以包含在载体中，更特别地在质粒或病毒中。
[0175] -电穿孔
[0176] 在本发明更优选的实施方式中，根据本发明的编码多肽的多核苷酸可以是直接引 入至细胞中的mRNA，例如，通过电穿孔。本发明人确定了在T细胞中mRNA电穿孔的最佳条 件。
[0177] 本发明人使用细胞波技术，其允许通过使用脉冲电场，瞬间渗透活细胞用于将物 质递送到细胞中。该技术，基于使用PulseAgile (Cellectis property)电穿孔波形，给予 脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔的精确控制（美国专利6, 010, 613和国际PCT申 请TO2004083379)。可以改变所有这些参量以便以最小的死亡率达到高转染率的最好条 件。基本上，第一高电场脉冲允许孔形成，而随后的较低电场脉冲允许多核苷酸移动至细胞 中。在本发明的一个方面中，本发明人描述以下步骤，其致使在T细胞中mRNA的转染率达 到>95%，以及使用电穿孔方案以在T细胞中瞬时表达不同种类的蛋白质。尤其是本发明 涉及一种转化T细胞的方法，包括使所述T细胞接触RNA，并且向T细胞施加由以下组成的 agile脉冲序列：
[0178] (a) -个电脉冲，具有2250至3000V/cm的电压范围、0.1 ms的脉冲宽度以及步骤 (a)和（b)的电脉冲之间的0. 2至IOms的脉冲间隔；
[0179] (b) -个电脉冲，具有2250至3000V的电压范围、IOOms的脉冲宽度以及步骤（b) 的电脉冲和步骤（c)的电脉冲之间的IOOms的脉冲间隔；以及
[0180] (c) 4个电脉冲，具有325V的电压、0.2ms的脉冲宽度以及在4个电脉冲的每一个 之间的2ms的脉冲间隔。
[0181] 在【具体实施方式】中，转化T细胞的方法包括使所述T细胞接触RNA，并且向T细胞 施加由以下组成的agile脉冲序列：
[0182] (a) -个电脉冲，具有 2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、 2600、2700、2800、2900或3000V/cm的电压范围，0.1 ms的脉冲宽度以及步骤（a)和（b)的 电脉冲之间的0. 2、0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOms的脉冲间隔；
[0183] (b) -个电脉冲，具有 2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、 2500、2600、2700、2800、2900或3000￥的电压范围，10〇1118的脉冲宽度以及在步骤〇3)的电 脉冲和步骤（c)的第一电脉冲之间的IOOms的脉冲间隔；以及
[0184] (c) 4个电脉冲，具有325V的电压、0.2ms的脉冲宽度以及在4个电脉冲的每一个 之间的2ms的脉冲间隔。
[0185] 在上面描述的值范围中包括的任何值都公开在本申请中。电穿孔介质可以是在本 领域中已知的任何适合的介质。优选地，电穿孔介质具有范围在0. 01至1. 0毫西门子范围 内的电导率。
[0186] 在【具体实施方式】中，作为非限制的实例，所述RNA编码稀切内切核酸酶，稀切内切 核酸酶的一种单体，如半-TALE-核酸酶、嵌合抗原受体、多链嵌合抗原受体的至少一种组 件、PT α或其功能变体、外源核酸、一种另外的催化结构域。
[0187] T细朐的活化和扩增
[0188] 无论在T细胞基因改变之前或之后，通常使用如，例如，在美国专利6, 352, 694 ; 6, 534, 055 ；6, 905, 680 ；6, 692, 964 ；5, 858, 358 ；6, 887, 466 ；6, 905, 681 ；7, 144, 575 ； 7, 067, 318 ；7, 172, 869 ；7, 232, 566 ；7, 175, 843 ；5, 883, 223 ；6, 905, 874 ；6, 797, 514 ； 6,867,041 ;和美国专利申请出版号20060121005中描述的方法，可以活化和扩增T细胞。T 细胞可以在体外或在体内扩增。
[0189] 一般来说，本发明的T细胞通过与以下表面接触而扩增，该表面具有附着至其的 试剂和配体，该试剂刺激与信号相关的CD3TCR复合物，该配体刺激在T细胞的表面上的协 同刺激分子。
[0190] 尤其是，可以在体外刺激T细胞群，如通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段，或在 表面上固定的抗-CD2抗体接触，或者通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂（例 如，苔藓抑素）接触。对于在T细胞表面上辅助分子的协同刺激，使用结合辅助分子的配 体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞的群可以与抗-CD3抗体和抗-CD28抗 体接触。为了刺激⑶4+T细胞或者⑶8+T细胞增殖，抗-⑶3抗体和抗-⑶28抗体。例如， 提供每个信号的试剂可以是在溶液中或偶联至表面。如本领域技术人员可以很容易理解 的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒径。在本发明进一步的实施方式中， 细胞（如T细胞）与涂有试剂的珠粒结合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在可替 换的实施方式中，在培养之前，没有分开涂有试剂的珠粒和细胞，而是一起培养。通过允许 抗-⑶3和抗-⑶28 (3x28个珠粒）附连至其的顺磁性珠粒接触T细胞，可以连接细胞表面 蛋白。在一种实施方式中，细胞（例如，4至10个T细胞）和珠粒（例如，1:1的比率的 DYNABEADS? M-450⑶3/⑶28 T顺磁性珠粒）在缓冲液中结合，优选地，PBS (无二 价阳离子如，钙和镁）。此外，本领域技术人员可以很容易理解可以使用任何细胞浓度。可 以培养混合物几小时（约3小时）到约14天或在其间的任何小时整数值。在另一种实施 方式中，可以培养混合物21天。适用于T细胞培养的条件包括合适的培养基（例如，最小 必需培养基或RPMI培养基1640或，X-vivo 5 (Lonza))，其可以包括增殖和活力所需的因 子，包括血清（例如，胎牛血清或人血清）、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、 GM-CSF、-10、-2、IL-15、TGFp和TNF-或技术人员已知的任何用于细胞生长的其它添加剂。 用于细胞生长的其它添加剂包括，但不限于，表面活性剂、人血浆蛋白成分（Plasmanate) 和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-硫基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、A1MV、DMEM、 MEM、a_MEM、F_12、X-Vivo 1、和 X-Vivo 20、优化剂（optimizer)，以及添加的氨基酸、丙酮 酸钠和维生素，无血清或用适量的血清（或血浆）或限定组的激素和/或足以使T细胞生 长和扩增的一定量细胞因子补充。抗生素，例如，青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中， 不包含在将被灌注至受试者的细胞培养物中。例如，在支持生长所必需的条件下，例如，合 适的温度（例如，37°C )和气氛（例如，空气加5% CO2)下保持靶细胞。已暴露至不同刺激 次数的T细胞可以表现出不同的特征。
[0191] 在另一种具体的实施方式中，通过用组织或细胞共培养可以扩增所述细胞。所述 细胞也可以在体内扩增，例如在所述细胞给予至受试者之后，在受试者的血液中。
[0192] 改夺的T细朐
[0193] 在本发明的范围中，也包括根据先前描述的任何一种方法获得的分离的T细胞。 根据本发明的所述T细胞可以来源于干细胞。干细胞可以是成体干细胞、胚胎干细胞、更特 别地，非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或 定向造血干细胞。代表性的人类细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞也可以是树突细胞、 NK细胞、选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细 胞组成的组的B细胞或T细胞。在另一种实施方式中，所述细胞可以来源于由CD4+T淋巴 细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在本发明的细胞扩增和基因改变之前，通过各种非限制 的方法可以从受试者中获得细胞来源。T细胞可以从大量非限制的来源获得，包括外周血液 单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾 组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域技术人员可获得的和已知的任 意数量的T细胞系。在另一种实施方式中，所述细胞可以来源于健康供体、来源于诊断患有 癌症的患者或来源于诊断患有感染的患者。在另一种实施方式中，所述细胞是呈现不同的 显型特征的细胞混合群的部分。在本发明的范围中也包括根据先前描述的方法从转化的T 细胞中获得的细胞系。耐受免疫抑制治疗并且易于通过先前方法获得的改变细胞在包括在 本发明范围内。
[0194] 在另一种实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞包括一种灭活的基因，该基 因选自由⑶52、GR、TCRa和TCRI3组成的组，和/或所述分离的细胞表达CAR、多链CAR和 /或PTa转基因。在另一种实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞包括两种灭活的基 因，该两种基因选自由CD52和GR、CD52和TCRa、CDR52和TCR0、GR和TCRa、GR和TCR^、 TCRa和TCRI3组成的组，和/或所述分离的细胞表达CAR、多链CAR和/或pTa转基因。
[0195] 在另一种实施方式中，通过灭活TCR a基因和/或TCR β基因，使得TCR在根据本 发明的细胞中是非功能性的。上述策略更具体地用于避免GvHD。在本发明的具体方面中， 是获得来源于个体的改变细胞的方法，其中，所述细胞可以不依赖于主要组织相容性复合 体信号通路增殖。所述方法包括以下步骤：
[0196] (a)从所述个体回收细胞；
[0197] (b)通过灭活TCR α或TCR β基因离体基因改变所述细胞；
[0198] (C)在放大所述细胞的适当条件下在体外培养基因改变的T细胞。
[0199] 易于通过这种方法获得的改变的细胞包括在本发明的范围内，该改变的细胞可以 不依赖于主要组织相容性复合体信号通路增殖。本发明的具体的方面中，所述改变的细胞 可以用于治疗需要其的患者对抗宿主抗移植物（HvG)反应和移植物抗宿主疾病（GvHD);因 此，在本发明的范围内是治疗需要其患者对抗宿主抗移植物（HvG)反应和移植物抗宿主疾 病（GvHD)的方法，包括通过给予所述患者有效量的改变的细胞来治疗所述患者，该改变的 细胞包括灭活的TCR α和/或TCR β基因。
[0200] 治疗应用
[0201] 在另一种实施方式中，通过不同方法获得的分离的细胞或来源于如先前描述的所 述分离的细胞的细胞系可以用作为药物。在另一种实施方式中，所述药物可以用于在需要 其的患者中治疗癌症或感染。在另一种实施方式中，根据本发明的所述分离的细胞，或来源 于所述分离的细胞的细胞系可以用于制备在需要其的患者中用于治疗癌症或病毒感染的 药物。
[0202] 另一方面，本发明涉及用于治疗需要其的患者的方法，所述方法包括以下步骤中 的至少一个：
[0203] (a)提供通过先前描述的方法的任一个可获得的T细胞；
[0204] (b)将所述转化的T细胞给予所述患者。
[0205] 在一种实施方式中，本发明的所述T细胞可以经受稳健的体内T细胞扩增，并且可 以持续延长量的时间。
[0206] 所述治疗可以是缓解性的、治愈性的或预防性的。它可以是自体免疫疗法的部分 或自体免疫疗法治疗的部分。自体指的是用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群源于所述 患者或人类白细胞抗原（HLA)相容性供体。异体指的是用于治疗患者的细胞或细胞群不是 来源于所述患者而是来源于供体。
[0207] 本发明特别适用于异体免疫疗法，目前它使得通常从供体获得的T细胞能够向非 同种反应性细胞转化。可以在标准方案下进行该转化并且根据需要复制许多次。可以将产 生的改变的T细胞混合（pool)并给予至一个或几个患者，作为可用的"现货"治疗产品。
[0208] 可以与公开的方法一起使用的细胞在以前的节段中描述。所述治疗可以用于治疗 诊断患有癌症、病毒感染、自身免疫失调或移植物抗宿主疾病（GvHD)的患者。可以治疗的 癌症包括未血管化，或尚未显著血管化的肿瘤，以及血管化肿瘤。癌症可以包括非实体肿瘤 (如血液肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤），或者可以包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的各种 类型的癌症包括，但不限于，恶性上皮肿瘤，母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性 肿瘤，良性和恶性肿瘤，和恶性肿瘤，例如，肉瘤、恶性上皮肿瘤和黑色素瘤。也包括成体肿 瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。
[0209] 它可以是与选自抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激 素疗法、激光疗法和放射疗法的组中的一种或多种对抗癌症的疗法组合的治疗。
[0210] 根据本发明的优选实施方式，可以将所述治疗给予至经受免疫抑制治疗的患者。 实际上，本发明优选地涉及细胞或细胞群，由于编码这种免疫抑制剂的受体的基因灭活，已 使其对至少一种免疫抑制剂具有耐受性。在这个方面，免疫抑制治疗应有助于在患者体内 根据本发明的T细胞的选择和扩增。
[0211] 根据本发明的细胞或细胞群的给予可以以任何便利的方式进行，包括通过气溶胶 吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。在本文中描述的组合物可以由皮下、皮内、瘤内、鼻内 (intranodally)、髓内、肌肉内，通过静脉或淋巴管注射，或腹膜内给予患者。在一种实施方 式中，优选地，通过静脉注射给予本发明的细胞组合物。
[0212] 细胞或细胞群的给予，可以由IO4-IO9个细胞/kg体重，优选地10 5至10 6个细胞/ kg体重（包括在那些范围内细胞数量的所有整数值）的给予量组成。可以以一个或多个剂 量给予细胞或细胞群。在另一种实施方式中，以单剂量给予所述有效量的细胞。在另一种 实施方式中，在时间段内以大于一个剂量给予所述有效量的细胞。给予的时间安排在主治