治疗自体免疫疾病的trkb激动剂的制作方法

专利名称：治疗自体免疫疾病的trkb激动剂的制作方法
本申请要求在2006年12月20日提交的美国临时申请60/870,918的优先权，其在这里通过引用以其整体被并入本文。
发明领域 本发明涉及治疗影响中枢神经系统的自身免疫疾病，包括多发性硬化。本发明提供减少中枢神经系统组织的白细胞侵袭的酪氨酸受体激酶B(TrkB)激动剂。

背景技术：
多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘自身免疫疾病，以炎症、脱髓鞘和轴突损害为特征。该疾病影响全世界超过百万的人和在女性中的流行性是在男性中的两倍。MS的征状通常出现在20岁和40岁之间的年龄段。尽管已经研究该疾病的特征，MS的病因尚不清楚。这类特征包括对CNS组织的损害、小神经胶质细胞的激活、促炎细胞因子的产生、抑制T-细胞迁移和克隆型扩张、改变的巨噬细胞效应子作用、MHC的产生、上调、和由T-细胞浸润的直接CNS攻击。
认为实验性的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是MS的标准模型。已经使用鼠疾病模型来研究MS的病因和评估用于其治疗的药物(Aharoni，R.等人，2005a)。EAE的临床特征包括由大量浸润的淋巴细胞和巨噬细胞导致的CNS的炎症和脱髓鞘。用髓磷脂的数个不同蛋白成分(包括髓磷脂碱蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白质(PLP)和髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG))对小鼠进行主动免疫诱导产生自身免疫抗体和上行性麻痹的临床病征。该疾病可以是急性的或慢性的，取决于小鼠种系和用于免疫的髓磷脂蛋白。已经使用EAE来研究MS的病因和评估对其治疗的药物(Aharoni，R.等人，2005a)。
MS主要由T-细胞对髓磷脂的应答产生，所述髓磷脂是在神经组织中丰富的多肽。脱髓鞘和临床瘫痪产生于Th1表型的T-细胞导致的CNS组织的侵袭，所述T细胞对髓磷脂抗原具有特异性。Th1产生炎症细胞因子，包括TNF-α和IFN-γ。对CNS的损害也可能由其它免疫应答导致，包括产生自身免疫抗体和补体激活。在MS的早期和晚期，及在整个疾病过程中发现多种同型的髓磷脂碱蛋白(MBP)特异性抗体的EAE中有B-细胞参与。从脑和脊椎组织制备的切片显示白细胞侵袭(特别是淋巴细胞和巨噬细胞)和神经系统下衬组织的破坏。
格拉默(Glatiramer)乙酸酯(GA，COPAXONE)是被批准用于治疗MS和其它疾病的免疫抑制药物(Arnon，R.等人，2003)。该药物在EAE模型中也是有效的。GA是产生抗炎症细胞因子的Th2/3细胞的诱导物，其穿过血脑屏障在CNS中聚集。这些细胞因子在CNS的组织中产生多种影响，和导致局部产生其它生长因子，例如IL-10、TGF-β和BDNF(Aharoni，R.等人，2003)。延长的GA施用与NT3、NT4和BDNF的更高水平表达有关(Aharoni，R.等人，2005b)。
NT3、NT4和BDNF是对于神经发育、加工生长、突触可塑性、保护和存活重要的小同源二聚体蛋白的神经营养蛋白(NT)家族的成员。NT包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、NT3、NT4(也称为NT4/5)、NT6和NT7。NT通过与称为受体酪氨酸激酶(也称为酪氨酸受体激酶)的受体家族相互作用影响靶标细胞。这些受体包括数个高分子量(130-150kDa)、高亲和力(～10-11M)酪氨酸受体激酶(Trk)受体和称为低分子量(65-80kDa)、低亲和力(～10-9M)的受体(LNGFR、p75NTR或p75)。NT结合特异性受体酪氨酸激酶导致受体二聚化和内在酪氨酸激酶结构域的激活。NGF优选结合酪氨酸受体激酶A(TrkA)、BDNF，而NT4结合酪氨酸受体激酶B(TrkB)，而NT3结合酪氨酸受体激酶C(TrkC)。全部NT弱结合p75。
对EAE小鼠CNS组织中的BDNF和NT4的报道(Aharoni，R.等人，2003，2005b)表明NT和/或其受体在多发性硬化和相关疾病中的作用。
参考文献 Aharoni，R.et al.(2005a)J.Neurosci.258217-28.Aharoni，R.et al.(2005b)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 10219045-50. Aharoni，R.et al.(2003)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA10014157-62. Aharoni，R.et al.(1997)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA9410821-26. Arnon，R.et al.(2003)J.MoI.Recognit.16412-21. Davies，A.et al.(1993)Neuron 11565-74. Karnezis，T.et al.(2004)Nat.Neurosci.7736-44. Padlan，E.et al.(1995)FASEB J.133-39. Steinman and Zamvil(2006)Ann.Neurol.6012-21. 另外的参考文献，特别是涉及标准操作和方法的参考文献在正文通常被引用。在以上和在申请其它处引用的全部专利、专利申请、Genbank输入号、参考手册和公开案在这里以其整体被引入作为参考。
发明简述 一方面，本发明提供减少中枢神经系统组织的白细胞侵袭的方法，包括以激活TrkB受体的有效量将包含TrkB激动剂的组合物施用于需要此治疗的哺乳动物受试者，由此减少中枢神经系统组织的白细胞侵袭。本发明还提供TrkB激动剂在制备药物中的用途，所述药物用于减少哺乳动物的中枢神经系统组织的白细胞侵袭。
在一些实施方案中，所述哺乳动物具有自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是试验性的自身免疫性脑脊髓炎。在另一实施方案中，所述自身免疫性疾病是多发性硬化。在其它实施方案中，所述自身免疫性疾病与免疫排斥、视神经疾病、炎性肠病、或帕金森病有关。在优选的实施方案中，该哺乳动物是人。
在一些实施方案中，该TrkB激动剂是天然存在的TrkB激动剂。在一个实施方案中，所述天然存在的TrkB激动剂是NT4。在相关实施方案中，所述天然存在的TrkB激动剂包含NT4的天然存在的片段或衍生物。在一些实施方案中，所述NT4的片段或衍生物结合和激活TrkB。在另一实施方案中，所述天然存在的TrkB激动剂是BDNF。在相关实施方案中，所述天然存在的TrkB激动剂包含BDNF的天然存在的片段或衍生物。在一些实施方案中，所述BDNF的片段或衍生物结合和激活TrkB。
在另一实施方案中，所述TrkB激动剂是抗体。在具体的实施方案中，该抗体是抗体38B8。在另一实施方案中，该抗体由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生。在一些实施方案中，所述TrkB激动剂是人抗体。在相关实施方案中，所述TrkB激动剂是人源化的抗体。在一些实施方案中，所述TrkB激动剂是抗体片段或衍生物。在具体的实施方案中，该抗体片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc或单链(ScFv)抗体。在一些实施方案中，所述抗体片段包含激动剂抗体38B8的抗原结合区域。在一些实施方案中，该抗体片段包含由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的抗体的抗原结合区。在相关的实施方案中，该抗体片段包含激动剂抗体38B8的互补决定区(CDR)。在相关的实施方案中，该抗体片段包含由保藏在ATCC保藏号PTA-8766杂交瘤系产生的抗体的互补决定区(CDR)。
在优选的实施方案中，所述侵入的白细胞包括T-细胞和巨噬细胞。在具体的实施方案中，所述侵入的白细胞包括表达CD3和表达CD68的白细胞。在优选的实施方案中，所述中枢神经系统的组织是脑组织或脊椎组织。
在有关的方面，本发明提供治疗影响中枢神经系统的自身免疫疾病的方法，包括向需要此治疗的哺乳动物受试者施用包含足够激活TrkB受体的TrkB激动剂的量的组合物，由此减少中枢神经系统的组织的白细胞侵袭。本发明还提供TrkB激动剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗影响哺乳动物的中枢神经系统的自身免疫疾病。
在一个实施方案中，该自身免疫疾病是试验性自身免疫性脑脊髓炎。在另一实施方案中，所述自身免疫性疾病是多发性硬化。在其它实施方案中，所述自身免疫性疾病与免疫排斥、视神经疾病、炎性肠病、或帕金森病有关。在优选的实施方案中，该哺乳动物是人。
在一些实施方案中，所述TrkB激动剂是天然存在的TrkB激动剂。在一个实施方案中，该天然存在的TrkB激动剂是NT4。在相关实施方案中，该天然存在的TrkB激动剂包含NT4的天然存在的片段或衍生物。在一些实施方案中，所述NT4的片段或衍生物结合和激活TrkB。在另一实施方案中，该天然存在的TrkB激动剂是BDNF。在相关实施方案中，该天然存在的TrkB激动剂包含BDNF的天然存在的片段或衍生物。在一些实施方案中，所述BDNF的片段或衍生物结合和激活TrkB。
在另一实施方案中，所述TrkB激动剂是抗体。在具体的实施方案中，所述抗体是抗体38B8。在另一实施方案中，所述抗体由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生。在一些实施方案中，所述TrkB激动剂是人抗体。在相关的实施方案中，所述TrkB激动剂是人源化的抗体。在一些实施方案中，所述TrkB激动剂是抗体片段或衍生物。在具体的实施方案中，该抗体片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc或单链(ScFv)抗体。在一些实施方案中，该抗体片段包含激动剂抗体38B8的抗原结合区。在一些实施方案中该抗体片段包含由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的抗体的抗原结合区。在相关实施方案中，该抗体片段包含激动剂抗体38B8的互补决定区。在相关实施方案中，该抗体片段包含由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的抗体的互补决定区(CDR)。
在优选的实施方案中，所述侵入性白细胞包括T-细胞和巨噬细胞。在具体的实施方案中，所述侵入性白细胞包含表达CD3和表达CD68的白细胞。在优选的实施方案中，所述中枢神经系统的组织是脑组织或脊椎组织。
在另一方面，本发明提供减少中枢神经系统的组织中白细胞侵入的试剂盒的部分，包含可有效激活TrkB受体量的TrkB激动剂和使用说明书。在相关方面，本发明提供治疗影响中枢神经系统的自身免疫疾病的试剂盒的部分，包含可有效激活TrkB受体的量的TrkB激活剂和使用说明书。
在另一实施方案中，本发明涉及TrkB激动剂抗体38B8，例如分离的单克隆38B8抗体。在另一实施方案中，本发明涉及由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的分离的TrkB激动剂抗体。在一些实施方案中，所述TrkB激动剂是38B8的抗体片段或衍生物。在另一实施方案中，所述TrkB激动剂是由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的抗体的抗体片段或衍生物。在具体的实施方案中，该抗体片段选自衍生自38B8的Fab、Fab1、F(ab′)2、Fv、Fc、单链(ScFv)抗体。在具体的实施方案中，该抗体片段选自由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc、或单链(ScFv)抗体。在一些实施方案中，该抗体片段包含激动剂抗体38B8的抗原结合区。在一些实施方案中，该抗体片段包含由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的激动剂抗体的抗原结合区。在相关实施方案中，该抗体片段包含激动剂抗体38B8的互补决定区(CDR)。在相关实施方案中，该抗体片段包含由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的激动剂抗体的互补决定区(CDR)。在另一实施方案中是产生TrkB激动剂抗体38B8的细胞或产生衍生自38B8的片段的细胞。在另一实施方案中是保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系。
本发明也涉及本文所述的任何的TrkB激动剂用于治疗本文所述的任何自身免疫疾病。本发明还提供药物组合物，包含本文所述的任何TrkB激动剂和药物可接受的载体。
在另一实施方案中，本发明涉及包含核苷酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列编码本文所述的任何TrkB激动剂。在一个具体的实施方案中，是包含核苷酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列编码由保藏在ATCC保藏号PTA-8766的杂交瘤系产生的激动剂抗体。本发明还涉及包含这里所述的任何核酸分子的载体，其中该载体任选包含操纵性连接于核酸分子的表达控制序列。
另一实施方案提供宿主细胞，该细胞包含本文所述的任意的载体或包含本文所述的任意的核酸分子。本发明还提供分离的细胞系，其产生这里所述的任意的抗体或抗原结合部分或其产生所述抗体或所述抗原结合部分的重链或轻链。
在另一实施方案中，本发明涉及产生TrkB激动剂抗体或其抗原结合部分的方法，包括在合适的条件下培养本文所述的任意的宿主细胞或细胞系和回收所述抗体或抗原结合部分 本发明还涉及包含本文所述的任意核酸的非人的转基因动物或转基因植物，其中该非人的转基因动物或转基因植物表达所述核酸。
本发明还提供分离TrkB激动剂抗体或其抗原结合部分的方法，包括从本文所述的非人的转基因动物或转基因植物分离抗体的步骤。
本发明的这些和其它的方面从本发明的描述和下列实例中是显而易见的。
附图简述

图1A和1B绘图显示在MOG-诱导数周之后在EAE动物中的相对发病率。MOG是在第0天被施用。(A)在第10天开始，动物接受NT4(10mg/kg)或仅接受作为对照的媒质的每日施用。(B)用对照IgG(10mg/kg；n＝9)、NT4(10mg/kg)从第3天到第9天(n＝8)、或NT4(10mg/kg)从第9天到第15天(n＝8)治疗动物。
图2描述了显示对于四个受体酪氨酸激酶(即，TrkA、TrkB、TrkC和p75)的四个受体酪氨酸激酶激动剂(即，NGF、BDNF、NT4和38B8)相对亲和力的系列图。X-轴显示时间(全部在300-450秒范围内)。Y-轴显示相对亲和力。第一行坐标图的最高刻度依次为(从左到右)90、20、50和60单位；第二行坐标图的最高刻度依次为32、60、60、140单位；第三行坐标图的最高刻度依次为35、35、16和20单位；第四行坐标图的最高刻度依次为90、80、100和90单位。这些数据在本文和在实施例4中被进一步描述(包括表2)。
图3描述在MOG诱导后第9天时用TrkB激动剂治疗的动物中发病率的示意图。动物在第9天和16天接受5mg/kg TrkB激动剂抗体38B8或非特异性的IgG(对照)。根据下列评分系统评估小鼠每日EAE的临床征状0＝正常；1＝无力尾；2＝中度后肢虚弱；3＝适度的严重后肢虚弱(动物仍然能够艰难行走)；4＝严重后肢虚弱(动物可以移动其后肢但是不能行走)；5＝完全的后肢瘫痪；和6＝死亡。
图4描述在MOG诱导后第16天时用TrkB激动剂治疗的动物中发病率的示意图。动物在第16天和23天接受5mg/kg TrkB激动剂抗体38B8或媒质(PBS)。
图5A和5B描述了在疾病进行晚期，在治疗动物中的发病率。(A)动物在第18和23天接受5mg/kg TrkB激动剂抗体38B8或非特异性IgG。(B)动物在第22天开始接受每日施用GA(COPAXONE)或仅媒质(对照)。
图6A和6B描述了在施用TrkB激动剂或地塞米松的动物中的发病率和体重。动物接受38B8(5mg/kg，在第9和第16天每周)、或在第3-12天每日接受地塞米松(4mg/kg)或乙醇媒质(对照)。(A)如上测量发病率。(B)在疾病发生的整个过程中测量动物的体重。
图7A和7B描述了TrkB激动剂在减少疾病发病率中的效果是剂量依赖的。(A)动物在第9和16天接受1mg/kg或5mg/kg的TrkB激动剂38B8。(B)动物在第9和16天接受5mg/kg或10mg/kg的38B8、或PBS(对照)。
图8描述了使用体外测定在量增加的数个TrkB激动剂抗体(38B8、23B8、36D1、37D12和19H8)存在下神经元存活的相对量。该试验操作和结果在本文和实施例1中被描述(例如，表1)。在神经元存活测定中各个抗体的EC50值被显示在表1的第3栏。
图9描述了显示在未治疗(对照)动物和用TrkB激动剂抗体38B8治疗的动物中指示的MOG-特异性抗体同种型的相对水平的系列图。各个图显示在经TrkB激动剂(38B8)治疗的动物或未治疗(对照)的动物中指示抗体同种型的量(如通过测量在450μm的光吸收确定)。
图10描述了显示脾细胞刺激测定的结果的图。脾细胞来自MOG-诱导的未治疗(对照)动物或MOG诱导的经TrkB激动剂抗体(38B8)治疗的动物，在仅MOG或MOG与TrkB激动剂抗体(38B8；50μl/mg)组合，或在两种不同浓度之一的地塞米松(10-8M和10-5M)存在下体外培养该细胞。
图11描述了从经对照(A)和TrkB激动剂治疗的动物(B)移取的脊椎切片的免疫化学染色的结果。该切片的髓磷脂用勒克司坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色而细胞体用甲酚紫染色。
图12描述了从经对照(A)和TrkB激动剂治疗的动物(B)移取的脊椎切片的免疫化学染色的结果。该切片是用CD3的特异性的抗体染色。
图13描述了从经对照(A)和TrkB激动剂治疗的EAE动物(B)移取的脊椎切片的免疫化学染色的结果。该切片是用CD68的特异性的抗体染色。
图14描述了从经对照和TrkB激动剂治疗的EAE动物中移取的脊椎切片的组织学染色的结果。该切片用勒克司坚牢蓝(Luxol FastBlue)染色髓磷脂。缺少着色表示脱髓鞘的区域。
发明详述 定义 本文所用术语“酪氨酸受体激酶”和“受体酪氨酸激酶”被可互换使用，指其TrkB是成员的分子类型。配体(激动剂)与受体酪氨酸激酶的结合引起配体-诱导的受体二聚化和在细胞内激酶结构域中酪氨酸残基的自磷酸化作用。继酪氨酸磷酸化之后是多种信号级联的激活，例如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt、MAPK1和PLC-途径，其一般是以细胞类型特异性的方式调节基因表达。
本文所用″侵入的白细胞″是侵入、浸润或迁移进入中枢神经系统(CNS)组织(包括脑和脊椎组织)的白细胞，其为自身免疫疾病，优选影响CNS的自身免疫疾病的结果。侵入性白细胞主要是T-细胞和单核细胞，尽管可能存在其它白细胞。
本文所用″减少的白细胞侵入″指减少的白细胞迁移(即，侵入或浸润)进入CNS组织(包括脑和脊椎组织)。减少白细胞侵入也指减少由白细胞侵入介导的细胞毒影响，特别针对下衬的神经元细胞和/或CNS组织的其它支持细胞。白细胞侵入包括由T-细胞和单核细胞的侵入。减少白细胞侵入包括保护CNS组织免受自身免疫攻击。由白细胞侵入破坏的CNS的细胞包括表达髓磷脂的细胞和临近的不表达髓磷脂的细胞。细胞破坏可能是通过凋亡、坏死或其组合。减少的白细胞侵入减少以下列临床适应症为特征如疾病恶化减慢、发作或发病率的严重性延迟、存活延长、生命质量改善、认知、活动或行为症状减少或稳定化。减少白细胞侵入也包括预防或减少白细胞迁移进入中枢神经系统(CNS)组织的风险。白细胞侵入减少可以是部分的或完全的，例如，如本文所述，该减少可以是相对或实际减少的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或甚至约95％。
本文所用″TrkB受体激动剂″或″TrkB激动剂″是增加TrkB受体的激活量的分子，产生与由天然存在的激动剂BDNF和NT4导致的相似的效果。TrkB激活通常由受体诱导的自身磷酸化发生，其开启特征性的细胞内信号转导事件的级联反应。TrkB受体激动剂增加这一活化，例如，通过调节受体二聚化或磷酸化，通过调节天然存在的激动剂的结合、通过模拟天然存在的激动剂的结合、通过引起TrkB受体在更长(包括无限)时期内保持活化(例如，磷酸化)状态、或者调节TrkB激活或开启细胞内事件的级联反应，其为TrkB受体激活的特征。TrkB激动剂包括天然存在的激动剂多肽、片段、变体和其衍生物，包括但不限于已知的TrkB激动剂NT4和BDNF。TrkB激动剂包括激动剂抗体、片段、变体和其衍生物。本文描述了优选的TrkB激动剂特性。本发明的TrkB激动剂可以增加TrkB的激活至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。本文所用″片段″多肽是保留较大多肽的至少一些生物特性(例如激活TrkB受体的能力)的所述较大多肽的部分。优选的片段包含产生所述较大多肽的生物特性的所述较大多肽的氨基酸残基和/或结构。多肽片段可以被称为肽，尽管在这里的多肽和肽之间没有区别。本文描述了示例性片段。可以如本文所述衍生片段。
本文所用″衍生物″多肽具有一个或多个共价或非共价的修饰，例如加入或移去功能基团或部分。本文提供了衍生物的例子。
本文所用的特定多肽序列的″变体″被定义为在多肽序列之一的某长度范围与特定的多肽序列具有至少40％序列同一性的多肽序列，使用诸如Clustal V或BLAST算法，例如″BLAST 2 Sequences″工具2.0.9版本(May7，1999)，按照默认参数设置。这类多肽对可能在多肽之一的某定义的长度内显示，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更多的序列同一性。
本文所用应用于多肽序列的″序列同一性″，指在至少两个多肽序列之间残基匹配的百分数，其使用标准化算法比对，例如Clustal V、MEGALIGN或BLAST。多肽序列比对的方法是众所周知的。一些比对方法说明保守氨基酸的取代。如本文所述的这类保守的取代，和通常在取代位点保存了电荷和疏水性，因此保留了多肽的结构(和由此其功能)。
如这里使用的，″可有效激活TrkB受体的量″或与TrkB激动剂有关的类似表达，指与施用TrkB受体激动剂之前基线水平的激活相比足够增加TrkB受体激活的量(如在这里定义和本技术领域公知的)。激活的增加可以是至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。这一量应该考虑用药途径，TrkB激动剂在体内的半衰期、TrkB激动剂的溶解度、生物利用度、清除率和其它的药物代谢动力学特征，动物或患者的体重和代谢等。又见TrkB激动剂。
本文所用″需要治疗的动物″或类似表达指患有发展涉及CNS的自身免疫疾病或有其风险的动物，优选哺乳动物，包括人。影响CNS的自身免疫疾病(或病征，没有区别)的例子是小鼠中的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)、人中的多发性硬化(MS)、和在其它哺乳动物中发现的相似的自身免疫疾病。也在例如，免疫排斥、视神经疾病、炎性肠病、和帕金森病中观察到CNS的自身免疫攻击。
本文所用″天然存在的TrkB激动剂″是天然存在的和作为TrkB受体的激活剂起作用的分子。TrkB受体公知的天然存在的激动剂是神经营养素NT4和BDNF。天然存在的TrkB激动剂包括天然存在的变体分子，例如在具有突变的TrkB等位基因的动物中表达的神经营养素多肽。
本文所用“分离的抗体”指基本没有其它具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异性结合TrkB的分离的抗体基本没有特异性结合除了TrkB之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合TrkB的分离的抗体可能对其它抗原(例如来自其它物种的TrkB分子)具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本没有其它细胞物质和/或化学药物。
本文所用术语″单克隆抗体″或″单克隆抗体组合物″指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单结合特异性和亲和力。
一般技术 本发明应用在分子生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域使用的常规技术。这类技术在参考文献中被描述，例如，MolecularCloningA Laboratory Manual，second edition(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait编辑，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.CeIHs编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和CC.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel，等人，编辑，1987)；PCRThe Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人，编辑，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；lmmunobiology(CA.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical approach(D.Catty.编辑，IRL Press，1988-1989)；monoclonal antibodiesa practicala pproach(P.Shepherd和C Dean，编辑，Oxford University Press，2000)；Using antibodiesa laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，编辑，Harwood AcademicPublishers，1995). TrkB激动剂 本发明提供使用TrkB激动剂治疗多发性硬化和其它影响中枢神经系统(CNS)的自身免疫疾病的方法。根据本发明的一个特征，TrkB激动剂有效减少白细胞侵入CNS的组织和减少CNS的下衬神经元组织的破坏，并因此缓解这一疾病的临床现象，例如肢体麻痹。具体的，TYkB激动剂减少单核细胞和T-细胞的迁移，其具有呈递髓磷脂抗原和向产生它们的细胞施用细胞毒性效应的活性。
使用MS的良好接受的动物模型(实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠)进行了导致本发明的观察。EAE是实验性疾病状态，其与人中的MS共享许多临床和病理的特征。许多FDA-批准的MS治疗是基于在小鼠和大鼠中的EAE模型第一次被发现并发展的(由Steinman和Zamvil综述，2006)。在使用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的肽35-55免疫之后，可以在C57BL/6小鼠中诱导EAE(Aharoni，R.等人，2005a)。用MOG免疫诱导髓磷脂-特异性的自身免疫反应，其导致与MS相似的脱髓鞘和发病率。
使用TrkB激动剂的动物试验 在支持本发明而执行的试验中，已经表明，在患CNS-特异性的自身免疫疾病的动物中直接施用TrkB激动剂减少发病率和CNS组织损伤(图1A和1B)。在MOG-诱导之后将天然存在的TrkB激动剂NT4的重组形式施用于EAE动物(实施例5)。用NT4治疗的动物显示与对照动物相比显著减少的发病率。这一结果证明施用TrkB激动剂在减缓慢性EAE发展中是有效的。更多的试验表明，关于症状的发作，在早期施用NT4时提供的保护至少与在晚期施用一样好(即使不更好)，且为了治疗有效而用TrkB激动剂治疗不必持续至病征发作之时(图1B)。TrkB活化可以是在EAE的诱导中相对上游的靶标步骤。
实施例1-4和6描述了TrkB抗体，其中的一些基于它们刺激TrkB的生物活性(即激活TrkB的能力)，作为TrkB激动剂起作用(例如，实施例6和表1和2)。数个抗体，包括抗体38B8，是对TrkB特异性的，且显示对测定的其它受体酪氨酸激酶没有显著的结合。与天然存在的激动剂BDNF和NT4(其显示一些交叉反应性)相比，抗体38B8对于TrkB受体更加具有选择性。在实施例4和表2中提供这些配体-受体相互作用的动力学分析。
动物试验显示，与对照免疫球蛋白相比，TrkB激动剂抗体提供免于EAE发病的显著保护(图3，实施例7)。当在MOG-诱导之后迟至16天，和在临床症状发作之后施用时，TrkB激动剂抗体是有效的(图4)。与格拉默乙酸酯(GA)的比较提示，TrkB激动剂的活性机制与GA和其它目前的MS药物不同(图5)。其它的结果证明TrkB激动剂的有益效果与免疫抑制剂-地塞米松的效果相似(图6A和6B)。TrkB激动剂抗体的有益效果是剂量依赖性的(图7A和7B)。
使用神经元细胞存活测定证明，TrkB激动剂以与天然存在的TrkB激动剂一致的方式影响神经元细胞(实施例8)。加入增加量的TrkB激动剂抗体导致增加的神经元存活(图8)。在实施例1中被描述了在神经元存活测定和在人KIRA测定中TrkB激动剂抗体38B8、23B8、36D1和37D12的EC50值并总结子表1。
治疗MS的目前的药物(包括GA和地塞米松)是免疫调节剂。TrkB激动剂抗体未表明通过抑制抗-MOG抗体的产生而起作用，并因此，未表明作为常规免疫抑制剂作用(图9，实施例9)。而且，TrkB激动剂抗体的存在对脾细胞刺激没有如同免疫抑制剂-地塞米松的明显效果(图10)。用TrkB激动剂治疗的动物保留产生正常抗-MOG T-细胞和/或B-细胞应答的能力。这些观察表明免疫抑制剂-地塞米松和TrkB激动剂的活性机制不同，且TrkB激动剂的活性机制在白细胞增殖水平上不是主要的。
组织学分析显示从用TrkB激动剂治疗的动物制备的切片中减少的白细胞侵入。一些TrkB激动剂-治疗的动物显示实际上没有CNS白细胞侵入的证据(图11)。通过染色表达CD3的T-细胞和表达CD68的巨噬细胞来执行侵入细胞的鉴定。与对照动物相比，来自用TrkB激动剂治疗的动物的脊椎组织显示T-细胞和单核细胞侵入实质性减少(图12和13)。严重的脱髓鞘区域在对照小鼠中而非用TrkB激动剂治疗的小鼠中(图14)。CNS组织切片的组织化学染色的结果证明，TrkB激动剂治疗减少CNS的淋巴细胞和单核细胞的侵入。
以上所述的结果证明，TrkB激动剂有效减少CNS的白细胞侵入和减缓EAE(广泛接受的MS的动物模型)的进展。该天然存在的TrkB激动剂NT4和TrkB激动剂抗体在减缓疾病发展中都是有效的。所述激动剂抗体显示出对TrkB的最大选择性并用于进一步的研究。TrkB激动剂的有益效果是剂量依赖性的，随着TrkB激动剂增加，发病率减小。与目前的MS药物不同，TrkB激动剂不是主要通过免疫抑制起作用。组织化学试验显示TrkB激动剂减少T-细胞和单核细胞的CNS组织侵袭。
用于CNS自身免疫疾病的TrkB激动剂 不为理论所限，认为TrkB激动剂主要通过调节白细胞的迁移起作用。细胞免疫可能在MS中占优势，使TrkB激动剂成为比当前影响体液免疫的免疫抑制剂更有效类型的药物。而且，本方法可以与当前的免疫抑制治疗组合以产生另外的治疗效果。
可以使用本发明的TrkB激动剂在多个自身免疫或相关疾病中减少CNS组织的白细胞侵袭。除了是MS的模型，也使用EAE小鼠研究视神经炎。TrkB激动剂预期在由尤其是白细胞侵入介导的全部这些疾病和其它自身免疫疾病中减轻CNS免疫侵入。注意术语疾病和病征的使用没有区别。
本发明的特征是向患有自身免疫疾病的动物直接施用TrkB激动剂。尽管以多肽的方式描述本发明的优选的实施方案，本发明包含施用编码这类TrkB激动剂多肽的多核苷酸，其将在体内指导编码的TrkB激动剂的表达。直接的DNA注射和基因治疗递送的方法是本技术领域公知的。将TrkB激动剂多肽，或编码它们的多核苷酸与通过施用药物(例如GA)诱导相反，直接施用于动物。本发明还包含素拟肽分子，其以与天然存在的TrkB激动剂和/或激动剂抗体一致的方式结合和激活TrkB。
根据本文所述的方法使用的具体的TrkB激动剂在以下进行了更加详细的描述。另外的TrkB激动剂是对本技术领域的技术人员之一而言显而易见的，而不背离本发明的范围。
天然存在的TrkB激动剂和其衍生物 TrkB激动剂包括天然存在的激动剂多肽，包括但不限于公知的TrkB激动剂NT4和BDNF。NT4和/或BDNF多肽序列可能来自与相应的TrkB受体相同的物种，或来自不同的物种，只要产生的多肽结合于TrkB和作为激动剂起作用。
TrkB激动剂包括天然存在的和变体的NT4(即，NT-4/5和相似的名称)。NT4多肽被描述在美国专利申请公开2005/0209148、2003/0203383和2002/0045576，和在PCT WO 2005/08240中。NT4(即，NT4/5)多肽已经在许多哺乳动物中被鉴定。目标氨基酸取代包括G77至K、H、Q或R；和R84至E、F、P、Y或W。可以除去蛋白酶切割位点以延长NT4和BDNF多肽的半衰期，或加入蛋白酶切割位点以允许其活性的调节。TrkB激动剂可以是缀合或融合于延长半衰期部分，例如PEG，IgG Fc区域，白蛋白，或肽或表位，例如Myc、HA(血凝素)，His-6或FLAG。
BDNF多肽也已经在许多哺乳动物中被鉴定(见，例如，美国专利5,180,820和美国专利申请公开2003/0203383)。
本发明的天然存在的和变体的NT4和BDNF多肽包括嵌合体、变体、片段(包括肽)、和/或其衍生物。优选的片段包括天然存在的多肽的TrkB结合部分，或嵌合的、共有的或突变的与其相当的结合部分。片段包括合成的肽。变体包括具有保守和非保守的氨基酸取代的天然存在的氨基酸序列变体。
保守的取代涉及相似大小、电荷或疏水性的氨基酸残基。例如，Ala可以由Val、Leu或Ile取代。Arg可以由Lys、Gln或Asn取代。Asn可以由Gln、His、Lys或Arg取代。Asp可以由Glu取代。Cys可以由Ser取代。Gln可以由Asn取代。Glu可以由Asp取代。Gly可以由Pro取代。His可以由Asn、Gln、Lys或Arg取代。Ile可以由Leu、Val、Met、Ala、Phe或正亮氨酸取代。Leu可以由正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala或Phe取代。Lys可以由Arg、Gln或Asn取代。Met可以由Leu、Phe或Ile取代。Phe可以由Leu、Val、Ile或Ala取代。Pro可以由GIy取代。Ser可以由Thr取代。Thr可以由Ser取代。Trp可以由Tyr取代。Tyr可以由Trp、Phe、Thr或Ser取代。VaI可以由Ile、Leu、Met、Phe、Ala或正亮氨酸取代。
可以通过选择性取代实现功能上的重要修饰，其在维持以下的影响上显著不同(a)在取代区域中多肽骨架的结构，例如，作为折叠(sheet)或螺旋构象，(b)在靶标位点上分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。基于一般侧链特性被分组天然存在的残基(这些中的一些可以落入数个功能基团) (1)疏水的Met、Ala、Val、Leu、Ile、正亮氨酸； (2)中性亲水的Cys、Ser、Thr； (3)酸性Asp、Glu； (4)碱性Asn、Gln、His、Lys、Arg； (5)芳香族的Trp、Tyr、Phe；和 (6)引起转折的残基Gly和Pro。
非保守的取代将一类中的成员与另一类中的成员交换或涉及在先前段落中未鉴定为保守的取代。
变体包括天然存在的氨基酸序列变体和基因工程的变体，只要产生的多肽或衍生物结合于TrkB和作为激动剂起作用。在本文和所引用的参考文献中描述了测量TrkB活性的测定。
更多的变体包括具有来自酪氨酸受体激酶的Trk家族的其它相关配体(包括NT3和NGF)的部分氨基酸序列的TrkB激动剂多肽。变体还包括具有共有的Trk或共有的受体酪氨酸激酶结合和/或激活序列的多肽。
其它衍生物包括共价和非共价修饰的肽和多肽(例如，酰化、聚乙二醇化、法尼基化、糖基化或磷酸化的多肽)。特殊的聚乙二醇化的和其它修饰形式的NT4被描述在美国专利申请公开2005/0209148中。该多肽可以包括另外的功能基团来调节结合和/或活性，使能够在体内成象、调节半衰期、调节穿过血脑屏障的运输或帮助将多肽靶向特定的细胞类型或组织。多肽可以包含氨基酸取代以利于修饰(例如，加入聚乙二醇化、糖基化或其它位点)，只要该取代不实质影响该多肽结合于TrkB或激动剂活性。
常见的修饰是聚乙二醇化以降低系统清除率且最少丧失生物活性。使用本技术领域公知的方法，可以将聚乙二醇聚合物(PEG)连接于NT4和BDNF多肽(以及TrkB激动剂抗体)的多个功能基团(见，例如，Roberts等人(2002)，Advanced Drug Delivery Reviews54459-476；Sakane等人(1997)Pharm.Res.141085-91)。可以将PEG连接于，例如，氨基基团、羧基基团、修饰的或天然的N-末端、胺基团和巯基基团。在一些实施方案中，用PEG分子修饰一个或多个表面氨基酸残基。PEG分子可以是不同大小的(例如，范围从约2至40kDa)。连接于NT4、BDNF或其它多肽的PEG分子可以具有的分子量约为2000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000Da的任意。PEG分子可以是单个链或支链的。为了将PEG连接于TrkB激动剂多肽，可以使用在一个或两个末端具有功能基团的PEG的衍生物。基于在多肽上可获得的反应基团类型选择功能基团。连接衍生物到多肽的方法是本领域公知的。
已经产生聚乙二醇化的NT4并显示在动物中作为NT4起作用(见，例如，美国专利申请公开2005/0209148的实施例6和7和PCT WO2005/082401)。在成熟的人NT4位置50的丝氨酸残基可以被替换为半胱氨酸以产生NT4-S50C，而后被聚乙二醇化，其中所述PEG被连接于在位置50的半胱氨酸。N-末端特异性连接到PEG的一个例子是将位置1的残基突变为丝氨酸或苏氨酸，以利于聚乙二醇化。相似的方法应用于BDNF和在本发明中使用的其它多肽。
多肽或其衍生物可以直接的或经由合成的接头被连接于其它分子。与其价值已被报道的天然存在的TrkB激动剂相比，优选的TrkB激动剂多肽、片段或其衍生物显示相似或更好的结合亲和力、选择性和活化。小部分的激动剂多肽可以被称为“肽”，尽管这一术语不应视为限制。
在本文所述的多个试验和测定(包括动力学测定、EAE动物模型、KIRA测定和神经元存活测定)中，优选的TrkB激动剂显示与BDNF和NT4相比相似的生物特性。
TrkB抗体激动剂及其衍生物 TrkB激动剂包括激动剂抗体、片段、变体及其衍生物。合适的激动剂抗体是对TrkB有选择性的，且以与天然存在的NT4和BDNF多肽相似或更多的亲和力结合。然而，与天然存在的TrkB激动剂相比，抗体的长期循环半衰期使结合亲和力较不关键。测定抗体38B8的结合亲和力为46±10nM(见上述和实施例4)。使用在实施例4中描述的具体的测定条件，优选的TrkB激动剂抗体具有的Kd为少于100nM、少于10nM、少于1nM、少于100pM或甚至少于10pM。
在本文所述的多个试验和测定(包括结合测定、EAE动物模型、KIRA测定和神经元存活测定)中，优选的TrkB激动剂也呈现与抗体38B8(和天然存在的激动剂)相比相似的生物特性。例如，在实施例1(包括表1)中所述的神经元存活测定中，优选的TrkB激动剂呈现的EC50值为少于11pM。优选的TrkB激动剂具有的EC50值为从约1pM至约10pM、从约0.1pM至约1pM、从约0.01pM至约0.1pM或甚至低于0.01pM。示例性的EC50值是38B8为0.2pM和36D1为5pM。使用KIRA测定，优选的TrkB激动剂也呈现与抗体38B8相比相似的生物特性(实施例1，包括表1)。优选的TrkB激动剂具有的EC50值在KIRA测定中为少于50nM，优选从约5nM至少于50nM，从约0.5nM至约5nM或甚至低于0.5nM。在提供的测定条件下，示例性的EC50值是约5nM。
TrkB激动剂抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、杂交的、共有的、嵌合的、双特异性或缀合的抗体。如果可应用，该抗体可以是任意的同种型(即，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)。抗体包括抗体片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc和单链(ScFv)抗体)。合适的TrkB激动剂抗体或其功能片段或衍生物以本文所述的方式，例如，关于单克隆抗体激动剂38B8，结合于并激活TrkB。TrkB激动剂抗体包括抗体片段，其包括包含衍生自抗体的氨基酸序列的多肽。特别重要的是参与抗原识别的氨基酸序列，例如在CDR区域中的那些。
单克隆抗体和小鼠杂交瘤方法是本领域众所周知的。非人抗体用于治疗人的用途可以耐受与免疫抑制药物组合。这类药物被常规施用治疗或减少MS和其它自身免疫和炎症疾病的症状。免疫调节药物是本领域公知的且包括糖皮质激素、杀细胞物质(例如，烷化剂、抗代谢药、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巯嘌呤)、细胞毒性抗体(例如，T-细胞受体和IL-2-特异性抗体)、对嗜免疫剂发挥作用的药物(例如，环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、雷帕霉素(rapamicin)、雷帕鸣(RAPAMUNE)、普乐可复(PROGRAF)和FK506)、干扰素(例如，IFN-β)、鸦片、TNF-结合蛋白(例如，循环受体)、麦考酚酯和用于抑制动物对外源抗体或治疗抗原的免疫应答的其它生物剂。
人源化源自不同物种(例如小鼠)的单克隆抗体的方法是本领域众所周知的。为了治疗人，优选人或人源化的抗体。人源化的抗体包含最小量的非人氨基酸序列，这样它们在人中是最小限度免疫原性或非免疫原性的。优选的人源化抗体不被人免疫系统识别为外源。这类抗体可以是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2)或其它包含抗原结合必须的氨基酸残基的免疫球蛋白链部分，在抗原结合位点外的主要氨基酸序列衍生自人免疫球蛋白。在互补决定区(CDR)之内的氨基酸残基也可以由人特异性的残基取代，只要抗原结合没有不利影响。
人抗体是唯一地或基本包含人抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体也包括包含至少一种人重链多肽或至少一种人轻链多肽的抗体或其重要片段，任选与来自另一动物的重链或轻链组合。一个这类例子是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
合适的TrkB激动剂抗体、片段或其衍生物可以在转基因动物、哺乳动物细胞(包括B-细胞)、鸟类细胞、昆虫细胞、酵母或细菌中表达或分泌。例如，可以通过免疫能够产生全部为人免疫球蛋白或基本为人免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)产生合适的人抗体。也可以通过基因改组(gene-shuffling)、噬菌体展示、大肠杆菌展示、核糖体展示、mRNA展示、蛋白质片段互补或RNA-肽筛选产生抗体。用于设计和产生人源化和人的抗体及其衍生物的方法被描述在，例如，美国专利7,005,504、6,800,738、6,407,213、6,054,297、6,331,415，和5,750,373(Genentech)；美国专利6,833,268、6,207,418、6,114,598，和6,075,181(Abgenix)；美国专利6,498,285(Alexion)；美国专利7,074,557、5,885,793、5,837,242、5,733,743、5,565,332(Cambridge Antibody Technology)；美国专利7,118,879、6,979,538、6,326,155、5,994,125、5,837,500(Dyax)；美国专利6,753,136、6,667,150、6,300,064、5,514,548(MorphoGen/Protein Design Labs)；和6,461,824、6,204,023、5,821,123、5,595,898、5,576,184、4,698,420(Xoma)；美国专利7,041,870、6,680,209、6,500,931、6,111,166、6,096,311、6,071,517、6,063,116(Medarex)；和美国专利4,816,397(Celltech)。用于产生人或人源化的抗体的方法也被描述在Vaughan等人(1996)Nature Biotechnology 14309-14；Sheets等人(1998)Proc.Natl Acad.ScL USA 956157-6162；Hoogenboom和Winter(1991)J.MoI.Biol.，227381；Marks等人(1991)J.MoI.Biol.，222581；Cole等人(1985)in Monoclonal Antibodies和CancerTherapy(Alan R.Liss)p.77；和Boerner等人，1991，J.Immunol.，147(1)86-95。
可对TrkB激动剂抗体进行共价或非共价的修饰(例如，乙酰化的、聚乙二醇化的(见例如，实施例5)、法尼基化、糖基化、磷酸化等)并也可以包括另外的功能基团来调节结合、调节激动剂活性、使多肽在体内能够成象、调节多肽的半衰期或调节运输穿过血脑屏障。多肽可能包含利于修饰的氨基酸取代(例如，另外的聚乙二醇化、糖基化或其它位点)，只要该取代基本不影响多肽与TrkB的结合或激动剂活性。多肽或其衍生物可以直接或经由合成的接头被连接于其它分子。
如本文和所可用的参考文献中所述，合适的抗体片段或衍生物包含介导TrkB-结合和激活的氨基酸残基。主要由在六个小环区域中的残基确定抗体特异性，所述环区域被称为互补决定区(CDR)或高变环，位于轻链和重链的N-末端附近。在轻链中的CDR通常是在氨基酸残基24和34(CDR1-L)、50-56(CDR2-L)和89-97(CDR3-L)之间。在重链中的CDR通常是在氨基酸残基31和35b(CDR1-H)、50-65(CDR2-H)和95-102(CDR3-H)之间。一些CDR的长度比其它更加可变。CDR1-L长度变化从约10-17个残基，而CDR3-H长度变化从约4-26个残基。其它的CDR是适当的标准长度。Padlan，E.A.等人(1995)FASEB.J.133-39。在本发明中使用的优选的TrkB激动剂抗体片段包含来自CDR或来自CDR内的重链和/或轻链结构域的氨基酸残基。
如上所述和本领域公知的，本发明使用的抗体包括天然存在的氨基酸序列变体，其具有保守和非保守的氨基酸取代。
与天然存在的TrkB激动剂相比，优选的TrkB激动剂抗体、片段或其衍生物显示出相似或更好的结合亲和力、选择性和激活能力。小部分的激动剂多肽可以被称为“肽”，尽管这一术语不应被解释为限制。
TrkB激动剂制剂 可以将TrkB激动剂用于制备药物，该药物用于治疗影响中枢神经系统的自身免疫疾病(例如多发性硬化)。如本文定义的，在这一方式中，可以使用包含TrkB激动剂的组合物来治疗哺乳动物(包括人患者)中的疾病。TrkB激动剂组合物还可以包含合适的药物可接受的赋形剂，其为本领域公知的。尽管可以使用其它施用形式，TrkB激动剂组合物通常被配制为通过注射(例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内等)施用。可以将TrkB激动剂配制为用于注射的制剂，通过将其溶解、悬浮或乳化于含水或非水的溶剂(例如植物或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、较高级脂肪酸或丙二醇的酯)；且如果需要，含常规的添加物，例如，增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域众所周知的，且包括如下材料例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可膨胀的聚合物、亲水或疏水材料、明胶、油、溶剂、水等等。将依赖于应用本发明的化合物的方法和目的来决定使用的具体载体、稀释剂或赋形剂。通常，安全的溶剂是非毒性的含水溶剂，例如水和其它可以溶解和混合于水中的无毒性溶剂。合适的含水溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG400、PEG300)等及其混合物。该制剂也可以包括一个或多个缓冲液、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明物质、助流剂、操作助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂和其它已知的添加剂以提供药物的适当存在(即，本发明的化合物或其药物组合物)或帮助制备制药产物(即，药物)。一些制剂可以包括载体(例如脂质体)。脂质体的制剂包括，但不限于，细胞转染剂、多层脂囊和单层囊泡。用于胃肠道和非胃肠道药物递送的赋形剂和制剂如Remington，The Science and Practice ofPharmacy(2000)中所述。
施用和剂量 在本文示例的施用方案和治疗剂量是基于这类因素，例如动物体重、在血液中TrkB激动剂的半衰期和TrkB激动剂的亲和力。优选的施用方案和剂量使在施用之间维持TrkB激动剂在体内的治疗量。NT的有效剂量范围(包括天然存在的TrkB激动剂)在本文和在Davies等人(1993)和在其它参考文献中被示例。激动剂抗体的有效剂量范围在这里被示例(例如，在EAE动物中1-10mg/kg)，并提供用于确定类似激动剂抗体的最适剂量的起点。
如执行支持本发明的试验证明的(见，例如，图1B、3和4)，在疾病过程早期的“脉冲治疗”似乎足以降低动物的发病率。对于治疗效率无需持续施用TrkB激动剂。
具体剂量方案(即，剂量、时间和重复)将决定于待治疗的人或动物的年龄、病情和体重。可以从动物试验推断起始的给药方案。TrkB激动剂施用的时间/频率应该基于当施用时具体TrkB激动剂的循环半衰期(或在神经组织中的半衰期)、穿过血脑屏障的激动剂的量、激动剂在细胞中的半衰期、毒性和副作用。
在本研究中，通过腹膜内(i.p.)注射来施用TrkB激动剂；但其它施用途径(例如，静脉内、皮下、肌肉内)也预期有效。颅内或脊柱内的施用(或施用于CNS的其它组织)可能是有效的。其它施用途径也可适合，决定于具体的TrkB激动剂、其包被、缀合或具体的生物特性(例如，口服、舌下、滑膜内、粘膜、经皮、关节内、阴道内、肛门、尿道、鼻、耳、经由吸入、喷注、经由导管、作为弹丸、以支架或其它可植入装置、以栓状组合物、以静脉滴注、以贴片或溶解薄膜等)。
TrkB激动剂优选是经由合适的外周途径施用。虽然如此，应该理解小百分比的激动剂可能穿过血脑屏障并被递送至中枢神经系统的细胞。在一些情况下，能够进入CNS的外周施用TrkB激动剂的量很小(甚至少于1％)。
本发明的特征是将TrkB激动剂直接施用于患有自身免疫疾病的哺乳动物受试者。“直接”意指将TrkB激动剂多肽或多核苷酸通过标准接种途径递送于动物。可以将TrkB激动剂与其它药理制剂组合递送于动物，包括免疫抑制剂，例如，糖皮质激素、杀细胞剂(例如，烷化剂、抗代谢剂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巯嘌呤)、细胞毒性抗体(例如，T-细胞受体和IL-2-特异性抗体)、作用于嗜免疫剂的药物(例如，环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、雷帕霉素)、干扰素(例如，IFN-β)、鸦片、TNF-接合蛋白(例如，循环受体)、麦考酚酯和其它用于抑制动物对外源抗体或治疗抗原的免疫应答的生物物质。
TrkB激动剂抗体超过天然存在的TrkB激动剂的优点是与循环的蛋白配体相比倾向具有相对长的循环半衰期的抗体。例如，当天然存在的激动剂可能需要每日施用时，抗体可能仅需要每周施用。另一优点是，抗体倾向于具有更高的接合亲和力，且相比细胞受体对其蛋白配体而言，抗体对于其抗原更有选择性。
使用TrkB激动剂的治疗可以与对多发性硬化和相关病征的常规治疗组合。用于治疗和处置多发性硬化的常规药物包括，但不限于ABC(即，Avonex-Betaseron/Betaferon-Copaxone)治疗(例如，干扰素β1a(AVONEX，REBIF)、干扰素β1b(BETASERON，BETAFERON)和格拉默乙酸酯(COPAXONE)；化学治疗剂(例如，米托蒽醌(NOVANTRONE)、硫唑嘌呤(IMURAN)、环磷酰胺(CYTOXAN，NEOSAR)、环孢菌素(SANDIMMUNE)、甲氨蝶呤和克拉屈滨(LEUSTATIN)；皮质类固醇和促肾上腺皮质激素(ACTH)(例如，甲泼尼松龙(DEPO-MEDROL、SOLU-MEDROL)、泼尼松(DELTASONE)、泼尼松龙(DELTA-CORTEF)、地塞米松(MEDROL、DECADRON)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和促皮质素(ACTHAR)；疼痛介导(触物感痛)(例如，卡马西平(TEGRETOL、EPITOL、ATRETOL、CARBATROL)1加巴喷丁(NEURONTIN)、托吡酯(TOPAMAX)、唑尼沙胺(ZONEGRAN)、苯妥英(DILANTIN)、地昔帕明(NORPRAMIN)、阿米替林(ELAVIL)、丙米嗪(TOFRANIL、IMAVATE、JANIMINE)、多塞平(SINEQUAN1 ADAPIN1 TRIADAPIN，ZONALON)、普罗替林(VIVACTIL)1大麻和合成的大麻素(MARINOL)、已酮可可碱(TRENTAL)、布洛芬(NEUROFEN)、阿司匹林、醋氨酚和羟嗪(ATARAX)；和其它的治疗(例如，那他珠单抗(ANTEGREN)、阿仑珠单抗(CAMPATH-1H)、4-氨基吡啶(FAMPRIDINE)、3，4二氨基吡啶、依利罗地、IV免疫球蛋白(GAMMAGARD，GAMMAR-IV，GAMIMUNE N，IVEEGAM，PANGLOBULIN，SANDOGLOBULIN，VENOGLOBULIN)、普瑞巴林和齐考诺肽)。
试剂盒部分 本发明也提供实践本发明的方法的试剂盒部分(试剂盒)。试剂盒包括适当分离和灭菌的TrkB激动剂和根据本文所述本发明的任意方法使用的说明书。通常，这些说明书包括对如何施用TrkB激动剂的描述。该试剂盒可能还包括说明书，其用于鉴定需要治疗和监测或测量治疗效果的动物。说明书通常包括有关剂量、剂量方案(施用频率)和施用途径的信息。在试剂盒中提供的说明书可以是文字的或以数据文件或表格的机器/计算机可读的形式。
该试剂盒也可以包含施用TrkB激动剂的仪器，包括注射器、针头、导管、吸入器、泵、乙醇交换、纱布、CNS活组织检查仪器、组织抗体和染料等。按照需要对试剂盒的成分灭菌。试剂盒还可以提供另外的药理制剂，包括，但不限于，免疫抑制剂，例如GA和地塞米松。试剂盒可以包括日期邮戳、防撬包装、和射频鉴定(RFID)标签或其它库存控制特征。
实施例 提供下列实施例进一步说明本发明。本发明的另外的方面只要不背离本发明的范围对于本领域技术人员是显而易见的。
实施例1TrkB激动剂抗体的产生和筛选 免疫以产生单克隆抗-TrkB激动剂抗体 用8μg的人TrkB细胞外结构域作为抗原按照常规方案注射5次Balb/C小鼠。在293细胞中使用载体pTriEx-2Hygro(Novagen，Madison W1)表达His-标记的人TrkB细胞外结构域(残基31-430)。根据产品说明书(Qiagen，Valencia，CA)使用Ni-NTA树脂纯化TrkB细胞外结构域。对于先前的4次注射，通过混合人TrkB与RIBI佐剂系统和铝来制备抗原。在11天过程中约每3天，经由颈背、足垫和IP注射获得总共8μg的抗原。在第13天，将小鼠安乐死和移出脾脏。将淋巴细胞与8653细胞融合以制备杂交瘤克隆。使克隆生长，然后用人和大鼠TrkB ELISA通过ELISA筛选选择抗-TrkB阳性细胞。
ELISA筛选抗-TrkB抗体 根据结合人和大鼠TrkB的能力对来自生长的杂交瘤克隆的上清液进行筛选。用96-孔板进行测定，所述平板使用100μl的0.5μg/ml大鼠或人TrkB-Fc融合蛋白包被过夜。在各个步骤之间使用含有0.05％吐温-20的PBS从孔洗去多余的试剂。用含有0.5％BSA的磷酸缓冲盐水(PBS)封闭平板。将上清液加入平板，并在室温孵育2小时。另入缀合了马辣根过氧化物酶(HRP)的山羊-抗小鼠Fc以结合与TrkB结合的小鼠抗体。然后加入四甲基联苯胺作为HRP的底物检测在上清液中存在的小鼠抗体的量。停止反应，并通过读取在450nm的吸光度定量抗体的相对量。在ELISA测定中显示五十个抗体阳性。在这些抗体中，进一步检测五个抗体，并显示具有激动剂活性。见下表2。
KIRA测定 使用这一测定在ELISA中针对人TrkB诱导受体酪氨酸激酶激活的能力筛选呈阳性的抗体。Sadick，等人(1997)Experimental CellResearch 234354-61。使用用gD标记的人TrkB转染的稳定细胞系，检测从杂交瘤克隆纯化的鼠抗体的活化细胞表面受体的能力，所述活化与使用天然配体BDNF和NT-4/5时所见活化相似。天然配体诱导TrkB受体的激酶结构域的自体磷酸化。将细胞暴露于多种浓度的抗体之后，对其裂解和执行ELISA以检测TrkB受体的磷酸化作用。测定各个推定的TrkB激动剂的EC50(在以下表2和图10显示)和与天然配体NT-4/5的EC50进行比较。
E15结状神经元存活测定 获自E15胚胎的结状神经节神经元是由BDNF支持，从而在饱和浓度的神经元营养因子下培养48小时的存活率接近100％。在缺少BDNF时，在48小时后少于5％的神经元存活。因此，E15结节性神经元的存活率是评估抗-TrkB抗体的激动剂活性的敏感测定，即，激动剂抗体会促进E15结节性神经元的存活。
将按时交配的怀孕的Swiss Webster雌性小鼠通过CO2吸入处以安乐死。移出子宫角，并提取在胚胎期E15的胚胎。分离结节性神经节，接着用胰蛋白酶消化、机械分离，并在确定的无血清培养液中在用聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的96孔平板中以每孔200-300个细胞的密度平板接种。参考人BDNF，以剂量应答的方式一式三份地评估抗TrkB抗体的激动剂活性。对培养48小时的细胞在Biomek FX液体处理工作站(Beckman Coulter)进行自动化免疫细胞化学操作。该操作包括固定(4％甲醛，5％蔗糖，PBS)、透化(0.3％Triton X-100在PBS中)、非特异性结合位点的封闭(5％普通山羊血清，0.1％BSA，PBS)并用初级和二级抗体依次孵育以检测神经元。针对蛋白质基因产物9.5(PGP9.5，Chemicon)的兔多克隆抗体，其为确立的神经元表型标记，被用作初级抗体。Alexa Fluor 488山羊抗-兔(MolecularProbes)被用作二级试剂连同核染料Hoechst 33342(MolecularProbes)来标记在培养液中存在的全部细胞的细胞核。在Discovery-1/Genll图像仪(Universal Imaging Corporation)执行图像获取和图像分析。在Alexa Fluor 488和Hoechst 33342的两个波长自动获取图像，使用核着色作为参考点，因为其存在于所有孔中，用于基于图像的图像仪的自动聚焦体系。选择每个孔的合适目标和数个成像位点覆盖各个孔的整个表面。基于用抗-PGP9.5抗体的特异性染色，建立自动图像分析来计算在培养48小时后各个孔中存在的神经元的数目。图像的精确阈值和形态学的应用和基于荧光强度的选择性滤波器得到每孔精确的神经元数值。对于各个推定的TrkB激动剂抗体测定EC50(在以下表1和图8中显示)，并与天然配体的EC50进行比较。
下列表格显示定义的五个抗-TrkB抗体和其对小鼠神经元存活的活性和对人TrkB的磷酸化活性 表1五个抗-TrkB抗体对神经元存活和磷酸化的影响 将抗-TrkB激动剂抗体对小鼠颅内注射雄性C57B6退役种鼠(8-12个月龄)获自Charles River实验室(Hollister facility)并使其适应控制了温度/湿度的环境，12个小时的日/夜循环，在注射前自由进食和水至少5天。用异氟烷麻醉各个小鼠，以修剪颅上方的毛发切片。将小鼠固定在立体定位的外科装置(Kopf model 900)，麻醉并用设置于培养基的电热垫保温。将聚烯吡酮磺擦于头盖骨的切刮部分来灭菌该区域。在颅上制备约1cm长的小的中线经度切割，恰好在耳后开始向着眼睛。揭下头盖骨，并用棉签清洁头盖骨表面约1cm直径的圆形空间以除去任何结缔组织。用棉签沾30％过氧化氢来清洁表面，以暴露前囟点。使用钻头作为探针测量头盖骨深度，水平和垂直调节颅骨以确定其在钻孔前是水平的。深度的偏差(在前囟点调零)，从0.5mm近中相对0.5mm侧向，以及0.5mm向前相对0.5mm向后，被最小化在±0.05mm的差异范围内。根据小鼠脑图(Franklin，K.B.J.& Paxinos，G.，The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.Academic Press，San Diego，1997)，对单个的、侧向的、下丘脑内注射的坐标如下从前囟点向后1.30mm；从正中线-0.5mm；深度，从头盖骨(在前囟点)表面5.70mm。通过头盖骨钻小孔，避免接触脑。将钻用连接于汉密尔顿氏注射器(84851型)的斜尖的26号注射针代替，并返回至相同的坐标。在2分钟过程中以量递增的方式将2μl的化合物注射进外侧下丘脑。注射后将针头保留在这一位置30秒，然后抬起1mm。另一30秒之后，再抬起该针头1mm。30秒之后，完全移去该针头。然后闭合该切口，并用2-9mm伤口夹(Autoclip，Braintree Scientific，Inc.)保持在一起。在第0天执行该注射。每天监测体重和食物摄取直至第15天。
如在表1(以上)所示，以特定剂量的抗体38B8和36D1的颅内注射显著降低小鼠的体重和食物摄取。以特定剂量给出的对照IgG抗体和23B8，不显著影响食物摄取或体重。产生抗体38B8的鼠杂交瘤系在2007年11月21号被保藏在美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，并被指定ATCC保藏号PTA-8766。
实施例2TrkB激动剂的鉴定 可以使用本领域承认的方法(包括下列一个或多个方法)鉴定TrkB激动剂(例如抗体)。例如，可以使用在美国专利5,766,863和5,891,650中描述的激酶受体激活(KIRA)测定。这一ELISA-类型测定适合定性或定量的测量激酶活性，通过测量受体蛋白酪氨酸激酶(rPTK，例如Trk受体)的自身磷酸化，以及适合鉴定和表征可能的激动剂或选择的rPTK的拮抗剂。测定的第一阶段涉及激酶受体(在情况下是TrkB受体)的激酶结构域的磷酸化，其中该受体存在于真核细胞的细胞膜中。该受体可以是内源性受体或编码所述受体的核酸或受体构建体，可以被转化进入细胞。通常，用这类细胞基本均一群(通常是哺乳动物细胞系)包被第一固相(例如，第一测定平板的孔)，从而细胞附着于固相。通常，该细胞是粘附细胞，并由此天然粘着于第一固相。如果使用“受体构建体”，其通常包含激酶受体和flag多肽的融合。该flag多肽在ELISA部分的测定中被捕获剂(通常是捕获抗体)识别。然后将分析物(例如候选的激动剂)加入具有粘着细胞的孔，从而酪氨酸激酶受体(例如，TrkB受体)被暴露于(或接触)所述分析物。这一测定使能够鉴定目标酪氨基激酶受体(例如，TrkB)的激动剂配体。暴露于分析物之后，使用裂解缓冲液(其中具有增溶的去污剂)溶解附着细胞，并温和振荡，由此释放细胞裂解物，可将其直接用于测定的ELISA部分，而无需浓缩或澄清细胞裂解物。
由此制备的细胞裂解物即可接着用于测定的ELISA阶段。在ELISA阶段的第一步骤，用捕获剂(通常是捕获抗体)包被第二固相(通常是ELISA微孔板的孔)，所述捕获抗体特异性结合于酪氨酸激酶受体，或在是受体构建体的情况下，结合于flag多肽。进行第二固相的包被，从而该捕获剂附着于第二固相。该捕获剂通常是单克隆抗体，但是，如在本实施例中所描述，也可以使用多克隆抗体或其它制剂。然后将获得的细胞裂解物暴露于或接触附着的捕获剂，从而该受体或受体构建体附着于(或被捕获在)第二固相。然后进行清洗步骤，以除去未结合的细胞裂解物，留下捕获受体或受体构建体。然后，将附着的或捕获的受体或受体构建体暴露于或接触抗-磷酸酪氨酸抗体，其鉴定在酪氨酸激酶受体中的磷酸化的酪氨酸残基。在优选的实施方案中，将抗-磷酸酪氨酸抗体缀合(直接或间接的)于催化非放射显色剂的颜色改变的酶。因此，可以通过接下来的试剂颜色改变测量受体的磷酸化。该酶可以被直接结合于抗-磷酸酪氨酸抗体，或缀合分子(例如，生物素)可以缀合于抗-磷酸酪氨酸抗体，接着该酶可以经由缀合分子结合于抗-磷酸酪氨酸抗体。最后，例如，通过在显色剂中的颜色改变测量抗-磷酸酪氨酸抗体与捕获受体或受体构建体的结合。
在最初的鉴定之后，进一步通过已知的测定靶标生物活性的生物测定证实和提炼候选物(例如，抗-TrkB单克隆抗体)的激动剂活性。例如，可以在PC12神经突增生测定中使用用全长TrkB转染的PC12细胞测定候选物激动TrkB的能力(Jian等人，Cell Signal.8365-70，1996)。这一测定通过大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)对合适配体刺激的应答测量神经突进程的增生。这些细胞表达内源性TrkA，并因此应答NGF。然而，它们不表达内源性TrkB，并因此用TrkB表达构建体转染以引起对TrkB激动剂的应答。在将转染的细胞与候选物孵育之后，测量神经突增生，并计数例如，具有超过细胞直径2倍的神经突的细胞。在经转染的PC12细胞中刺激神经突增生的候选物(例如，抗-TrkB抗体)证明TrkB激动剂活性。
也可以在胚胎发育的特异性阶段通过使用多个特异性神经元测定TrkB的激活。合适选择的神经元的存活可以依赖于TrkB激活，并因此随着下列这些神经元在体外的存活测定TrkB的激活是可能的。如果候选物激活TrkB，向合适的神经元的初级培养物加入候选物将导致这些神经元的至少数天期间的存活。这使能够确定候选物(例如，抗-TrkB抗体)激活TrkB的能力。在这一类型测定的一个例子中，从E15小鼠胚胎分裂、解离结状神经节，并将产生的神经元以低密度平板接种在组织培养皿中。然后将候选物抗体加入培养液，并将平板孵育24-48小时。这一时间之后，通过多种方法中的任一方法评估神经元的存活。与接受对照抗体的样品相比，接受激动剂的样品通常呈现增加的存活率，且这使可确定激动剂的存在。见，例如，Buchman等人(1993)Development 118(3)989-1001。
可以在表达TrkB的多种细胞类型通过其激活下游信号转导的能力鉴定TrkB激动剂，所述细胞是天然的或在转染编码TrkB的DNA之后表达TrkB。这一TrkB可以是人或其它哺乳动物(例如啮齿类或灵长类)的TrkB。可以通过改变表达TrkB的细胞的多个生物化学或生理的参数，例如蛋白质表达水平或蛋白质的蛋白磷酸化水平，或改变细胞的代谢或生长状态(包括本文所述的神经元存活和/或神经突增生)来检测下游信号级联。检测相关生物化学或生理参数的方法是本领域公知的。
实施例3测定抗体结合亲和力 可以通过测量抗体单功能Fab片段的结合亲和力进行确定抗体对TrkB的结合亲和力。为了获得单功能的Fab片段，可以用木瓜蛋白酶切割抗体(例如，IgG)或重组表达。抗体的抗-TrkB Fab片段的亲和力可以通过表面等离激元测定(BIAcore3000表面等离激元(SPR)系统，BIAcore，INC，Piscaway NJ)。根据供应商的说明书，可以使用N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活CM5芯片。人TrkB-Fc融合蛋白(″hTrkB″)(或任何其它的TrkB，例如大鼠TrkB)可以被稀释在10mM乙酸钠pH 5.0，并以0.0005mg/ml的浓度注射于激活的芯片。在个体芯片通道使用变速流时间，可以获得两个范围的抗原密度用于详细动力学研究的200-400应答单位(RU)和用于筛选测定的500-1000RU。用乙醇胺封闭所述芯片。再生研究已经显示，Pierce洗脱缓冲液(产品号21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和4M NaCI(2∶1)的混合物可有效除去结合的Fab，的混合物时保留在芯片上的hTrkB的活性。使用HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P29)作为BIAcore测定的电泳缓冲液。将纯化的Fab样品的系列稀释液(0.1-10x估计的K0)以100μl/min注射1分钟，并解离至2小时。使用已知浓度(通过氨基酸分析测定)的Fab作为标准物通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳测定Fab蛋白质的浓度。使用BIAevaluation程序，通过将数据拟合至1∶1的Langmuir结合模式，同时获得动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)(通常在25℃测量)(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994)。Methods Enzymology 699-110)。以Koff/kon计算平衡解离常数(KD)值。
实施例4配体/受体相互作用的动力学分析，通过Biacore测量 一般方法 使用装备CM5感应芯片的Biacore 3000仪器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)在25℃执行相互作用分析。HBS-EP电泳缓冲液(用于固定受体)是与胺-偶联试剂(NHS、EDC、乙酸盐pH 4.5和乙醇胺)一起购自Biacore。Fc-融合的重组人受体(TrkA、TrkB、TrkC和P75)和天然配体(NGF、BDNF、NT4/5和NT3)是购自R&D sytems或自己制备。
受体的固定 在低水平(通常500RU或4fmol/mm2)将受体(每个芯片3个)固定在CM5感应芯片，留下一个未修饰的流动细胞(每个芯片)作为参考表面。在HBS-EP电泳缓冲液中以5μl/min使用标准胺偶联的操作方案并包括三个步骤。简而言之，这包括三个步骤。首先，使用在50mM NHS中200mM EDC的新鲜制备混合物注射7分钟来激活流动细胞；这一步骤将芯片的羧酸基团转化为活性酯。接下来，在pH 4.5在10mM乙酸钠缓冲液中将受体稀释至～10μg/mL，并偶联于芯片直到达到期望的水平。最后，用1M乙醇胺盐酸钠(pH 8.5)注射7分钟封闭多余的活性酯。
配体分析 在电泳缓冲液(10mM Hepes(pH 7.4)，150mM(NH4)2SO4，1.5mM CaCl2，1mM EGTA和0.005％(v/v)吐温-20)中将配体(NGF、BDNF、NT4/5和NT3)以5倍的梯度稀释至浓度跨度0.08-250nM。将抗体200.38B8(38B8)的Fab片段以3倍梯度稀释至从0.7-480nM。将样品以100μl/min注射30秒使解离时间达10分钟。在各个结合周期之后，用温和的酸性混合物(10mM甘氨酸-HCl(pH 4.0)、500mM NaCl和20mM EDTA)再生受体表面。重复注射证实该测定是可重现的。通过全面拟合结合数据为物质运输模型来测定动力学速率常数(kon和koff)，并由其速率计算结合亲和力，KD＝koff/kon。
结果 在操作盘中的多数配体/受体相互作用表征为速率上的快速、限制性扩散，其在Biacore(kon～1x107 1/Ms)的分辨率之上。显著的例外是ProNGF，其通常表示为慢的速率。解离速率(off rate)是更加可变的，例如，ProNGF或成熟NGF与TrkA的相互作用具有非常慢的解离速率(T1/2＞1小时)，而NT3/TrkA相互作用在数秒内衰变(T1/2＝9秒)。38B8-Fab/TrkB相互作用具有双相解离速率，所以仅衰变初期被拟合至模型。将受体以低水平包被在芯片上，从而将其空间分开足够远(平均而言)这样二聚化配体不能够在邻近受体分子之间分子间顺式-桥连。由于空间位阻，在融合了Fc的受体分子的两臂之间二聚体配体不可能分子内的桥连。通过促进其中迫使配体经由其两个可用结合位点中的仅一个而结合的条件，我们将亲和力问题最小化并合理地将我们的数据拟合为简单的1∶1结合模型。
表2总体动力学分析(将结合根据亲合力由高到低进行排序) 注 1.对于在两个独立试验中分析的那些相互作用给出″平均值±StDev″(即，标准偏差) 2.以斜体显示的结合速率表明在Biacore(＞1e7 1/Ms)的分辨率的非常迅速的解离速率，因为它们接近扩散极限。我们使用此作为甄别值(cut-off value)，其意指全部KD仅可被引用作为限制。
3.NB＝对于某些配体/受体配对没有检测到结合(与来自文献的公知的特异性一致)。
实施例5直接施用TrkB激动剂降低动物中的发病率 在为支持本发明而执行的试验中，直接施用TrkB激动剂显示降低患有CNS特异性自身免疫疾病的动物中的发病率和CNS组织损害(图1A和1B)。如在美国专利申请公开2005/0209148中所述产生天然存在的TrkB激动剂NT4的重组形式并在MOG诱导(第0天)之后施用于C57BL/6雌性小鼠。
在MOG诱导后的前10天向动物每日施用NT4(10mg/kg，n＝8)，(图1A)。向对照动物施用媒质(n＝8)。
动物的发病率被计分如下1＝无力尾；2＝中度后肢虚弱；3＝适度的严重后肢虚弱(动物仍然能够艰难行走)；4＝严重后肢虚弱(动物可以移动其后肢但是不能行走)；5＝完全的后肢瘫痪；和6＝死亡。与对照动物相比，用NT4治疗的动物显示显著减少发病率。这一结果证明TrkB激动剂可有效减缓慢性EAE的进展。
图1B显示在MOG诱导后的不同时期用NT4每日治疗的动物的发病率。用对照IgG(n＝9)、从3天至9天用NT4(n＝8)或从9天至15天用NT4(n＝8)治疗动物。两个施用方案对于减少动物发病率均有效。当早期施用时(即，早期的“脉冲治疗”)由NT4提供的保护是比当晚期施用时至少同样好(即便为了治疗有效布不是更好)。这些结果表明，用TrkB激动剂治疗不必持续至症状发作的时间。TrkB激活可以是在EAE诱导中相对上游的靶向步骤。
实施例6鉴定高度选择性的TrkB激动剂抗体 在实施例1-4中描述了导致鉴定TrkB激动剂抗体的试验和观察。进一步表征抗体之一，抗体38B8显示，尽管标称结合于TrkA、TrkC或p75，但该抗体对TrkB是高度选择性的(图2)。将38B8Fab片段对TrkA、TrkB、TrkC和p75的相对亲和力与天然存在的激动剂NGF、BDNF和NT4的亲和力比较。在图2中的各坐标图是显示相对结合比时间的图象。抗体38B8是对TrkB特异性的，并显示对测定的其它受体酪氨酸激酶没有显著的结合。与显示一些交叉反应性的天然存在的激动剂BDNF和NT4相比，38B8对TrkB是甚至有更高的选择性的。如预期的，NGF显示出几乎不结合TrkB，并优选结合TrkA和p75神经营养蛋白受体。测定38B8的结合亲和力是46±10nM。实施例4中提供了这些配体-受体相互作用的动力学分析(包括Kon、Koff和Kd数据)，特别是在表2中。
BDNF和NT4显示比38B8抗体激动剂对TrkB具有更高的亲和力。然而，用该天然存在的配体的二聚体形式和38B8Fab的单体形式执行结合试验。此外，抗体通常比生长因子具有更长的循环半衰期，使它们甚至当对于其靶标受体具有较低结合亲和力时是有效的。使用TrkB激动剂抗体用于进一步研究。
实施例7TrkB激动剂抗体在自身免疫疾病中有效降低发病率 动物试验显示与对照免疫球蛋白相比，TrkB激动剂抗体提供显著的免于EAE发病的保护(图3)。在MOG诱导之后，在第9和16天施用5mg/kg激动剂抗体(38B8，n＝9)或对照IgG(n＝9)治疗小鼠。在MOG诱导后晚至16天和在临床病征发作之后施用TrkB激动剂抗体也是有效的(图4)。较迟的施用，例如，诱导后第18天，减少发病率的效果较差(图5A)。基于双因素方差分析(two-way ANOVAanalysis)，在更迟的治疗之后临床病征的区别不显著。
在其它动物中，在MOG诱导之后第22天施用格拉默乙酸酯(GA，COPAXONE，TYSABRI)有效降低发病率(图5B)。这些结果提示TrkB激动剂的作用机制与GA及其它的当前MS药物的机制不同。
将TrkB激动剂抗体与治疗MS的另一当前药物地塞米松比较。图6A描述了显示动物中发病率的图，所述动物是被施用TrkB激动剂抗体38B8(5mg/kg每周在第9和16天)或在第3-12天每日施用地塞米松(4mg/kg)或乙醇媒质(对照)之后。该结果证明TrkB激动剂的有益效果与免疫抑制剂地塞米松相似。与对照动物相比，经TrkB激动剂治疗的动物倾向于丧失体重(图6B)。
TrkB激动剂抗体的有益效果是剂量依赖性的。图7A和7B显示在施用1(n＝8)或5mg/kg(n＝9)38B8或5(n＝10)和10mg/kg(n＝9)38B8之后，动物发病率的区别。该结果证明5mg/kg激动剂抗体比1mg/kg提供更多免于发病的保护(即，较少的发病率)，而与5mg/kg相比，10mg/kg进一步减少发病率。在更高剂量，保护的增加较不显著，表明施用额外的TrkB激动剂具有边缘的治疗价值。
实施例8TrkB激动剂抗体和NT保护培养的神经元细胞 使用体外的神经元细胞存活测定已经显示，NT促进神经元存活(Davies，A.，等人(1993)Neuron 11565-74)。使用相似的测定证明TrkB激动剂抗体以与天然存在的TrkB激动剂一致的方式影响神经元细胞(见实施例1)。实际上在对照培养液(即，没有神经营养因子)中的全部神经元在48小时之内死亡。然而，在BDNF、NT3、NT4或NGF的存在下培养的神经元的60-80％存活48个小时(Id.)。
在支持本发明而执行的试验中，按照前述，将量增加的TrkB激动剂抗体38B8、23B8、36D1、37D12和19H8(见，例如，实施例1，包括表1)加入神经元培养液(图8)。有一些变化，加入量增加的TrkB激动剂抗体导致增加的神经元存活(对于38B8在10-100pM范围内高达75％，而对于19H8在0.1-10pM范围高达100％)。在神经元存活测定中抗体38B8的EC50值是0.2pM。在神经元存活测定中38B8、23B8、36D1和37D12的EC50值，以及在人KIRA测定中这些抗体的EC50值和它们对动物体重的影响(对TrkB激动剂的识别的应答)在实施例1被讨论，并在表1中被总结。注意具有更高的11pM的EC50值的抗体23B8对动物体重不产生影响，表明对于TrkB激动剂生物活性需要低于11pM的EC50值。具有5pM的EC50值的抗体36D1影响动物体重。这些数据与对NT的报道结果一致，证明TrkB激动剂抗体以与天然存在的TrkB激动剂一致的方式影响神经元细胞。
实施例9TrkB激动剂不主要通过免疫抑制起作用 治疗MS的当前药物(包括GA和地塞米松)是免疫调节剂，其显示免疫抑制和与免疫应答有关的其它影响。为了确定是否TrkB激动剂的治疗效果也是在免疫抑制水平，用TrkB激动剂抗体(38B8)或仅媒质(对照)治疗动物，并测量不同的同种型(即，IgG1、lgG2a、lgG2b、lgG3和IgM)的循环MOG(髓磷脂)特异性抗体的水平(图9)。尽管在TrkB激动剂治疗之后观察到MOG-特异性抗体水平的一些变化，似乎不足以解释动物发病率的显著减少。尽管不归于本发明的具体机制，该结果提示TrkB激动剂不是通过抑制抗-MOG抗体的产生而起作用的，因此似乎不如同常规免疫抑制剂起作用。
为了确定是否TrkB激动剂抑制T-细胞和B-细胞被髓磷脂刺激的能力，使用脾细胞增殖测定测量MOG在TrkB激动剂存在下刺激分离的脾细胞的能力。为了比较，在免疫抑制剂地塞米松存在下用MOG刺激脾细胞。将来自MOG诱导的未治疗(对照)动物(n＝9)或MOG诱导的经TrkB激动剂抗体(38B8)治疗的动物(n＝8)的脾细胞在仅MOG(0)、MOG与TrkB激动剂抗体(38B8；50μl/mg)组合或在两个不同浓度之一的地塞米松(10-8M和10-5M)的存在下进行体外培养。参考图10，在Y轴表示脾细胞刺激相对未用MOG体外刺激的脾细胞的不同量。
TrkB激动剂抗体的存在对于脾细胞刺激没有明显效果，使用较低浓度的免疫抑制剂地塞米松的情况也是如此。地塞米松在10-5M的更高浓度干扰MOG刺激。
总体而言，从经TrkB激动剂治疗的动物获得的脾细胞以与经对照治疗的动物一致的方式应答MOG刺激，表明用TrkB激动剂治疗的动物保留产生正常抗-MOG T-细胞和/或B-细胞应答的能力。此外，从经TrkB激动剂治疗的动物和对照动物获得的脾细胞对于在培养基中TrkB激动剂的存在应答相似。这些观察进一步提示免疫抑制剂地塞米松和TrkB激动剂的作用机制是不同的，且TrkB激动剂的作用机制在白细胞增殖水平不是主要的。
实施例10TrkB激动剂阻断炎症细胞侵袭CNS，并减少脱髓鞘 执行组织学分析以更好理解在动物中由TrkB激动剂介导的保护机制。从对照和经TrkB激动剂抗体(38B8)治疗的动物制备脊椎切片，和然后用勒克司坚牢蓝染色髓磷脂，并用甲酚紫染色细胞体(图11)。在对照动物中，该染色显示白细胞侵袭区和相对表达髓磷脂的神经元细胞的背景的细胞破坏。在从用TrkB激动剂治疗的动物制备的切片观察到减少的白细胞侵袭。一些经TrkB激动剂治疗的动物显示实际上没有CNS白细胞侵袭的迹象。
使用对两个白细胞标识物特异性的抗体进行侵袭细胞的鉴定，所述白细胞标识物是存在于T-细胞上的CD3和存在于巨噬细胞上的CD68。图12显示用CD3抗体染色的结果。多个亮染色的点区域是明显的，特别是在用甲酚紫深染色的相同区域。从经TrkB激动剂治疗的小鼠获得的脊椎切片显示显著弱着色，提示T-细胞侵袭在经治疗的动物中大量减少。也用对与单核细胞相关的CD68标识物特异性的抗体染色脊椎切片(图13)。从对照小鼠制备的切片比来自经TrkB激动剂治疗的小鼠的切片染色更强烈，特别是在用甲酚紫和CD3特异性抗体强染色的相同区域。这类观察表明，与对照动物相比，来自经TrkB激动剂治疗的动物的脊椎组织显示T-细胞和单核细胞侵袭实质性减少。
用勒克司坚牢蓝染色脊椎切片测量脱髓鞘。对应于具有重度淋巴细胞侵袭的区域，对照小鼠的脑显示严重脱髓鞘的区域(即，缺少着色，如在图14中由黑色箭头指示的)，其在用TrkB激动剂治疗的小鼠中不明显。在来自经TrkB激动剂治疗动物的切片中未观察到严重的脱髓鞘和/或神经元死亡的区域。综上，CNS组织切片的组织化学染色结果证明TrkB激动剂治疗降低CNS的淋巴细胞和单核细胞侵袭。
天然存在的和人工的TrkB激动剂在减缓EAE进展中都是有效的。天然存在的激动剂NT4和激动剂抗体对于减慢疾病进程都是有效的。激动剂抗体显示出对TrkB具有最大选择性，并被用于进一步研究TrkB激动剂影响EAE进展的机制。当在EAE症状发作(通常对于这些具体动物是第12或13天)之前和几天之后施用TrkB激动剂是有效的。在MOG诱导之后施用至16天(或在症状发作之后约4天)对于减少发病率是有效的。TrkB激动剂的有益效果是剂量依赖性的，减少的发病率与TrkB激动剂的剂量增加相关联。组织化学试验显示TrkB激动剂降低T-细胞和单核细胞对CNS组织的侵入。对髓磷脂的染色显示在经TrkB激动剂治疗的动物中对神经细胞损害降低。
与在测定中测试的其它药物不同，TrkB激动剂不是主要通过免疫抑制起作用。这是由观察到的TrkB激动剂不影响M0G特异性自身免疫抗体的产生而证明的。此外，从用TrkB激动剂治疗的MOG诱导的动物中分离的脾细胞保留了在体外由MOG刺激的能力。因此，TrkB激动剂以与其它化合物(例如GA和地塞米松)不同的方式起作用。
应该理解的是，这里所述的实施例和实施方案是仅用于说明目的和暗示本领域技术人员应该考虑到对其的多种修饰或改变和这些修饰或改变被包括在本申请的精神和范围内。本文引用的全部公开案、专利和专利申请是以其整体通过参考被并入，其引用程度就如同将每一个别公开案、专利或专利申请案特定且个别地以全其整体通过参考方式被并入。
权利要求
1.TrkB激动剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗影响哺乳动物的中枢神经系统的自身免疫性疾病。
2.权利要求1的用途，其中所述自身免疫性疾病是试验性自身免疫性脑脊髓炎。
3.权利要求1的用途，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化。
4.权利要求1的用途，其中所述TrkB激动剂是天然存在的TrkB激动剂。
5.权利要求4的用途，其中所述天然存在的TrkB激动剂是NT4。
6.权利要求4的用途，其中所述天然存在的TrkB激动剂是BDNF。
7.权利要求1的用途，其中所述TrkB激动剂是抗体。
8.权利要求7的用途，其中所述TrkB激动剂是抗体片段或其衍生物。
9.由ATCC保藏号PTA-8766进行保藏的杂交瘤系产生的分离的单克隆TrkB激动剂抗体。
10.杂交瘤系，其以ATCC保藏号PTA-8766进行保藏。
全文摘要
本发明提供酪氨酸受体激酶(TrkB)激动剂减少在自身免疫疾病，例如多发性硬化中的中枢神经系统的白细胞侵袭。TrkB激动剂包括天然存在的激动剂，例如NT4和BDNF，以及激动剂例如激动剂抗体。
文档编号C07K16/18GK101605556SQ200780047255
公开日2009年12月16日 申请日期2007年12月5日 优先权日2006年12月20日
发明者林家扬, 华 龙, D·曹 申请人:瑞纳神经科学公司