快速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种快速测定蛋白混合物中的各组分含量的方法，特别是涉及一种快 速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法。
【背景技术】
[0002] 单克隆抗体药物在治疗肿瘤和自体免疫疾病等领域都具有显著的优势，但对于靶 点较为复杂的疾病，如感染性疾病或涉及体内多个靶点的疾病则有一定的局限性。
[0003] 复合抗体药物（antibodymixtureorantibodycocktail)是一类由两种或多种 单克隆抗体组成的药物，它由一系列确定的、充分表征的单克隆复合抗体药物组成，这些单 克隆抗体在序列、靶点和结合活性上都具有充分的多样性，能够模拟人体免疫系统产生的 一系列抗体，因而在治疗复杂靶点疾病上具有明显的优势。由于其组成上的复杂性，复合抗 体药物的生产工艺开发和质量控制均有较大的挑战。
[0004] 在复合抗体药物的质量控制中，各单克隆抗体组分的含量是保证产品的药效、 安全性和批间重复性的重要指标。由于各单克隆抗体通常具有较高比例的同源序列，其 分子量、分子结构和理化性质非常接近，常用的多数分析方法如体积排阻色谱、毛细管凝 胶电泳等方法均无法区分这些不同的单克隆抗体组分，因而不适用于复合抗体药物的组 成和含量分析这一目的。等电点是单克隆抗体的固有性质之一，不同的单克隆抗体由 于氨基酸组成、序列和空间结构不同，等电点通常具有明显的差异，因而可以利用不同单 克隆抗体的等电点差异对其进行分离和定量。Symphogen公司采用阳离子交换色谱法 (F.Wiberg,S.Rasmussenetal.Productionoftarget-specificrecombinanthuman polyclonalantibodiesinmammaliancells.BiotechnologyandBioengineering. Vol. 94,No. 2, 2006 ；T.Frandsen,H.Naestedetal.Consistentmanufacturingand qualitycontrolofahighlycomplexrecombinantpolyclonalantibodyproduct forhumantherapeuticuse.BiotechnologyandBioengineering.Vol. 108,No. 9, 2011) 和液质联用法（P.Persson，A.Engstr6metal.Techniquesfortheidentificationand determinationofcompositionalvariabilityinrecombinantpolyclonalantibody products.AnalyticalChemistry，Vol. 82,No. 17, 2010)对几种复合抗体药物中的各组分 含量进行了测定。阳离子交换色谱法利用不同等电点的抗体在特定pH值下所带正电荷数 的不同对其进行分离和定量，能够反映不同样品中各组分含量的一致性，但分析时间较长， 且样品中组分较多时可能出现两种组分无法分离的情况。液质联用法通过检测各单克隆抗 体的轻链含量来反映各单克隆抗体组分的含量，其专属性较强，但样品需经还原、轻重链分 离等处理后才能上样分析，步骤较为繁琐，且质谱分析的成本较高。因此，开发新的复合抗 体药物组成分析方法是非常必要的。
[0005] 毛细管等电聚焦是近年来基于平板等电聚焦和毛细管电泳技术发展而来的分析 方法，它利用毛细管中灌注的一系列不同等电点的两性电解质混合物在电场下形成的PH 梯度，根据蛋白质或其他待分析物等电点的差异对其进行分离，其分离精度可达到0. 1个PH单位，并克服了平板等电聚焦操作复杂、无法实现自动化、无法准确测定电荷异质体含 量等缺点，因而被广泛应用于单克隆抗体产品的等电点测定和电荷异质体含量分析。与离 子交换色谱相比，毛细管等电聚焦具有分析时间短、样品消耗量小、通用性强等优势，其单 个样品分析时间通常是离子交换色谱的1/4,单次测试样品消耗量通常是离子交换色谱的 1/10左右，且对一些电荷异质性较为复杂的样品如融合蛋白样品具有更好的分离效果。
[0006] 尽管毛细管等电聚焦已经被广泛应用于单克隆抗体的质量分析，但其应用于复合 抗体药物的组成和含量分析还未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种快速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛 细管等电聚焦方法。该方法具有通用性强、分析周期短、数据处理简单等优点，而且适用于 蛋白混合物(包括：复合抗体药物）的生产工艺开发和质量控制。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的测定(快速测定）蛋白混合物中的各组分含量的毛 细管等电聚焦方法，包括步骤：
[0009] 1)将两性载体、添加剂、等电点标记物与待分析的蛋白混合物样品进行混合，形成 混合液；
[0010] 其中，添加剂包括：甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、尿素、甘油、蔗糖中的一种或 多种；
[0011] 2)将步骤1)的混合液上样于毛细管柱，在10~40°C、0. 1~lkV/cm下聚焦2~ 15min，并通过毛细管等电聚焦仪或毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；
[0012] 3)将步骤2)的等电聚焦谱图与待分析的蛋白混合物样品中的单蛋白组分(各组 分）等电聚焦谱图进行比对，确定步骤2)的等电聚焦谱图中不同等电点范围对应的单蛋白 组分；
[0013] 4)根据步骤3)的比对结果和步骤2)的等电聚焦谱图信息，确定待分析的蛋白混 合物样品中的各组分含量。
[0014] 所述步骤 1)中，两性载体包括：Pharmalyte2. 5-5、Pharmalyte3_10、 Pharmalyte4_6. 5、Pharmalyte4. 2-4.9、Pharmalyte4. 5 - 5. 4、Pharmalyte5_6、 Pharmalyte5_8、Pharmalyte6. 7-7. 7、Pharmalyte8_10. 5、Servalyt2_4、Servalyt2_9、 Servalyt2_ll、Servalyt3_4、Servalyt3_5、Servalyt3_6、Servalyt3_7、Servalyt3_10、 Servalyt4_5、Servalyt4_6、Servalyt4_7、Servalyt4_9、Servalyt5_6、Servalyt5_7、 Servalyt5_8、Servalyt5_9、Servalyt6_7、Servalyt6_8、Servalyt6_9、Servalyt7_9、 Servalyt9_ll中的一种或多种；两性载体在混合液中的体积范围为1%~10% ;
[0015] 添加剂的浓度范围或用量范围分别为：甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素在混合液 中的体积浓度为0~50%，尿素在混合液中的浓度为0~8M(即0 <浓度< 8mol/L)，甘油 在混合液中的体积浓度为0~50%，蔗糖在混合液中的浓度为0~50g/100ml;例如，甲基纤 维素或羟丙基甲基纤维素在混合液中的体积浓度a可为0 < 50%，尿素在混合液中的浓 度b可为0 <b^8M，甘油在混合液中的体积浓度c为0 <c<50%，蔗糖在混合液中的浓 度d为0 <d<50g/100ml。
[0016] 等电点标记物，包括：ProteinSimple公司提供的小分子等电点标记物、Beckman 公司提供的小分子等电点标记物或蛋白等电点标记物；
[0017] 其中，ProteinSimple公司提供的小分子等电点标记物(小分子标记物系列)包括： pI2. 85、pI3. 21、pI3. 59、pI4. 22、pI4. 65、pI5. 12、pI5. 85、pI6. 14、pI6. 61、pI7. 05、pI7. 40、 pI7.55、pI7.65、pI7.90、pI8.18、pI8.40、pI8.79、pI9. 22、pI9. 46、pI9. 50、pI9. 77、pI10. 10 或pI10.45 ;
[0018] Beckman公司提供的小分子等电点标记物(小分子标记物系列）包括：pI4. 1、 pI5. 5、pI7. 0、pI9. 5 或pI10. 0 ;
[0019] 蛋白等电点标记物包括：pI2. 80的胃蛋白酶原（pepsinogen)，pI3. 50的淀粉葡 萄糖苷酶（amylglucosidase)，pI4. 25 的葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase)，pI4. 55 的胰 蛋白酶抑制剂（trypsininhibitor)，pI5. 20 的beta-乳球蛋白A(beta-lactoglobulin A)，pI5.85 的牛碳酸酉干酶B[CarbonicanhydraseB(bovine)]，pI6.55 的人碳酸酉干酶 B[carbonicanhydraseB(human) ]，pI7. 35 的肌红蛋白（myoglobin)，pI8. 15、pI8. 45 和 pI8. 65 的扁豆凝集素（lentillectin)，pI9. 30 的胰蛋白酶原（trypsinogen)，pI9. 45 的核 糖核酸酶A(ribonucleaseA)或pI10. 25 的细胞色素c(cytochromec);
[0020] 混合液中通常包含两种等电点标记物，其中，一种等电点标记物的等电点高于所 有待分析蛋白，另一种等电点标记物的等电点低于所有待分析蛋白。单个小分子等电点标 记物在混合液中的体积范围为0. 5%~2%，单个蛋白等电点标记物在混合液中的浓度范围 为 0? 01 ~0? 5mg/mL;
[0021] 待分析的蛋白混合物样品包括：复合抗体药物或多种蛋白的混合物；其中，待分 析的蛋白混合物样品在混合液中的浓度范围为0.