专利名称：一种用于蛋白质含量差异测定的方法
技术领域：
本发明一种用于蛋白质含量差异测定的方法属于一种蛋白质相对含量的测定方法， 具体来说是一种通过核酸标记蛋白质反应、抗原抗体反应、酶连接反应、核酸扩增反应 和实时测序反应来测定不同来源的蛋白质相对含量。
背景技术：
人类基因组计划因毛细管阵列电泳测序技术的发展得以提前完成(Anal Chem 74(1): 22A,2002)。像毛细管阵列电泳一样，二维电泳技术特别是色谱-质谱联用技术的发展， 也大大加快了蛋白质组学的研究步伐(Lambert, J. P., M. Ethier， et al. Anal Chem 77(12): 3771-87,2005)。但蛋白质分子要比DNA分子复杂得多，要在分子水平上阐述表达量极 低的蛋白质在生理过程中所扮演的角色，就必须有相应的高灵敏和高专一性的检测方 法。蛋白质检测和DNA检测不同，对DNA检测来说，可以采用成熟的核酸扩增技术
(如PCR)使微量的DNA扩增(Saiki， R. K.， S. Scharf， et al. Science 230(4732): 1350-4， 1985)，理论上可以检测到单个分子的DNA，而且特异性也很好；但对蛋白质检测来说， 不能采用扩增技术使目的分子的数目增加，而是采用直接测定法，因此其检测灵敏度受 到极大限制。如果能用一种类似于PCR的扩增技术扩增蛋白质分子，那蛋白质的检测 灵敏度就会大大提高，这对分析单细胞中蛋白质的变化及检测与疾病发生发展相关的蛋 白质标志物有重大的意义，可以实现疾病的早期诊断，对重大疾病如肿瘤起到预警作用。 ULF Landegren研究组提出了一种新的蛋白质体外分析方法，称为邻位连接法
(Proximity Ligation Assay) (Fredriksson, S., M. Gullberg, et al. Nat Biotechnol 20(5): 473-7,2002)。该方法通过一种高度专一的DNA适配器与蛋白质的亲和机制，将含有不 同序列的两条DNA适配器同时结合在待测细胞因子血小板源性生长因子BB
(PDGF-BB)上，两条DNA适配器的主要部分序列相同，仅尾部单链序列不同，分别 是DNA序列的3'端和5'端，如果待测样本中含有目的蛋白PDGF-BB，适配器就会 与之结合，当两条不同的适配器与同一 PDGF-BB分子结合后，适配器尾部的两条单链 就相互靠近，易于与互补连接序列杂交，在DNA连接酶的作用下，发生连接反应，采
用实时荧光PCR法扩增和检测连接产物，使蛋白质的检测转变为对DNA的检测，实现 了痕量蛋白的分析，其检测灵敏度是酶联免疫吸附法(ELISA)的1000倍，能检测到 24000个PDGF-BB分子。但实验证明在同一蛋白质分子上同时连接两种不同的亲和探 针的几率不高，仅有l/25;更重要的是目前能够用于该方法的DNA适配器种类有限， 大大限制了该技术的应用。为此，Gullberg等改用多克隆抗体(McAb)或单克隆抗体 (PcAb)代替DNA适配器进行测定，成功分析了 1 1样品中的飞摩尔级的细胞因子 (Gullberg, Gustafsdottir et al. Proc Natl Acad Sci USA 101 (22): 8420-4 ， 2004 )。但测定背 景较大，限制了灵敏度的进一步提高。Schallmeiner等采用三条邻位探针法使检测背景 下降，可以检测到100个分子的蛋白质(Schallmeiner, E.， E. Oksanen, et al. Nat Methods 4(2): 135-7， 2007)。 Soderberg等还将该法与滚环扩增方式相结合，用于蛋白质的原位 分析，检测细胞中的蛋白质分布情况(Soderberg, O., K. J. Leuchowius, et al. Genet Eng (NY) 28: 85-93， 2007)。但该方法依赖于实时荧光PCR定量，需要昂贵的实时荧光PCR 仪，要作标准曲线，测定繁琐，更重要的是一次仅能测定一个样本，如果用于比较某种 蛋白质在三种不同的组织或三种不同的细胞中的表达量差异，就需要分别测定三次，然 后再比较分析，因此，不是比较方便有效的检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足之处，采用核酸标记蛋白质反应、抗原抗体反应、酶 连接反应、核酸扩增反应和实时测序反应来定量测定同一种蛋白质在多个不同组织或细 胞中的表达量差异，建立一种无荧光标记的高灵敏度蛋白质表达差异的检测技术，用于 比较蛋白质组学的研究。
为了方便起见，本发明将待测蛋白质称为抗原，与之结合的蛋白质称为抗体。测定 时先在抗体上结合序列不同的DNA单链，然后与抗原反应，抗原抗体发生反应后，扩 增"抗原-抗体-DNA"复合物中的DNA，使得对蛋白质的检测转变为对DNA的检测。 其主要测定步骤如下
(1) DNA单链与抗体特异性结合的方法及高纯度抗体-DNA复合探针的制备与表 征。要将蛋白质的测定转变成对DNA的测定，首先必须将DNA与抗体蛋白特异性结 合。DNA与蛋白质的结合方法有很多，其中基于生物素(biotin)与链亲和素(STV) 反应的方法比较常用。检测一种抗原至少需要两种探针，其并且两种探针的DNA的游 离端分别为3'和5'端。由于游离的DNA单链和游离的抗体会对下游造成影响，必须 纯化抗体-DNA复合物。
(2)同一抗原分子表面与不同的抗体-DNA复合探针反应。通常一个抗原有多个决 定簇， 一种抗原决定簇产生一种抗体。因此同一抗原分子表面可以与多个不同的单克隆 抗体(每一个对应于一种决定簇)结合。以同一个抗原分子结合两个不同单克隆抗体为 例阐述本发明的原理，其中每一种单克隆抗体结合有不同序列的DNA探针，除了序列 不同以外，游离的DNA末端也不同，分别为3'端和5'端，当两种抗体-DNA复合探 针同时结合到抗原表面时，DNA的末端(3'端和5'端)紧密相连，局部浓度增加， 当有互补序列和连接酶存在下易于发生连接反应。也可以采用多克隆抗体取代多个不同 的单克隆抗体，即将多克隆抗体分成几份(每一份相当于一种单克隆抗体)，分别与不 同序列的DNA探针结合。
(3)通过抗原-抗体-DNA复合物中DNA末端连接反应标记不同来源的抗原。在 比较蛋白质组学研究中，需要在一次测定中分析某一特定蛋白质在不同组织或细胞中的 相对表达量。本发明借助于连接反应，采用序列标签法将一段序列不同的DNA标记在 抗原-抗体-DNA复合物中。由于连接产物中代表来源的DNA序列的长度和Tm相同， 所以核酸扩增(如PCR)时就不会产生任何"歧视"现象，能保证等比例扩增，即代表 各来源蛋白质的DNA在核酸扩增后保持相对含量不变，不会受如PCR循环次数的影响。
(4) 降低因连接反应造成的背景信号。在连接反应中，希望只有结合到抗原表面 的抗体-DNA探针才发生DNA末端连接反应，但理论上游离的抗体-DNA探针也有可能 发生末端连接反应，所以会产生背景信号，即假阳性信号。本发明采用第三种抗体的方 法对背景信号的大小进行了控制，即将用于连接来源特异性DNA和抗体-DNA末端的 DNA单链结合到第三种抗体上，当所有三种抗体同时与待测抗原结合时，才发生连接 反应，这会极大减少因游离抗体-DNA探针末端的非特异连接反应产生的背景信号。
(5) 扩增含有序列标签的不同来源连接反应产物混合物。将不同来源的连接产物 等体积混合后，进行扩增反应，通常采用PCR反应，即采用一对引物进行扩增，由于 采用一对共同引物扩增代表不同来源的同一 DNA片段，且扩增产物的Tm值完全相同
(长度和碱基种类相同)，如同单一模板，所以不需要对PCR反应进行特殊的优化。
(6) 用焦测序法测定扩增产物中代表不同来源抗原的相对含量。扩增产物是个混 合物，每一种产物标记有不同的碱基序列，需要用测序的方法进行序列解码。目前通常 的测序反应是基于凝胶电泳的原理，但这种方法属于定性测定序列，定量性能差，并且 不能测定引物后面碱基的序列。焦测序法是通过依次逐个循环加入各dNTP进行测序反 应，不但可以直接测定引物后面的碱基序列，而且定量性能很好，能通过测量峰高确定
重复碱基的个数。当用焦测序法测定来源特异性DNA扩增产物的序列时，首先用将单 链DNA模板与测序引物退火，再逐个加入与抗原来源对应的互补dNTP，根据峰强度 就可判断不同来源的抗原表达量差异。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的
一种用于蛋白质含量差异测定的方法，包括下列步骤
a. 将多种分别结合有不同寡核苷酸序列的蛋白质作抗体同时与一种作抗原的待测 蛋白质发生抗原抗体反应；
b. 在连接酶的作用下，通过连接反应将步骤a中抗原抗体复合物中的寡核苷酸序列 连接在一起，并使连接产物序列中含有一段代表待测蛋白质来源的碱基序列；
c. 以步骤b中的连接产物为模板，采用扩增反应扩增一段含有待测蛋白质来源特异 性的碱基序列；
d. 采用实时测序技术测定步骤c中扩增产物序列中的代表待测蛋白质来源的碱基 序列；
e. 以步骤d中测得的序列作为待测蛋白质的来源，比较各序列的信号强度就得到待 测蛋白质在各来源中的相对含量。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中抗体是指以待测蛋白质为抗原制备的单克隆 或多克隆抗体蛋白质。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中抗原抗体反应是指一种抗原同时与该抗原的 两种或两种以上的抗体发生的反应。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中多种分别结合有不同寡核苷酸序列的蛋白质 是指不同序列的寡核苷酸(DNA)序列的5'端或3'端通过物理或化学的方法与蛋白质 结合，形成DNA-蛋白质复合探针。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中一段代表待测蛋白质来源的碱基序列是指标 记在抗体蛋白质分子上的寡核苷酸序列中的一段DNA序列。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中一段代表待测蛋白质来源的碱基序列是指在 连接反应过程中加入的一段DNA序列。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中扩增反应是指滚环扩增技术(RCA)，聚合 酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和依赖核酸序列的 扩增(NASBA)。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中实时测序技术是指基于生物发光反应的焦测
序技术。
所述的蛋白质含量差异测定方法，其中两种或两种以上的抗体是指其中至少一种抗 体表面结合的寡核苷酸序列的5'端为游离端，并且至少一种抗体表面结合的寡核苷酸序 列的3'端为游离端。
本发明有益效果
本发明基于邻位连接的原理，先用序列标签的方法标记不同来源的蛋白质，再扩增 含有序列标签的一段DNA，最后用实时测序技术对序列标签进行解码。本发明的优点 是可在一次分析中同时测定2个以上不同来源的蛋白质表达量差异，样品消耗量低，试 剂用量少，不需要使用荧光标记，也不需使用激光器，仅需要简单的生物发光检测装置 作为检测器，可用于高灵敏度检测疾病相关标志物，可用于分析细胞中的功能蛋白；检 测血液中的微量蛋白质标志物；研究和发现与疾病相关、与药物作用相关的蛋白质分子； 研究蛋白质分子间的相互作用；也可用于早期检测微量病毒抗原(如HCV和HIV病毒 抗原)等。
图1是蛋白质含量差异测定的方法原理图。 图2是两种不同来源白细胞介素2的焦测序测定结果。 图3是加入第三种抗体降低反应背景信号提高测定灵敏度的方法示意图。 图4是三种不同来源白细胞介素2的焦测序测定结果。
具体实施例方式
如图1所示，本发明一种蛋白质含量差异测定的方法分成五步进行
(1) 制备抗体-DNA复合探针，并进行纯化。以待测蛋白质为抗原，制备其抗体l 和抗体2，并分别与DNA片段3和4结合形成抗体-DNA复合探针1+3和2+4。
(2) 将来源A和B中的蛋白质分别与上述抗体-DNA复合探针反应，形成抗原抗 体-DNA复合物5和6。
(3) 在含有5和6的溶液中分别加入来源特异性DNA单链7和8，并分别加入邻 位连接DNA单链9和10，在连接酶ll的作用下，进行来源特异性邻位连接反应，分 别形成连接产物12和13。
(4) 取等体积的来源特异性连接产物12和13混合，加入一对引物14和15进行 PCR扩增反应，扩增产物中含有DNA片段16和17。
(5) 最后采用焦测序反应测定扩增产物16和17的序列，产生测序图谱，其中峰 18和19分别与来源A和B对应，峰高代表各来源蛋白质的相对表达量。如果有三个(或 多个)来源的抗原，则通过一次测定就可以得出三个(或多个)峰，比较三个(或多个) 峰的相对高度就知道各来源中蛋白质的表达情况。
实施例l :两种不同来源白细胞介素2 (IL-2)的相对含量的测定
1. 实验材料重组人白介素一2 (Peprotech， USA);生物素化抗人白介素一2多抗 (R&D System, USA);马来酰亚胺修饰的链亲和素(Sigma， USA);磁珠(Dynabeads
M-280-strptavidin, Dynal AS, Oslo, Norway );寡聚核苷酸单链(Invitrogen合成，上海) 探针1: 5，-SH- ttttt ttatg tggtc tatgt cgtcg ttcgc tagta gttcc tgggc tgcac陽3 ，；探针2: 5， -P- tcgag gcgta gaatt ccccc gatgc gcgct gttct tactc atttt t-SH-3 ，；序歹!j标签5， -P-agt tgc cat ctg tcg atc-3，， 5， -P-agt tgc cat ctg tea ctg-3 ，；连接单链5，隱acgcc tcgac agtga cagat ggcaa ctgtg cagcc cttt-3 ， ， 5，-acgcc tcgag atcga cagat ggcaa ctgtg cagcc cttt-3 ，；扩增弓I物5 ， -Bio-atgtg gtcta tgtcg tegtt cg隱3，， 5'-tgagt aagaa cagcg cgcat-3，；退火弓l物5'-ggggg aattc tacgc ctcga隱3'。
2. 实验步骤
(1) 链亲和素-DNA探针的制备
首先，将马来酰亚胺修饰的链亲和素(0.5 nmol)分别与DNA探针1和2 (2nmol) 室温下反应2小时，反应缓冲液为50|il含5mM EDTA的PBS溶液。为了除去其中的 游离DNA，在反应液中加入等体积的饱和硫酸胺溶液，65'C放置2小时，室温13,000 Xg离心30分钟，除去上清液，沉淀溶于含5nM EDTA的PBS溶液中，重复该步骤2 次。为了除去溶液中的游离链亲和素，向上步溶液中加入十分之一体积的3M NaAc (pH4.6)，十分之一体积的10mMMg(Ac)2，两倍体积的95%的冷乙醇，室温反应2小 时，4'C 13,000Xg离心30分钟，除上清，沉淀溶于50^11的10mMTris-HCl (pH7.4)， 4'C保存。
(2) 邻位探针的制备
生物素化抗人白介素2多抗(50nM)与纯化后的链亲和素DNA链(50nM)按l: 1的比例在室温下反应1小时，反应buffer为含0.1% BSA的PBSE (5nM EDTA)。反
应后的邻位探针4i:保存。
(3) 邻位连接反应与焦测序。
将lpl不同来源的IL-2溶液分别与50nM邻位探针对混合，37'C反应1小时。反应 体系为lOpl，反应缓冲液为含1% BSA， lmM生物素，16 ng/ml polyA， 0.05%吐温
20的PBS溶液。向不同来源的IL-2溶液体系中分别加入代表两种来源的序列标签 (O.lmM)及其相应的连接单链(O.lmM)， T4连接酶(5U)， Tris-HCl (pH7.5) (lmM)， KCl(5mM)， 2-巯基乙醇(lmM)， EDTA (O.OlmM)和甘油(5%)。反应总体积为120^1， 在3(TC条件下保持15分钟。
将两个来源的连接反应产物等体积混合。取混合的连接产物25^1进行预扩增，扩 增体系为扩增引物(200nM) ， Tris-HCl(pH8.3 ) (1 OmM) ， KC1 (50mM )， MgC12 (1.5mM)， dNTP (0.2mM) rTaq酶(1.25U)，循环条件为95°C 2min; 95°C 30sec; 60°C lmin; 13个循环次数。将预扩增产物用TE Buffer稀释50倍，作为下步扩增用模板。第二步 扩增体系与扩增循环条件均不变，只将循环次数提高到35。
利用表面修饰有链亲和素的磁珠，将扩增产物制成单链，并与退火引物退火后，对 单链进行焦测序。
3.实验结果
图2是上述两来源IL2的焦测序结果。图中峰20和21分别代表两来源IL的相对 含量，其峰高或峰面积的比值就代表IL2在两来源中的相对浓度差异。峰22和23为焦 测序中的背景信号，可以从测定结果中扣除。在本例中，由于两个来源的IL2含量相等， 测定结果也表明IL-2在两来源含量比接近1:1。
实施例2 :将来源特异性序列直接标记在与抗体蛋白质相连的DNA分子上进行蛋 白质含量差异的测定
在本实施例中，将图1中DNA单链7和8中代表来源特异性碱基序列分别标记在 DNA序列3或4中，即抗原抗体反应后形成的抗原抗体-DNA复合物5和6中的DNA 序列不同，含有来源特异性序列。进行来源特异性邻位连接反应时，只需加入与3和4 中的序列互补的邻位连接DNA单链9进行连接反应。其余步骤与图1 一致。
该实施例需要对同一种抗体分别标记序列不同的DNA，以区别不同来源的蛋白质。 测定步骤同实施例l，由于两个来源的IL2含量相等，测定结果也表明IL-2在两来源含 量比接近1:1。
实施例3 :加入第三种抗体降低反应背景信号提高测定灵敏度的方法 在本实施例中，制备至少3种抗体-DNA复合探针，抗体为同一种蛋白质的抗体。 如图3所示，除图l中的抗体l， 2外，还要增加一种抗体24，并将含有来源特异性序 列的邻位连接DNA单链(9)与抗体24连在一起，只有当三种抗体全部与待测蛋白质 发生抗原抗体反应后，在连接酶11的作用下发生连接反应。这样使得连接反应的特异
性提高，背景减低。
实施例4 :三种不同来源白细胞介素2 (IL-2)的相对含量的测定 在本实施例中，利用实施例1相同的方法测定三种不同来源白细胞介素2 (IL-2)的 相对含量，实验方法同实施例l，区别就是再设计一组来源特异性DNA单链(如图l中的 7)和邻位连接DNA单链(如图1中的7)，在连接酶ll的作用下，与第三个来源的抗原蛋 白进行来源特异性邻位连接反应。结果就分别形成连接产物三种连接产物，然后将三种 连接产物等量混合，按照实施例l的方法测定序列，结果如图4所示。图中峰25， 26和27 分别代表三个来源IL的相对含量，其峰高或峰面积的比值就代表IL2在三来源中的相对 浓度差异。 序歹IJ 表
<110>周国华
〈120〉 一种用于蛋白质含量差异测定的方法 <160> 9
〈210〉 1
<211> 50
〈212〉 DNA <213〉人工序列 〈220〉
〈223〉探针
〈400〉 1
tttttttatg tggtctatgt cgtcgttcgc tagtagttcc tgggctgcac 50
<210〉 2 〈211〉 46 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>
〈223〉探针 〈400〉 2
tcgaggcgta gaattccccc gatgcgcgct gttcttactc attttt 46
〈210〉 3 〈211〉 18 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉
〈223>序列标签
〈400〉 3
agttgccatc tgtcgatc 18
<210> 4 〈211〉 18 〈212> DNA <213〉人工序列 〈220〉
<223>序列标签 〈400〉 4
agttgccatc tgtcactg 18
〈210〉 5 〈211〉 39 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223>连接单链 <400〉 5
acgcctcgac agtgacagat ggcaactgtg cagcccttt 39
〈210〉 6 〈211〉 39 〈212>腿 <213>人工序列 〈220〉
〈223〉连接单链 〈400> 6
acgcctcgag atcgacagat ggcaactgtg cagcccttt 39
<210〉 7 〈211> 22 〈212>廳 <213>人工序列 <220〉
〈223〉扩增引物 <400> 7
atgtggtcta tgtcgtcgtt eg 22
〈210> 8 <211> 20 <212>腿 <213〉人工序列 〈220>
〈223〉扩增引物 〈400〉 8
tgagtaagaa cagcgcgcat 20
〈210〉 9
〈211〉 20
<212> DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉退火引物
〈400> 9
gggggaattc tacgcctcga 20
权利要求
1、一种用于蛋白质含量差异测定的方法，其特征在于包括下列步骤a. 将多种分别结合有不同寡核苷酸序列的蛋白质抗体同时与一种待测蛋白质抗原发生抗原抗体反应；b. 在连接酶的作用下，通过连接反应将步骤a中抗原抗体复合物中的寡核苷酸序列连接在一起，并使连接产物序列中含有一段代表待测蛋白质来源的碱基序列；c. 以步骤b中的连接产物为模板，采用扩增反应扩增一段含有待测蛋白质来源特异性的碱基序列；d. 采用实时测序技术测定步骤c中扩增产物序列中的代表待测蛋白质来源的碱基序列；e. 以步骤d中测得的序列作为待测蛋白质的来源，比较各序列的信号强度就得到待测蛋白质在各来源中的相对含量。
2、 根据权利要求1所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于抗体是指以待测 蛋白质为抗原制备的单克隆或多克隆抗体蛋白质。
3、 根据权利要求1所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于抗原抗体反应是 指一种抗原同时与该抗原的两种或两种以上的抗体发生的反应。
4、 根据权利要求1所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于多种分别结合有 不同寡核苷酸序列的蛋白质是指不同序列的寡核苷酸(DNA)序列的5'端或3'端通过 物理或化学的方法与蛋白质结合，形成DNA-蛋白质复合探针。
5、 根据权利要求1所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于一段代表待测蛋 白质来源的碱基序列是指标记在抗体蛋白质分子上的寡核苷酸序列中的一段DNA序 列。
6、 根据权利要求1所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于一段代表待测蛋 白质来源的碱基序列是指在连接反应过程中加入的一段DNA序列。
7、 根据权利要求1所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于扩增反应是指滚 环扩增技术(RCA),聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)。
8、 根据权利要求1所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于实时测序技术是 指基于生物发光反应的焦测序技术。
9、如权利要求3所述的蛋白质含量差异测定方法，其特征在于两种或两种以上的 抗体是指其中至少一种抗体表面结合的寡核苷酸序列的5'端为游离端，并且至少一种抗 体表面结合的寡核苷酸序列的3'端为游离端。
全文摘要
本发明公开了一种用于蛋白质含量差异测定的方法。该方法为a.将多种分别结合有不同寡核苷酸序列的蛋白质抗体同时与一种待测蛋白质抗原发生抗原抗体反应；b.利用连接酶通过连接反应将步骤a中抗原抗体复合物中寡核苷酸序列连接在一起，并使连接产物序列中含有一段代表待测蛋白质来源的碱基序列；c.以步骤b中的连接产物为模板，采用扩增反应扩增一段含有待测蛋白质来源特异性的碱基序列；d.采用实时测序技术测定步骤c中扩增产物序列中的代表待测蛋白质来源的碱基序列；e.以步骤d中测得的序列作为待测蛋白质的来源，比较各序列信号强度即得待测蛋白质在各来源中相对含量。该方法可一次同时测定多个不同来源蛋白质表达量差异，成本低。
文档编号G01N33/577GK101382552SQ20071013098
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月5日 优先权日2007年9月5日
发明者周国华 申请人:周国华