强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量分子标记及qtl定位的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体设及一种强冬性白菜型冬油菜 可溶性蛋白含量WL位点，同时还设及与强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量WL位点连 锁的分子标记。
【背景技术】
[0002] 白菜型油菜在我国栽培历史悠久，具有抗寒、早熟、耐瘡薄等特性，是我国重要的 油料作物之一。但白菜型油菜W春性为主，强冬性白菜型冬油菜种质缺乏，尤其是适宜北方 旱寒区种植的强冬性冬油菜品种缺乏。我国北方气候严寒，冬油菜具备优异的抗寒性才能 安全越冬，因此抗寒育种是是北方冬油菜发展的关键。采用常规育种方法选育抗寒材料费 时费力，且选择效率较低，如果借助分子标记辅助育种，可W在苗期进行淘汰，不仅节约生 产成本而且大大提高选择效率。
[0003] 可溶性蛋白是重要的渗透调节物质和营养物质，他们的增加和积累能提高细胞的 保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用，因此经常用作筛选抗性的指标之一。 关于可溶性蛋白含量及变化规律的研究很多，并研究认为其符合数量性状的遗传特点。但 对控制其合成的相关基因的研究较少。近年白菜型冬油菜中可溶性蛋白含量及变化规律的 研究甚多，但对其分子标记及Q化定位的研究尚未见报道。本研究通过Q化定位，旨在筛选 出可溶性蛋白含量的WL位点和分子标记，用于可溶性蛋白基因的克隆和冬油菜抗寒育种 的分子标记辅助选择。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供了 1个强冬性白菜 型冬油菜可溶性蛋白含量的Q化位点，该位点的效应值都比较高，对白菜型冬油菜可溶性 蛋白含量调控起着重要作用，可用作定位克隆和分子标记辅助选择。
[0005] 本发明还提供2个强冬性白菜型冬油菜油可溶性蛋白含量的WL位点连锁的分子 标记。该些标记与Q化位点的遗传距离较近且是基于PCR技术的SSR和InDel标记，因而 可靠且使用方便，将对强冬性白菜型冬油菜抗寒育种提供便利。
[0006] 为解决本发明的技术问题采用如下技术方案； 强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量分子标记及QTL位点，其筛选包括有W下步骤： (1)构建分离群体；利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'晚油7号'和强 抗寒冬油菜'晚油9号'配置杂交组合，杂交F1代自交产生巧代分离群体。本发明用到 的实验材料由甘肃农业大学油菜遗传育种课题组提供。
[0007] (2)油菜叶片DNA提取；采用CTAB法提取亲本'晚油7号'和'晚油9号'及巧 代分离群体的叶片DNA。
[0008] (3)引物来源及合成；由上海生物工程技术有限公司合成315对引物，引物来源 于WWW.UKcrop, net发表的油菜微卫星引物序列W及化assica Dat油ase网站ht化：// brassica化.org/上公布的10个染色体上的所有引物，其中SSR引物51对，InDel引物264 对。
[0009] (4)多态性引物筛选；利用合成的引物对两亲本DNA进行PCR扩增，筛选出具有多 态性的引物，该过程设及PCR扩增、聚丙締酷胺凝胶电泳、银染、照相等步骤。
[0010] (5)多态性引物在巧代检测；将筛选出的多态性引物在巧代中进行检测，获得基 因型数据，该过程与（4 )步骤基本相同。
[0011] (6)遗传连锁图构建及giL定位；根据巧代基因型数据，利用QTLIciMapping V3. 3软件进行遗传连锁图构建及WL定位。
[0012] 通过筛选步骤获得了强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量的1个9化位点，命名 为；Qsol.gsau-8A，与1个强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量的WL位点连锁的2个分子 标记，分别是；BrID10839和Ra2-E12, 2个分子标记的序列分别如下。
[0013]BrID10839-F；AGGAACAATACCCATTTGTG BrID10839-R；GGTGTTTGTGTGTTCGGTA Ra2-E12-F；TGTCAGTGTGTCCACTTCGC Ra2-E12-R；AAGAGAAACCCAATAAAGTAGAACC〇
[0014]Qsol.gsau-8A位于8A染色体上，与分子标记化ID10839和Ra2-E12连锁，可解释 12. 4599%的表型变异，加性效应为10. 6371，显性效应-11. 9857。
[0015] 本发明的有益效果；本发明首次定位得到1个强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含 量WL位点，并给出与强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量WL位点连锁的2个分子标记， 分别解释19. 1302%、21. 9624%和12. 4599%的表型变异。在常规抗寒育种中，试验材料需通 过越冬来判断其抗寒性的强弱，费时费力。通过检测可溶性蛋白含量WL位点，在苗期就 可W筛选材料，大大提高了筛选效率，节约生产成本，加快育种进程。同时可溶性蛋白含量 Q化位点的获得，可进一步进行可溶性蛋白基因的克隆，为强冬性白菜型冬油菜抗寒机理的 探索提供技术支撑。
【附图说明】
[001引图1为本发明强冬性超强抗寒冬油菜'晚油7号'和强抗寒冬油菜'晚油9号'杂 交巧代群体可溶性蛋白含量分布图； 图2为本发明利用两亲本筛选多态性引物； 图3为本发明多态性引物8C0419-1在巧代中的检测结果； 图4为本发明Qsol.gsau-2A-l和Qsol.gsau-2A-2位点在2A染色体的位置及L0D曲 线示意图； 图5为本发明Qsol.gsau-8A位点在8A染色体的位置及L0D曲线示意图。
【具体实施方式】
[0017] W下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0018] 实施例1;强冬性白菜型冬油菜分离群体的构建及可溶性蛋白含量测定。
[0019] 本实施例中使用的分离群体具体构建如下： (1)2010年8月利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'晚油7号'和强抗 寒冬油菜'晚油9号'配置杂交组合，2011年5月收获F1代种子。
[0020] (2)2011年8月播种F1种子，2012年4月套袋自交，获得巧代种子。
[0021] 2012年8月播种巧代种子。待苗期随机选取103株挂牌标记，于11月初采集新 鲜幼叶，用冰盒带回实验室并保存于-7〇°C超低温冰箱。采用考马斯亮藍G-250法测定可 溶性蛋白含量。结果表明；巧代可溶性蛋白含量呈正态分布，证明可溶性蛋白性状属于数 量性状（图1)。
[002引实施例2;亲本和巧代分离群体叶片总DNA的提取。
[0023] 采用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下； (1)采摘健康幼叶作为提取油菜基因组DNA的材料，用蒸馈水洗净，用纸吸干。
[0024] (2)取新鲜的叶片0.5g左右置于研鉢中，加入液氮，迅速研磨至发白粉末状后立 即装入2ml离屯、管。
[0025] (3)加入已预热的2XCTAB提取缓冲液700ul浸透粉末并倒转离屯、管，使粉末充分 散开，于65°C水浴60min，其间轻柔混合2-3次。
[0026] (4)取出离屯、管，冷却至室温，加入700ul的氯仿/异戊醇（24/1)，轻缓颠倒混匀， 静置10min。
[0027] (5) 13000巧m离屯、lOmin。
[0028](6)取上清600ul转移至新离屯、管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1)，轻缓颠 倒混匀，室温放置lOmin。
[0029] (7) 1300化pm离屯、lOmin，取上清400ul转移至新离屯、管中，加等体积已预冷的异 丙醇，保存于-20°C，静置20min。
[0030] (8)13000巧m离屯、lOmin，将离屯、管倒置于吸水纸上，控干上清，用600ul70%的己 醇洗漆沉淀2次，室温下微干。加入300ul去离子水溶解沉淀。
[0031] (9)加入lulRNase(lOmg/ml)置于37°C水浴60min,每个离屯、管加300ul去离 子水，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。
[0032] (10)吸取上清400ul转入新离屯、管，加入上清体积1/10的3mol/LNaAC溶液，2. 5 倍体积的预冷无水己醇沉淀DNA，置于-20°C，20min左右，12000巧m离屯、lOmin，弃上清。
[0033] (