11)用600ul70%的己醇洗漆沉淀2次，通风干燥或者自然干燥。
[0034] (12)加入30ulTE缓冲液溶解DNA，4°C保存备用。（-20°C长期保存） 实施例3;SSR和InDel引物来源、合成及多态性筛选。
[00；3日](1)从WWW.UKcrop, net发表的油菜微卫星引物序列W及化assica Dat油ase网 站ht化://brassica化.org/上公布的10个染色体上的所有引物中均匀选取315对。其中 SSR引物51对，InDel引物264对。引物均由上海生物工程技术有限公司合成。
[0036] (2)从亲本中各随机选取6株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。
[0037](3)PCR反应体系 PCR反应体系为lOul; MixTaq酶 6ul 上引物 0. 5ul 下引物 0. 5ul d地20 2ul 模板： lul (4)PCR扩增程序；94°C预变性4min;94°C变性50s，55-60°C复性50s(每个循环的退 火温度降低或升高0.5°〇,721：延伸503,35个循环；721：延伸10111111;取出？〇?产物41：保 存。
[003引 （5)聚丙締酷胺凝胶电泳 PCR扩增产物在8%的聚丙締酷胺凝胶上电泳，具体操作如下：a用d地20充分洗漆玻璃板、样品梳和橡胶套，置于支架上惊干。
[0039]b惊干后，将两块玻璃板对齐扣到一起，装进橡胶套中，并用1%的琼脂糖胶封口， 静置30min。
[0040]C将两对封好的玻璃板小屯、装到电泳槽上。
[0041]d配置50ml的丙締酷胺凝胶溶液：将30%丙締酷胺13. 3ml，蒸馈水31ml，10XTBE 5ml，10%过硫酸锭10. 7ml和TEMED3. 5ul迅速加入100ml小烧杯中，用玻璃椿揽拌均匀。
[0042]e将上述配好的丙締酷胺凝胶溶液沿玻璃凹板上部缓缓灌入两块玻璃板间，两对 玻璃板胶灌好后，插入梳子，静置比左右。
[004引 f用移液枪在梳子周围加入少许1XTBE缓冲液，轻轻拔出梳子，在电泳槽中灌满 1XT邸电极缓冲液。
[0044]g每个点样孔加入PCR产物2-3ul。连接电源，在电压200V，电流100mA电泳比左 右。
[0045]h关闭电源，回收电极缓冲液，取下玻璃板，擦开玻璃板取出凝胶，用d地20冲洗数 次准备银染。
[0046] (7)银染过程 a固定；在装有凝胶的胶盒中倒入300ml固定液，在脱色摇床上轻摇8min，回收固定液。
[0047]b染色；向胶盒中加入300ml染色液，在脱色摇床上轻摇10-15min，回收染色液，用 d地20冲洗两遍。
[0048]C显影；向胶盒中加入300ml显色液，在脱色摇床上轻摇至条带清晰，倒出显色液， 用d地20冲洗两遍。
[0049]d照相；将凝胶置于胶片观察灯上照相。
[0050] 银染过程中所需试剂配制： 固定液：100ml无水己醇，5ml冰醋酸，用d地20定容至1L。
[005U染色液；2gAgN03,100ml无水己醇，5ml冰醋酸，用d地20定容至1L。
[005引显影液；300ml3%Na0H溶液中加入1. 5ml甲醒(现用现配)。
[0053] (7)多态性引物筛选 根据电泳结果，筛选出39对在"晚油7号"和"晚油9号"之间扩增重复稳定，条带清 晰，具有多态性的引物。
[0054] 实施例4;多态性引物在巧代中的分布、遗传连锁图构建及giL分析。
[005引（1)将实施例3得到的39对多态性引物对巧群体103个单株的DNA分别进行PCR扩增，聚丙締凝胶电泳后银染照相和带型判读，与亲本"晚油7号"相同带型记为"A"，与亲 本"晚油9号"相同带型记为"B"，杂合体记为"H"，缺失的带型记为
[0056] (2)统计带型结果，采用QTLIciMappingV3. 3软件计算引物之间的遗传距离，并 构建遗传连锁图和Q化分析。筛选出的39对引物分别分布在白菜型油菜10个染色体上。 对可溶性蛋白含量进行9化分析，共检测到3个控制可溶性蛋白含量的9化，分别位于染色 体2A和8A上，其中； 有2个位于2A染色体上（图4)，分别命名为Qsol.gsau-2A-l和Qsol.gsau-2A-2,定位 区间分别位于rID90127~BrID10421 和化ID10709~BrID101165 之间。Qsol.gsau-2A-l可 解释的表型变异为19. 1302%，Qsol.gsau-2A-2可解释的表型变异为21. 9624%。
[0057] 在8A染色体上，检测到1个控制可溶性蛋白含量的QTL(图5)，命名为Qsol. gsau-8A，定位区间位于化ID10839~Ra2-E12之间。Qsol.gsau-8A可解释的表型变异为 12.4599%〇
[0058] 表1与强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量连锁9化位点连锁的分子标记
W上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和原则 之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量分子标记及QTL位点，其特征在于：通过筛选 步骤获得了强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量的1个QTL位点，命名为：Qsol. gsau-8A， 与1个强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量的QTL位点连锁的2个分子标记，分别是： BrID10839 和 Ra2-E12。2. 根据权利要求1所述的强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量分子标记及QTL位点， 其特征在于：Qsol. gsau-8A位于8A染色体上，与分子标记fcID10839和Ra2-E12连锁，可 解释12. 4599%的表型变异，加性效应为10. 6371，显性效应-11. 9857。3. 根据权利要求1所述的强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量分子标记及QTL位点， 其特征在于：2个分子标记的序列分别如下： BrID10839-F ：AGGAACAATACCCATTTGTG BrID10839-R ：GGTGTTTGTGTGTTCGGTA Ra2-E12-F ：TGTCAGTGTGTCCACTTCGC Ra2-E12-R ：AAGAGAAACCCAATAAAGTAGAACC 〇4. 根据权利要求1或3所述的强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量分子标记及QTL位 点，其特征在于筛选包括有以下步骤： (1) 构建分离群体：利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜陇油7号和强抗 寒冬油菜陇油9号配置杂交组合，杂交Fl代自交产生F2代分离群体； (2) 油菜叶片DNA提取：采用CTAB法提取亲本陇油7号和陇油9号及F2代分离群体 的叶片DNA ; (3) 引物来源及合成：315对引物，其中SSR引物51对，InDel引物264对； (4) 多态性引物筛选：利用合成的引物对两亲本DNA进行PCR扩增，筛选出具有多态性 的引物； (5) 多态性引物在F2代检测：将筛选出的多态性引物在F2代中进行检测，获得基因型 数据； (6) 遗传连锁图构建及QTL定位：根据F2代基因型数据，利用QTL IciMapping V3. 3软 件进行遗传连锁图构建及QTL定位。
【专利摘要】本发明公开了强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量分子标记及QTL位点，其筛选步骤包括：（1）利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜‘陇油7号’和强抗寒冬油菜‘陇油9号’杂交构建F2代分离群体；（2）采用CTAB法提取两亲本及F2代分离群体的叶片DNA；（3）利用SSR和InDel引物对两亲本DNA进行多态性引物筛选；（4）通过F2分离群体获得基因型数据构建遗传连锁图和QTL分析；（5）获得了2个强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量的QTL位点，命名为Qsol.gsau-8A；2个与强冬性白菜型冬油菜可溶性蛋白含量的QTL位点连锁的分子标记BrID10839和Ra2-E12。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104988138
【申请号】CN201510211289
【发明人】孙万仓, 方彦, 杨刚, 刘自刚, 曾秀存, 武军艳, 李学才, 孔德晶, 王凯音, 马骊
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年4月29日