一种改良ctab法提取头花蓼dna的制作方法
【技术领域】
[000。 本发明设及一种DNA提取方法，尤其设及一种改良CTAB法提取头花寥DNA。
【背景技术】
[0002] 目前，对头花寥的研究主要在其化学成分及药理作用、临床应用、显微鉴别和栽培 技术等方面。不同研究小组对不同产地野生与栽培头花寥中的总黄酬含量进行比较发现存 在一定的差异，提示生长环境对药材质量有影响。近几年随着头花寥在市场价值中的提高， 对头花寥分子生物学方面的研究也逐渐进入热点阶段。随着人们对药品质量的关注，为保 证中药药品质量，利用现代分子生物学DNA条形码技术对贵州道地苗药头花寥进行鉴定、 分析研究是目前研究的热点。
[0003] 但目前传统的头花寥DNA提取方法仍然存在如下问题；提取过程复杂、成本高昂、 周期长、纯度低，导致引物不具有标准性等问题。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、成本低廉、周期短，提取的头花 寥DNA纯度更高的头花寥DNA提取方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种改良CTAB法提取头花寥DNA，包 括如下步骤： 取材料，用液氮研成粉末，移入离屯、管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀，并进行水浴、 离屯、； 取上清液，加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离屯、管中，再次取上清液用 氯仿、异戊醇抽提； 将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离屯、，弃去上清液，用70%己醇洗漆沉淀、离 屯、，用小枪头吸干己醇，风干； 去除沉淀中的己醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解； 分别用等体积的苯酪、氯仿、异戊醇，各抽提一次； 将上清加入NaAc、冰冷无水己醇，轻轻混匀、离屯、，沉淀用70%己醇溶液洗漆，风干，加TE液溶解，低温保存。
[0007] 在上述技术方案的基础上，本发明还可W做如下改进 进一步，所述取材料，用液氮研成粉末，移入离屯、管，加入CTAB提取缓冲液，充分摇匀， 并进行水浴、离屯、步骤的具体实现如下： 称取121.IgTris，溶于800ml水中，加入浓盐酸并在不断揽拌条件下，调节抑值至 8. 0,加入双蒸水至总体积为比，分装并高压灭菌后4°C保存； 称取186. 1班DTA-Na2? &0,加入900ml双蒸水，磁力揽拌器上揽拌，加入化0H调节抑 值至8. 0,加双蒸水定容至1L; 称取4gCTAB，加100ml双蒸水溶解，再加20ml/LTris-肥1 (p服.0)，8ml， 0. 5mol/L邸TA(P服.0)，56ml5mol/LNaCl，加双蒸馈水至 200ml，室内保存； 取头花寥幼嫩叶片，-7〇°C的低温冰箱中保存备用，取冷冻头花寥材料2g，立即放入冰 冻过的研鉢中，迅速在叶片上均匀撒上40-50mg的DIECA晶体，加入液氮后，快速研磨成粉 末状； 将粉末快速移入1. 5ml离屯、管，加入600y1 65°C预热的CTAB提取缓冲液，充分摇匀， 65°C水浴60min，期间混匀10-15次。
[0008] 进一步，所述取上清液，加入等体积的氯仿、异戊醇，取上清转移至另一离屯、管 中，再次取上清液用氯仿、异戊醇抽提步骤的具体实现如下： 取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇，其中氯仿、异戊醇体积比为24:1，颠倒混匀 10-15次，取上清转移至1. 5ml离屯、管中，再次取上清液用氯仿；异戊醇抽提1次，其中氯 仿、异戊醇体积比为24:1。
[0009] 进一步，所述将上清加入NaAc、异丙醇，轻轻颠倒混匀、离屯、5min，弃去上清液，用 70%己醇洗漆沉淀、离屯、，用小枪头吸干己醇，风干步骤的具体实现如下： 称取24. 608g无水醋酸钢，加入双蒸水70ml加热至50-80°C溶解，再加入双蒸水定容至 100ml，高压灭菌20min，保存于4°C冰箱中备用； 将上清加入1/10体积3mol/LNaAc和2/3体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，12000巧m/min， 离屯、5min，弃去上清液，用70%己醇洗漆沉淀1次，12000巧m/min离屯、Imin,用小枪头吸干 己醇，风干。
[0010] 进一步，所述去除沉淀中的己醇，用含RNA酶的TE溶解、消化至RNA完全裂解步骤 的具体实现如下； 去除沉淀中的己醇，用700y1含RNA酶（20yg/ml)的TE溶解，37°C消化化W裂解 RNAo
[0011] 进一步，所述分别用等体积的苯酪、氯仿、异戊醇，各抽提一次步骤的具体实现如 下： 分别用等体积的苯酪；氯仿；异戊醇，氯仿；异戊醇，在4°C，12000rpm/min，5min条件下 各抽提一次，其中苯酪、氯仿、异戊醇体积比为25 ;24 ;1，氯仿、异戊醇体积比为24 ;1。
[0012] 进一步，所述将上清加入NaAc、冰冷无水己醇，轻轻混匀、离屯、，沉淀用70%己醇溶 液洗漆，风干，加TE液溶解，低温保存步骤的具体实现如下： 将上清加入1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积的-20°C--70°C无水己醇，轻轻混匀； 在4°C，12000巧m/min，离屯、5min条件下，将沉淀用70%己醇溶液洗漆2次，风干，加 lOOylTE液溶解，低温保存。
[0013] 本发明的有益效果是： 1. 改良CTAB法简单、成本低廉、提取周期短； 2. 改良CTAB法可有效提取头花寥DNA，A260/A280比值区间在1. 1-2. 0,比较传统的SDS法、CTAB法具有更高的提取纯度； 3. 测序结果表明，rbcL序列长度在979-985bp之间，rDNAITS序列长度为 661-666bp； 4. 序列比对和聚类分析结果表明，目的序列具有高度同源性； 5.测序结果提交NCBI获得GenBank序列号。
【附图说明】
[0014] 图1本发明rbcL序列PCR扩增产物电泳图谱； 图2本发明ITS序列PCR扩增产物电泳图谱。
[0015]
【具体实施方式】
[0016] W下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0017] 实施例； 分别取不同来源的头花寥幼嫩叶片（见表1)，-70°C的低温冰箱中保存备用，取冷冻头 花寥材料2g，立即放入冰冻过的研鉢中，迅速在叶片上均匀撒上40-50mg的DIECA晶体， 加入液氮后，快速研磨成粉末状；将粉末快速移入1. 5ml离屯、管，加入600y1 65°C预热的 CTAB提取缓冲液，充分摇匀，65°C水浴60min，期间混匀10-15次。取上清液，加入等体 积的氯仿：异戊醇（24:1，V/V)，颠倒混匀10-15次，取上清转移至另一 1.5ml离屯、管中，再 次取上清液用氯仿；异戊醇（24:1，V/V)抽提1次。称取24. 608g无水醋酸钢，加入双蒸水 70ml加热至50-80°C溶解，再加入双蒸水定容至100ml，高压灭菌20min，保存于4°C冰箱中 备用；将上清加入1/10体积3mol/LNaAc和2/3体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，12000巧m/ min,离屯、5min，弃去上清液，用70%己醇洗漆沉淀1次，12000巧m/min离屯、Imin,用小枪头 吸干己醇，风干。去除沉淀中的己醇，用700y1含RNA酶（20yg/ml)的TE溶解，37°C消 化化W裂解RNA。分别用等体积的苯酪；氯仿；异戊醇（25 ;24 ;1，，V/V/V)，氯仿；异戊醇 (24 ;1,V/V)，在4°C，12000;rpm/min，5min条件下各抽提一次。将上清加入1/10体积3mol/ LNaAc和