专利名称：头花蓼总黄酮、总鞣质和没食子酸类化合物的制备方法
技术领域：
本发明属于天然药物有效成分提取领域。
背景技术：
头花寥(Polygonum c即itat咖)又名石莽草、四季红、红酸杆、省丁草等，属于寥科 (Polygonaceae)蓼属(Polygonum)多年生草本植物，是贵州省民间常用草药，主要用于泌 尿系统感染、泌尿系结石等症的治疗。 目前，头花寥已成为贵州省"六大苗药"和重点培育发展的的品种之一，以头花寥 为主要原料并被国家标准收载的已有多种药物制剂，并有多个相关专利(见表l)，但是，头 花寥相关产品多是水提物和醇提物，其所含成分复杂、往往多种成分共存，但确切的活性部 位尚无明确报道，因而其相关药物的质量控制也缺乏充分依据。上述诸多专利依据各种分 光光度法的检测结果将某种活性归为其中的一类(个)成分的单独或多类(个)成分的 协同作用，但由于缺乏获得各类化合物的有效手段，所得结论缺乏说服力。王祥培等曾用 60%丙酮浸泡头花寥药材，并分别用乙醚和乙酸乙酯萃取得到总鞣质，并研究了其抗炎活 性[王祥培.头花寥的鉴别与质量评价研究(D)，成都中医药大学博士学位论文，2006，第三 部分36-43]，但60%丙酮浸泡可能会将黄酮类成分一起提取出来，乙醚和乙酸乙酯萃取 也并不能将黄酮分开并得到所有鞣质，因此这种样品制备方法实际有很多不合理之处。本 发明正是依据没食子酸类化合物、黄酮类化合物和鞣质类化合物的结构特点及理化性质， 利用多种检测手段，找到了一种有效地富集纯化头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合 物的方法，为寻找头花寥有效部位提供了一种科学的样品制备方法。
表1与头花寥相关的专利
3公开号CN1679757A
CN1570134A
CN1483466 A
CN1481382 A
C讓091749ACN101028336A
申请曰期20050113
20030711
20030711
20020912
2006062220060227
发明名称热淋清软胶囊
头花蓼及其提取物和制品微生物活性测定方法
头花蓼提取物及其药物组合制剂
头花蓼提取物及其制备方法和用途
头花蓼药材、提取物及其质量控制方法一种头花蓼和独一味的药物组合物
发明者胡宏 '梁斌王子厚李孟林张丽艳庄镇华荣祖元.张淑华叶晓鸣
梁斌王子厚李孟林张丽艳叶晓鸣唐靖雯
覃启林
梁斌王^厚李孟林张丽艳庄镇华荣祖元张淑华叶晓鸣郑安飘
万德光王祥培黄振华
申请者胡宏
贵州威门药业股份有限公司
贵州威门药业股份有限公司
贵州威门药业股份有限公司
成都中医药大学
黄振华
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效地富集头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的方法，为寻找头花寥有效部位提供了一种科学的样品制备方法。本发明采取的具体技术方案是 (1)将头花寥全草粉末加40-80%乙醇(或甲醇或丙酮)冷浸或回流提取1-4次，滤液合并浓縮； (2)浓縮液或浸膏上DIOI大孔树脂，用70-85%乙醇(或甲醇)洗脱，收集洗脱液回收乙醇(或甲醇)； (3)所得浓縮液或浸膏用水溶解后上MCI柱，水洗脱，直至TLC(氯仿/甲醇/甲酸=9/1/0. 1)检测无没食子酸为止，洗脱液浓縮至一定体积后加乙醇至含醇量达70%以上，抽滤，滤液回收乙醇，浓縮至浸膏得没食子酸类化合物； (4)MCI柱上余下部分再用85%甲醇(或80%乙醇)洗脱至无色，回收甲醇(或乙醇)，浓縮。所得浸膏用95%乙醇溶解后上S印hadex LH-20，先用95%乙醇洗脱至无色，洗脱液回收乙醇，浓縮至浸膏，得黄酮类化合物。洗脱过程中随时取少量洗脱液抽干溶剂后用水溶解，用NaCl-明胶法、浓盐酸法、饱和石灰水法或HPLC法检测确保所得黄酮中没有鞣
质； (5)当浓氨水法检测所得洗脱液中没有黄酮时，用50_100%丙酮梯度洗脱S印hadex LH-20柱上余下部分至无色，洗脱液回收丙酮，浓縮至浸膏得鞣质类化合物。
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本发明的样品制备过程中，依据没食子酸类化合物、黄酮类化合物和鞣质类化合物的化学结构和理化性质，尤其是它们在不同分离介质中的色谱性质，找到了有效地检测总黄酮和总鞣质的简便易行的方法，得到的总黄酮和总鞣质纯度较高，可以用于头花寥相关药理研究、产品开发和提高其相关产品的质量和药效。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例仅用于说明本发明而不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。同时为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。
实施例1 : (1)将8. 5kg头花寥全草粉末加3倍量70%乙醇冷浸3次，每次3天，滤液合并浓縮； (2)浸膏用80X乙醇溶解后上D皿大孔树脂，收集80X乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇，浓縮至浸膏； (3)所得浸膏用水溶解后上MCI柱，水洗脱，直至TLC(氯仿/甲醇/甲酸=9/1/0. 1)检测无没食子酸为止，洗脱液浓縮至一定体积加95%乙醇至含醇量达70%，抽滤，滤液回收乙醇，浓縮至浸膏得没食子酸类化合物； (4)MCI柱上余下部分再用85%甲醇洗脱至无色，回收甲醇，浓縮至浸膏，浸膏用95%乙醇溶解后上S印hadex LH_20，先用95%乙醇洗脱至无色，洗脱液回收乙醇，浓縮至浸膏，得黄酮类化合物。洗脱过程中每100ml收集一瓶，取少量洗脱液抽干溶剂后用水溶解，用NaCl-明胶法(鞣质水溶液遇明胶产生白色沉淀，黄酮不沉淀)，浓盐酸法(往鞣质水溶液中滴加浓盐酸，加热后产生红色沉淀，黄酮无沉淀)，饱和石灰水法(往鞣质水溶液中滴加新配的饱和石灰水，立即产生青灰色沉淀，黄酮无沉淀)检测所得黄酮中是否混有鞣质；
(5)当浓氨水法检测所得洗脱液中没有黄酮时，先用50%丙酮洗脱至无色，再用100%丙酮洗脱至无色，回收丙酮，洗脱液浓縮至浸膏得鞣质类化合物。
实施例2 : (1)将2kg头花寥全草粉末加8倍量70%乙醇回流提取2次，每次2h，滤液合并浓縮； (2)浸膏用80X乙醇溶解后上D皿大孔树脂，收集85X乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇，浓縮至浸膏； (3)所得浸膏用水溶解后上MCI柱，水洗脱，直至TLC(氯仿/甲醇/甲酸=9/1/0. 1)检测无没食子酸为止，洗脱液浓縮至一定体积加95%乙醇至含醇量达75%，抽滤，滤液回收乙醇，浓縮至浸膏得没食子酸类化合物； (4)MCI柱上余下部分部分再用80%乙醇洗脱至无色，回收乙醇，浓縮至浸膏，浸膏用95%乙醇溶解后上S印hadex LH-20，先用95 %乙醇洗脱至无色，洗脱液回收乙醇，浓縮至浸膏，得黄酮类化合物，洗脱过程中每100ml收集一瓶，取少量洗脱液抽干溶剂后用水溶解，用NaCl-明胶法检测所得黄酮中是否混有鞣质；
(5)当浓氨水法检测所得洗脱液中没有黄酮时，S印hadex LH-20柱上余下部分先用丙酮洗脱至无色，再继续用70%丙酮洗脱至无色，回收丙酮，洗脱液浓縮至浸膏得鞣质类化合物。 (6)将所得的总黄酮和总鞣质进行HPLC分析得到如下图谱(附图-1)色谱条件DAD检测器；Diamonsil(TM)钻石C18色谱柱(4. 6 X 250mm， 5 y m) ， (Agilent公司);流动相A为H20 (含0. 1 % H3P04) ， B为甲醇；流速为1. 0 ml/min，梯度洗脱条件为0min时100% A，60min时10% A ;柱温为35°C。实施例3 : (1)将4kg头花寥全草粉末加三倍量70%甲醇冷浸3次，每次3天，滤液合并浓縮； (2)浸膏用85X甲醇溶解后上D皿大孔树脂，收集85X甲醇洗脱液，洗脱液回收甲醇，浓縮至浸膏； (3)所得浸膏用水溶解后上MCI柱，水洗脱，直至TLC(氯仿/甲醇/甲酸=9/1/0. 1)检测无没食子酸为止，洗脱液浓縮至一定体积加；95%乙醇至含醇量达70%，抽滤，滤液回收乙醇，浓縮至浸膏得没食子酸类化合物； (4)MCI柱上余下部分再用85%甲醇洗脱至无色，回收甲醇，浓縮至浸膏，浸膏用95%乙醇溶解后上S印hadex LH_20，先用95%乙醇洗脱至无色，洗脱液回收乙醇，浓縮至浸膏，得黄酮类化合物，洗脱过程中每100ml收集一瓶，取少量洗脱液抽干溶剂后用水溶解，用NaCl-明胶法检测所得黄酮中是否混有鞣质； (5)当浓氨水法检测所得洗脱液中没有黄酮时，S印hadex LH-20柱上余下部分再用70%丙酮洗脱至无色，再继续用100%丙酮洗脱至无色，洗脱液回收丙酮，浓縮至浸膏得鞣质类化合物； (6)将所得的总黄酮、总鞣质及没食子酸类作200 400nm下UV全扫描并与标准品对照，得到如下图谱(附图_2)。仪器型号岛津UV-2401PC ;所用溶剂50%甲醇。这些图谱的吸收曲线表明，所得总黄酮、总鞣质和没食子酸类化合物均相对较纯，其中总鞣质可能既含有可水解鞣质(吸收与没食子酸相似)也有縮合鞣质(吸收与儿茶素相似)。
图-1 :总黄酮和总鞣质在254nm下的HPLC色谱图 图-2 :总黄酮、总鞣质、没食子酸类化合物及对照品在200 400nm下UV全扫描图。
权利要求
头花蓼中总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，其特征在于包含以下步骤(1)将头花蓼全草粉末加3-10倍量40-80％乙醇(或甲醇或丙酮)冷浸或回流提取，滤液合并浓缩；(2)浓缩液或浸膏上D101大孔树脂，用70-85％乙醇(或甲醇)洗脱，收集洗脱液回收乙醇(或甲醇)；(3)所得浓缩液或浸膏用水溶解后上MCI柱，水洗脱直至TLC检测无没食子酸为止，洗脱液浓缩至一定体积后加乙醇至含醇量达70％以上，抽滤，滤液回收乙醇，浓缩至浸膏得没食子酸类化合物；(4)MCI柱上余下部分用85％甲醇(或80％乙醇)洗脱至无色，回收甲醇(或乙醇)，浓缩。所得浸膏用95％乙醇溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，先用95％乙醇洗脱至无色，洗脱液回收乙醇，浓缩至浸膏，得黄酮类化合物。洗脱过程中随时取少量洗脱液抽干溶剂后用水溶解，用NaCl-明胶法、浓盐酸法、饱和石灰水法或HPLC法检测确保所得黄酮中没有鞣质；(5)当浓氨水法检测所得洗脱液中没有黄酮时，用50-100％丙酮洗脱Sephadex LH-20柱上余下部分至无色，洗脱液回收丙酮，浓缩至浸膏得鞣质类化合物，进一步用HPLC法检测所得鞣质中没有黄酮；(6)将所得的总黄酮、总鞣质和没食子酸类物经过UV-2401PC在200-400nm下全扫描并与对照品比较以检测所得组分的纯度。
2. 根据权利要求1所述的头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，其 特征在于第(1)步中用40-80%乙醇(或甲醇或丙酮)同时提取上述三类化合物。
3. 根据权利要求1所述的头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，其 特征在于第(2)步中用70-85%乙醇(或甲醇)洗脱D皿大孔树脂中的样品初步获得此三 类化合物的混合物。
4. 根据权利要求1所述的头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，其 特征在于第(2)步中洗脱液浓縮至一定体积后加乙醇至含醇量达70%以上以沉降多糖或 蛋白而制备没食子酸类化合物。
5. 根据权利要求1所述的头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，其 特征在于第(4)步中样品上S印hadex LH-20后用95%乙醇做洗脱剂来分离富集总黄酮，第 (5)步中用50-100%丙酮做洗脱剂来分离富集总鞣质。
6. 根据权利要求1所述的头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，其 特征在于第(4)步中用NaCl-明胶法、浓盐酸法、饱和石灰水法或HPLC法检测所得黄酮中 是否混有鞣质；第(5)步中用浓氨水法、HPLC法检测所得鞣质中是否混有黄酮。
7. 根据权利要求1所述的头花寥总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，其 特征在于第(6)步中用所得黄酮、鞣质及没食子酸类化合物经过UV-2401PC在200-400nm 下全扫描以检测所得组分的纯度。
全文摘要
本发明涉及一种头花蓼总黄酮和总鞣质及没食子酸类化合物的制备方法，包括步骤将头花蓼40-80％乙醇(或甲醇或丙酮)冷浸或回流提取物上D101大孔树脂，70-85％乙醇(或甲醇)洗脱，洗脱液浓缩后上MCI柱，先用水洗脱，洗脱液浓缩后水溶醇沉，上清液浓缩至浸膏得没食子酸类化合物；再用80％乙醇(或85％甲醇)洗脱，洗脱液浓缩至浸膏，浸膏用95％乙醇溶解后上SephadexLH-20凝胶柱，先用95％乙醇洗脱至无色，洗脱液浓缩至浸膏得总黄酮；柱上残留物用50-100％丙酮洗脱至无色，洗脱液浓缩至浸膏得总鞣质。
文档编号A61P31/00GK101732421SQ20101004180
公开日2010年6月16日 申请日期2010年1月4日 优先权日2010年1月4日
发明者何迅, 兰燕宇, 廖尚高, 张丽娟, 李勇军, 王永林, 王爱民, 詹哲浩, 黄勇 申请人:贵阳医学院